全 文 ：收稿日期:2003-03-04
基金项目:温州市科技局科技发展计划项目(S2002A009)
作者简介:陈贤兴(1958-), 男 ,浙江温州人 , 温州师范学院生物与环境科学系高级实验师。
文章编号:1004-3918(2003)04-0431-03
喜树果内生真菌的分离与鉴定
陈贤兴1 , 　陈析丰1 , 　南旭阳1 , 　何献武2
(1.温州师范学院生物与环境科学系 , 浙江 温州　325027;　2.温州出入境检验检疫局 ,浙江 温州　325027)
摘　要:从喜树(Camptotheca acuminata Decne.)果实中分离 、纯化得到 5 株内生真菌 , 经初步鉴定 ,分别属于半知
菌亚门的匙孢霉属(Mystrosporium Cda.)、鲜壳孢属(Zythia F r.)及无孢类群(Mycelia Sterilia)。其内生真
菌经摇瓶培养后 , 采用薄层层析(TLC)法对其菌丝体提取物进行分析 , 初步表明 WZ001 菌株可能产生喜
树碱(Camptothecin , CPT)的类似物。
关键词:喜树;内生真菌;分离鉴定
中图分类号:Q 939.5　　　文献标识码:A
喜树(Camptotheca acuminata Decne.), 为珙桐科乔木植物 , 是我国南方特有树种。其喜树碱
(Camptothecin ,CPT)具抗癌特性 ,并且是迄今为止发现的唯一专门通过抑制拓扑异构酶 I(Topo I)发挥细胞
毒性的天然植物活性成分[ 1] 。但由于喜树中 CPT 的含量很低 ,不易获取 ,且要大量砍伐喜树 ,会造成资源不
合理利用和物种枯竭 。所以 ,探寻获取 CPT 的新途径 ,成为现今急待解决的问题。
从近年来的研究看 ,植物体中存在内生真菌是普遍的[ 2] 。同时 ,在自然界中植物的内生真菌能产生与
其寄主植物相同或类似的活性物质也不是个别现象 ,如美国人 Strobel等 ,从短叶红豆杉(Taxus brev ifolia)
的树皮中分离出一种能产生紫杉醇的内生真菌[ 3] ;云南大学郭波 、李海燕 、张玲琪等人分别从长春花
(Catharanthus roseus)、桃儿七(Sinopodophyl lum hexandrum)中分别分离出产长春花碱和鬼臼毒素类似物
的内生真菌[ 4 ,5] 。据资料查阅 ,喜树内生真菌的研究还未见有报导。因此 ,开展喜树内生真菌的分离及其代
谢产物的研究 ,将无疑为人类从微生物角度寻找抗癌药物开辟一条新的途径。
1　材料与方法
1.1　材料
喜树的成熟果实 ,2002年 10月上旬采于温州市景山 。
1.2　仪器和药品
CPT 标准样品:成都兴邦生化厂 ,纯度 99.0%
硅胶 GF254:青岛海洋化工有限公司
羧甲基纤维素钠(CMC-Na):中国医药(集团)上海化学试剂公司
WP -95-1型紫外线分析仪:温州奥利生物医学仪器厂
1.3　培养基配制
1.3.1　固体培养基:马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基
马铃薯 200g 、葡萄糖 10g 、蔗糖 10g 、琼脂 20g 、水 1000ml、pH值自然 。
马铃薯洗净 ,去皮 ,切成碎块 ,立即放入水中煮沸 1h ,用 6层纱布过滤 ,加入葡萄糖 、蔗糖和琼脂 ,加水配
制成 1000ml溶液 ,加热搅拌均匀即可 。
1.3.2　液体培养基:
除不加琼脂外 ,制备方法和配方与固体培养基相同 。
1.4　灭菌
固 、液体培养基在 1.05kg/cm2 ,121℃高压蒸汽灭菌 20min 。分装培养皿和三角瓶内备用 。
第 21 卷　第 4 期
2003 年 8 月 　　　　　　　　　　　　
河　南　科　学
HENAN　SCIENCE　　　　　　　　　　　　
Vol.21　No.4
Aug.2003
DOI :10.13537/j.issn.1004-3918.2003.04.015
1.5　内生真菌的分离和纯化
1.5.1　内生真菌的分离
取新鲜 、无虫害的喜树果实 。先用肥皂水刷洗 ,清水冲洗干净后 ,用消毒纸巾吸干水分 。用 75%酒精擦
拭果实表面 ,无菌水冲洗 3-4次 , 0.1%升汞浸泡 10min ,无菌水冲洗 6-7次。
用灭菌解剖刀将果实切成 5-10mm 大小 ,接种到固体培养基上 ,置于 28℃培养箱中避光培养 。
1.5.2　内生真菌的纯化
接种物培养 2-3天后 ,其边缘长出菌丝 ,用接种针挑取边缘生长良好的菌丝 ,分别接种在新的固体培养
基上 ,待新接种的菌丝长成菌落后 ,再挑取其边缘的菌丝培养 ,如此反复纯化 ,得到纯化的菌株 。观察记录菌
落的生长情况及特征 。
1.6　内生真菌的鉴定
根据丝状真菌的鉴定方法 ,采用菌落观察和显微镜装片观察 ,根据其产孢结构 、分生孢子梗着生情况 、孢
子形态与颜色 ,对照相关的分类系统(魏景超 ,1979),确定菌株的种属地位[ 6 ,7] 。
1.7　内生真菌的摇瓶培养
挑取固体培养基上的菌丝 ,接种于盛有 100ml培养液的 250ml三角瓶内 ,在 28℃, 120r/min摇床振荡培
养 6-7天 。观察记录菌丝体和培养液的颜色 。
1.8　内生真菌中 CPT 的提取
液体培养物用 4层纱布过滤 ,滤取的菌丝 ,用蒸馏水冲洗 5-6次 ,冷冻 ,混合石英沙和无水乙醇充分研
磨 ,8000r/min ,离心 8min ,取上清液 ,用等体积的氯仿萃取 3-4次 ,收集有机溶液相 , 45℃低压蒸发浓缩 ,制
备成待测样品溶液。
1.9　内生真菌中 CPT 的测定
薄层层析(TLC)分析:混合硅胶 GF254与 0.4%CMC-Na溶液 ,搅拌成糊状 ,平铺于 2cm ×10cm 玻璃
板上 ,晾干 ,105℃活化 1h ,制成薄层硅胶板备用。标准溶液和各样品溶液分别用毛细吸管在薄层板上点样 ,
以氯仿-丙酮(7∶3 V/V)为展开剂 ,展开后置于波长 254nm 紫外线分析仪下观察荧光 ,计算各种展开点的
Rf值。
2　结果分析
2.1　内生真菌的菌种特征
2.1.1　WZ001菌株:
菌丝褐色 ,有隔 ,多分枝 ,宽 3-4μm 。分生孢子与分生孢子梗都呈深褐色 ,分生孢子梗粗壮。分生孢子
椭圆形 、球形 、匙形或梭形 ,大小 8-10μm ×15-20μm ,顶生或侧生 ,孢子内有砖隔 ,横隔膜厚 ,纵隔膜少 。孢
子壁厚 ,约 0.5-1μm ,平滑 ,折射率高 。在 PDA 上生长较慢 ,菌落厚 ,质地棉絮状 ,中间略微凸起 。刚长出的
菌丝体为浅黄色 ,随着生长逐渐变成灰褐色 ,培养基呈紫红色 ,颜色较一致 。液体培养 ,菌丝球为灰黑色 ,培
养液呈黑色。
2.1.2　WZ002菌株:
菌丝无色 ,有隔 ,分枝 ,宽一般为 1-1.5μm ,最小为 1μm ,最大为 2μm 。在 PDA 上生长较快 ,菌落薄 ,白
色絮状 ,培养基呈黄灰色 ,颜色不一致 ,有许多密集的黑点。液体培养 ,菌丝球为灰黄色 ,并带有黑色小颗粒 ,
培养液为土黄色黏液 。
2.1.3　WZ003菌株:
菌丝褐色 ,有隔 ,多分枝 ,宽 3-6μm 。分生孢子器表生 ,呈不规则球形 ,孢子器壁蜡状肉质 ,具鲜艳的砖
红色。分生孢子表面光滑 ,单细胞无色 ,椭圆形 、梭形或棒状 ,大小 3-5μm×9-11μm 。在 PDA 上 ,菌落薄 ,
地毯状 ,菌丝体为灰绿色 ,培养基呈墨绿色 ,颜色不均一 ,呈辐射状线条由中间向周围扩散。液体培养 ,菌丝
球为深褐色 ,培养液呈棕色。
2.1.4　WZ004菌株:
菌丝深褐色 ,有隔 ,分枝 ,细胞含油状颗粒。菌丝宽一般为 3μm ,最小为 1μm ,最大为 5μm 。在 PDA 上 ,
菌丝为灰黑色 ,围绕菌落中心有一圈菌丝体向上凸起 ,培养基呈均一黑色。液体培养 ,菌丝球为黑色 ,培养液
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呈深褐色 。
2.1.5　WZ005菌株:
菌丝无色 ,有隔 ,分枝 ,宽一般为1-1.5μm ,最小为1μm ,最大为2μm 。在PDA 上 ,生长迅速 ,菌落薄 ,雪
白色 ,致密 。在生长过程中 ,先形成直径约 4-6cm 的圆盘状菌落 ,接着菌落向周围延伸 ,但密度会突然下
降 ,由于密度的差异 ,形成明显的圈状 ,培养基呈浅黄色 ,颜色较均匀 。液体培养 ,菌丝球为乳黄色 ,培养液为
金黄色黏液。
2.2　内生真菌的鉴定
根据菌株的菌落(生长速度 、颜色 、厚薄 、质地 、形状等)、菌丝(颜色 、有无隔 、长宽等)、分生孢子(着生方
式 、形状 、颜色 、大小 、有无隔等)、分生孢子梗(着生方式 、颜色 、长度 、分枝等)、产孢器等各种性状进行检索鉴
定到属。经初步分类鉴定 ,从喜树果实中分离得到的内生真菌 ,均属于半知菌亚门(见表 1)。
表 1　喜树果内生真菌的种类
Table 1　The species of endophytic fungi in the f ruit of Camptotheca acuminata Decne.
菌 株 亚 门 Subdivision 目 Order 科 Family 属 genus
WZ001 半知菌亚门 丛梗孢目 暗梗孢科 匙孢霉属 Mystrospor ium Cda.
WZ002 半知菌亚门 无孢类群
WZ003 半知菌亚门 球壳孢目 肉类座菌科 鲜壳孢属 Zythia Fr.
WZ004 半知菌亚门 无孢类群
WZ005 半知菌亚门 无孢类群
2.3　喜树碱(CPT)的测定
将分离得到的喜树内生真菌通过摇瓶液体培养 ,其菌丝体经有机溶剂提取 ,采用薄层层析法(TCL)测定
CPT ,其中WZ001菌株的提取物在硅胶 G板上的斑点显淡淡的兰色荧光 、Rf值为 0.82 ,与 CPT 标样显兰色
荧光 、Rf值为 0.82相同。由此推测 ,该显淡兰色荧光的物质有可能是 CPT 类化合物 ,有关这方面的详细研
究正在进行中。
参考文献:
[ 1] 　王洋 , 于涛 ,张玉红 , 祖元刚.碱法提取喜树碱工艺的研究[ J] .木本植物研究 , 2000 , 20(4):433-437.
[ 2] 　郭良栋.内生真菌研究进展[ J] .菌物系统 , 2001 , 20(1):148-152.
[ 3] 　Strobel G , etc.Taxol and tax ane production by Taxomyces andreanal , an endophytic fungus o f Pacitic yew[ J] .Science , 1993 ,
260:214-216.
[ 4] 　郭波 , 李海燕 ,张玲琪.一种产长春碱真菌的分离[ J] .云南大学学报(自然科学版).1998 , 20(3):214-215.
[ 5] 　李海燕 ,曾松荣 , 张玲琪.云南桃儿七植株地下茎内生真菌多样性及有价值菌株的筛选[ J] .西南农业学报 , 1999 , 12
(4):123-125.
[ 6] 　魏景超.真菌鉴定手册[ M] .上海:上海科学技术出版社 , 1979 , 405-650.
[ 7] 　中国科学院植物研究所《常见与常用真菌》编写组.常见与常用真菌[ M] .北京:科学出版社 , 1978 , 143-253.
Isolation and identification of endophytic fungi in the fruit
of Camptotheca acuminata Decne.
CHEN Xian-x ing1 , 　CHEN Xi-feng1 , 　NAN Xu-yang1 , 　HE Xian-wu2
(1.Department of Biology and Environment Science in Wenzhou Normal College ,Wenzhou 325027 , China;
2.Wenzhou Ent ry-exit Inspect ion and Quarantine Bureau , Wenzhou 325027 , China)
Abstract:Five pure endophy tic fungal st rains w ere isolated f rom the f ruits of Camptotheca acum inata Decne.
These strains w ere classified into Mystrosporium Cda., Zy thia Fr.and Mycelia Sterilia of Subdivision.
Cultured the strains sing ly in taper flask under shaking , the org anic ex tracts of mycelium were analyzed w ith
thin layer chromatography(TLC).The result preliminarily showed the strain of WZ001 might product the
analog of Camptothecin(CPT).
Key words:Camptotheca acuminata Decne.;endophy tic fungi;isolation and ident if ication
—433—2003年 8月　　　　　　　　　　　　　　喜树果内生真菌的分离与鉴定