全 文 ：分子植物育种，2014年，第 12卷，第 1期，第 118-126页
Molecular Plant Breeding, 2014, Vol.12, No.1, 118-126
研究报告
Research Report
乌塌菜核雄性不育系花蕾败育相关基因的 cDNA-AFLP差异表达分析
王秋实 刘志勇 冯辉 *
沈阳农业大学园艺学院,沈阳, 110866
*通讯作者, fenghuiaaa@263.net
摘 要 本研究利用 cDNA-AFLP技术和生物信息学技术分析乌塌菜核不育系败蕾过程中的基因表达差
异。筛选到 64个与花蕾败育相关的差异表达片段(TDF)。选取 42个进行测序，获得的序列信息在 BRAD和
NCBI数据库上进行同源性比对，其中同源性大于 90%的 TDF有 16条，功能涉及能量代谢、逆境响应、转
录和翻译、信号转导、抗病与衰老、氨基酸的合成与加工、跨膜运输等方面。通过 QRT-PCR技术对表达模式
进行验证，结果与 cDNA-AFLP一致，无假阳性条带。选取 3个同源性较高的 TDF，采用 QRT-PCR分析其组
织表达模式。结果表明，H49在不育系败蕾期表达受到抑制，而在开花期大花蕾、叶片、萼片、花瓣等组织中高
水平表达；与之相反，H41和 H59在不育系开花期表达受抑制，而在败蕾期大花蕾、萼片、花瓣、花药中高
水平表达。
关键词 乌塌菜,花蕾败育,基因表达, cDNA-AFLP
cDNA-AFLP Differential Expression Analysis of Genes about Bud Aborting
in Genetic Male Sterile Line of Brassica campestris L. ssp. chinensis (L.)
Makino var. rosularis Tsen et Lee
Wang Qiushi Liu Zhiyong Feng Hui *
Department of Horticulture, Shenyang Agricultural University, Shenyang, 110866
* Corresponding author, fenghuiaaa@263.net
DOI: 10.13271/j.mpb.012.000118
Abstract cDNA-AFLP technology and bioinformatics analysis were used to analyze gene expression difference
between normal bud and aborted bud of the male sterile line of Brassica campestris L. ssp. chinensis (L.) Makino
var. rosularis Tsen et Lee. A total of 64 differential expressed transcript-derived fragments (TDFs) were obtained,
then 42 TDFs were chosen to sequence. Sequencing results were compared similarity with the known genes by
BRAD and NCBI. 16 TDFs which blast score is greater than 90, were included in energymetabolism, stress response,
signal transduction, transcription and translation, disease resistance and senescence, amino acid synthesizing and
processing, transmembrane transport, etc. Gene expression characteristics were proved by Real-time PCR. The
results were consistent with cDNA-AFLP and it indicated that no false positives appeared. 3 TDFs with high scores
were selected to analysis gene expression characteristics of tissue by real-time PCR. The results indicated that H49
were highly expressed in big flower buds, leaves, sepals and petals of normal period, but an extremely low
expression level in tissues of aborted period. H41 and H59 were highly expressed in big flower buds, sepals, petals
and mature anthers of aborted period, but an extremely low expression level in tissues of normal period.
Keywords Brassica campestris L. ssp. chinensis (L.) Makino var. rosularis Tsen et Lee, Bud aborting, Gene expre-
ssion, cDNA-AFLP
收稿日期：2013-03-22 接受日期：2013-07-26 网络出版日期：2013-12-03
URL: http://5th.sophiapublisher.com/abstract-1512-mpbopa
基金项目：本研究由国家自然科学基金(31201625; 31272157)资助
花蕾败育是十字花科蔬菜中普遍存在的现象，
影响杂交制种的产量，其表现为花蕾在开放前停止
生长，颜色由绿转黄，直至完全干枯脱落。这种现象
受环境条件的影响，在低温条件下表现较重，在植株
发育的不同阶段表现程度不同，始花期败蕾较重，有
些材料甚至不能正常开花(张鲁刚等, 2010)。
十字花科芸薹属蔬菜作物普遍具有显著的杂种
优势，而雄性不育是杂种优势利用的重要途径。目前
已经在大白菜、甘蓝等芸薹属作物中成功转育成了
多个雄性不育系(Li et al., 2009; Wan et al., 2008)，并
应用于生产实践当中。乌塌菜(Brassica campestris L.
ssp. chinensis (L.) Makino var. rosularis Tsen et Lee)属
于十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种中一种塌地或半
塌地生长绿叶蔬菜。本课题组利用在大白菜中发现
的核复等位基因遗传的雄性不育材料(冯辉等, 1995,
北京农业大学出版社, pp.458-466)，采用回交转育方
法育成了具有 100%不育度和不育株率的乌塌菜核
基因雄性不育系 GMS-3。但是，GMS-3于沈阳农业
大学实验室冬季种植时表现出严重的败蕾现象，直
至 3月末气温转暖后才正常开花(图 1)，这制约了其
在杂交制种实践上的应用。
图 1乌塌菜核基因雄性不育系败育花蕾和正常花蕾
注: A:败育时期花蕾; B:正常花期花蕾
Figure 1 Aborted buds and normal buds of genetic male sterile
line of Brassica campestris L. ssp. chinensis (L.) Makino var. ros-
ularis Tsen et Lee
Note: A: Buds of aborted period; B: Buds of normal flowering
period
cDNA-AFLP技术是研究基因差异表达的有效
工具。Zheng等(2004)将此项技术应用于水稻抗条纹
病研究，获得 12 个差异表达片段(TDF)。张岗等
(2010)利用 cDNA-ALFP 技术对小麦成株抗条锈性
相关基因差异表达进行研究，获得了 330个 TDFs，
涵盖抗病与防御、转录调控、蛋白质代谢、信号转导、
以及非生物胁迫等多方面的相关基因。Goupil 等
(2003)采用 cDNA-AFLP技术对菊苣根部不同发育
时期的基因进行表达差异分析，找到两个 TDF，与拟
南芥蛋白 AATL1 和 AAD25141.1 分别具有 93%和
72%的同源性。贾晋(2008)采用 cDNA-AFLP技术分
析萝卜败蕾相关基因，获得了与植物逆境胁迫相关
的 EST序列 11条、与衰老相关的 EST序列 7条，同
时发现败蕾中的 DNA表现出有规则的梯状条带，而
正常开花期花蕾只有单一 DNA条带，说明萝卜败蕾
机制涉及到细胞程序化死亡，可能与植物抗逆境胁
迫和衰老机制相似。
本项研究采用 cDNA-AFLP技术，对乌塌菜核基
因雄性不育系正常花蕾和败育花蕾进行基因差异表
达分析，并对基因表达模式进行验证，旨在了解乌塌
菜花蕾败育的分子机制。
1结果与分析
1.1总RNA质量的检测、cDNA 的合成产物以及预扩
产物的检测
取 1 μL消化后的总 RNA用 1%琼脂糖凝胶检
测(图 2A)，可以看到完整清晰的三条谱带，自上而
下分别为 RNA 28S、18S 和 5S。A260/A280 比值都在
1.8~2.1 之间，表明 RNA 提取纯度高，能够满足后
续研究的需要。合成双链 cDNA后，用 1%琼脂糖凝
胶电泳检测，片段大小在 250 bp~500 bp之间，条带
边缘清晰，亮度高，可以用于后续研究(图 2B)。将酶
切、连接后的产物取 5 μL用于预扩增，结果如图 2C
所示，可见到清晰的弥散带，说明能够用于选择性
扩增反应。
1.2 cDNA-AFLP多态性分析
采用 EcoRⅠ和 MseⅠ通用引物对，进行选择性
扩增，获得 64条 TDF，片段大小在 80~400 bp之间。
按照正常花蕾→败育花蕾的点样顺序，差异表达片
段呈现出四类表达模式：a：有→无；b：无→有；c：
强→弱；d：弱→强。其中，a类条带占 43.0%，b类条带
占 36.5%，c类条带占 10.8%，d类条带占 9.7%。部分
差异表达片段及表达模式见图 3。
1.3差异片段的同源性分析及表达模式的验证
选择其中的42条差异表达片段回收、测序。测序
成功的 36条 TDF序列在 NCBI数据库和 BRAD数
据库中比较同源性。BLAST结果表明，16条 TDF序
列在 BRAD中同源性达到 90%以上，预测的基因功
能列于表 1。有 14条 TDF序列在 NCBI和 BRAD均
能找到同源序列，但是同源性较低，功能未知。有 6
条 TDF 序列在 NCBI 中没有同源序列但在 BRAD
中有少量同源序列，需要进一步研究。两个数据库中
乌塌菜核雄性不育系花蕾败育相关基因的 cDNA-AFLP差异表达分析
cDNA-AFLP Differential Expression Analysis of Genes about Bud Aborting in Genetic Male Sterile Line of Wuta-tsai 119
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 2 RNA质量, cDNA产物和预扩产物的检测
注: M: D2000 marker; K:正常开花期花蕾; B:花蕾败育期花
蕾; a:提取的总 RNA质量检测; b:第二链 cDNA合成产物的
检测; c:预扩产物的检测
Figure 2 Extraction results of RNA, quality of the cDNA and
pre-expanding product
Note: M: D2000 marker; K: The buds of normal flowering peri-
od; B: The buds of aborted period; a: The extraction results of
RNA; b: The quality of the cDNA; c: The quality of the pre-ex-
panding product
图 3部分差异表达片段及其表达模式
注: K:为正常开花期花蕾; B:花蕾败育期花蕾; a:有→无; b:无→有; c:强→弱; d:弱→强
Figure 3 Some of differentially expressed genes and their expression characteristics
Note: K: The buds of normal period; B: The buds of aborted period; a: Expression→Non-expression; b: Non-expression→Expression;
c: Strong expression→Week expression; d: Week sxpression→Strong expression
基因功能预测结果绝大部分相同或相似，这些 TDF
的基因功能包括能量代谢、逆境响应、转录和翻译、
信号转导、抗病与衰老、氨基酸的合成与加工、跨膜
运输等方面。
利用 QRT-PCR对 16条同源性大于 90%的差异
表达基因进行表达模式的验证。结果表明，这些基因
在乌塌菜不育系败蕾时期和正常开花时期的表达确
实存在显著差异，与 cDNA-AFLP分析结果高度一
致，说明无假阳性条带。部分差异表达基因在不同样
品间的相对表达量如图 4所示。
图 4差异表达基因的 QRT-PCR验证
注: K:开花期; B:败蕾期; a: TDFH6; b: TDFH33; c: TDFH57;
d: TDFH34
Figure 4 Expression validation of differentially expressed genes
by QRT-PCR
Note: K: Normal flowering period; B: Aborted bud period; a:
TDFH6; b: TDFH33; c: TDFH57; d: TDFH34
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乌塌菜核雄性不育系花蕾败育相关基因的 cDNA-AFLP差异表达分析
cDNA-AFLP Differential Expression Analysis of Genes about Bud Aborting in Genetic Male Sterile Line of Wuta-tsai 121
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
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122
1.4基因表达模式分析
对 H41、H49 和 H59 这 3 个 TDF 基因在 11 个
组织器官中的表达模式进行分析。QRT-PCR结果表
明，H49只在开花期表达，败蕾期受到强烈抑制。其
中，在开花期大蕾、叶片和萼片中高度表达，分别为
表达量最低器官的 100倍、45倍和 40倍(图 5)。H41
和 H59只在败蕾期表达，而开花时表达受到抑制。
H41在大蕾、萼片和花瓣中表大量最高，可达到根部
表达量的 550倍、180倍和 100倍。H59在败蕾期大
蕾、萼片和花药中表达量最高，而根、花茎、叶和雌蕊
中基本不表达(图 6)。
图 5 H49基因组织表达模式分析
注: 1:根; 2:花茎; 3:叶; 4:小蕾(<1 mm); 5:中蕾(1.5~2.5 mm);
6:大蕾(>3.0 mm); 7:花瓣; 8:萼片; 9:花药; 10:花丝; 11:雌蕊
Figure 5 Gene expression analysis of H49
Note: 1: Root; 2: Stem; 3: Leaf; 4: Small floral bud (<1 mm); 5:
Middle floral bud (1.5~2.5 mm); 6: Big floral bud (>3.0 mm); 7:
Petal; 8: Sepal; 9: Anther; 10: Filament; 11: Pistil
2讨论
花蕾败育的过程受到复杂基因网络的精细调
控，根据本研究获得的差异表达片段及对其进行功
能分类的结果推测，该过程可能涉及到能量代谢、逆
境响应、转录和翻译、信号转导、蛋白质的合成与加
工、跨膜运输、抗病与衰老等多个方面。由于冬季低
温、低光照的影响，花蕾发育的过程中某个关键基因
发生突变，都可能引起下游基因表达发生改变，从而
引起代谢的紊乱，最终导致花蕾败育。
本研究发现了两个编码与拟南芥或大白菜核酮
糖二磷酸羧化酶 /加氧酶(Rubisco)同源性达到 93%
以上的序列，编号为 H33和 H49。其中长度为 122 bp
的 H49与编码拟南芥 Rubisco的小亚基前体蛋白同
源性达到 100%。安佰义等(2011)研究发现，Rubisco
是位于叶绿体中与冷胁迫密切相关的非常重要的复
合酶，在研究拟南芥光合抑制与 Rubisco相互作用的
蛋白质解聚之间的关系时，发现 Rubisco复合酶体系
的解聚可能是低温胁迫下拟南芥光合速率降低的主
要原因。结合本研究，受北方冬季日光温室中低温胁
迫的影响，与 Rubisco相互作用的蛋白质解聚，乌塌
菜光合作用受到抑制，这可能是 Rubisco在乌塌菜花
蕾败育时期不表达的原因。
H59 与编码 E3 大白菜泛素连接酶 UPL1 功能
未知区域的序列同源性为 98%。资料显示，在拟南
芥中，编码 E3的基因数目超过 1 300个(Smalle and
Vierstra, 2004)。在植物中，E3的生物学功能涉及到
植物生长发育和逆境响应过程中的关键步骤，如开
花(Cao et al., 2008; Park et al., 2010)、衰老(Zhang et
al., 2005)、植物细胞程序化死亡(Zeng et al., 2004; Lin
et al., 2008)、冷胁迫(Dong et al., 2006)等。本研究
中，编码 E3泛素连接酶未知功能区域的基因只在
花蕾败育时期表达，而正常开花期不表达，暗示了
其与乌塌菜花蕾败育之间的重要联系，但究竟该基
因在花蕾败育过程的哪个环节起作用，还有待于进
一步研究。
图 6 H41和 H59基因组织表达模式分析
注: A: TDFH41; B: TDFH59; 1: 根 ; 2: 花茎 ; 3: 叶 ; 4: 小蕾
(<1 mm); 5: 中蕾(1.5~2.5 mm); 6:大蕾(>3.0 mm); 7: 花瓣; 8:
萼片; 9:花药; 10:花丝; 11:雌蕊
Figure 6 Gene expression analysis of H41 and H59
Note: A: TDFH41; B: TDFH59; 1: Root; 2: Stem; 3: Leaf; 4:
Small floral bud (<1 mm); 5: Middle floral bud (1.5~2.5 mm); 6:
Big floral bud (>3.0 mm); 7: Petal; 8: Sepal; 9: Anther; 10: Filam-
ent; 11: Pistil
乌塌菜核雄性不育系花蕾败育相关基因的 cDNA-AFLP差异表达分析
cDNA-AFLP Differential Expression Analysis of Genes about Bud Aborting in Genetic Male Sterile Line of Wuta-tsai 123
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
在植物衰老过程中，半胱氨酸蛋白酶导致蛋白
质的降解，是植物衰老期间蛋白质含量下降的主要
原因(Noh and Amasino, 1999; Yoshida et al., 2001)。
另一些研究表明，半胱氨酸蛋白酶参与执行和控制
细胞程序化死亡(Rojo et al., 2004, 李思滨等, 2008)。
在甘蓝型油菜中，半胱氨酸蛋白酶基因在植株衰老
时启动，由液泡内转运至细胞质内，参与蛋白质的
降解(Buchanan-Wollaston and Ainsworth, 1997)。差
异表达片段 H41的蛋白质序列与甘蓝型油菜中的半
胱氨酸蛋白酶某片段具有 100%同源性，由于其只
在花蕾败育期间表达，可以推断花蕾败育与半胱氨
酸蛋白酶基因活化、表达，导致花蕾中某些蛋白质的
降解有关。
此外，研究中得到的两条 TDF序列，分别是 H3
和 H53，用 BRAD中的 BlastN进行同源性对比，发
现这两条 TDF序列分别与 A01和 A07号染色体的
某区域具有 100%同源性，是两个新发现的基因，其
功能还需要进一步研究。
尽管 cDNA-AFLP技术已逐渐成为研究基因表
达模式的有效工具，但其技术的本身还存在一定的
局限性。如存在假阳性，需要进行荧光定量 PCR来
验证可靠性，这使得工作量和费用大大增加。此外，
由于不可能所有的转录片段都同时具有 2个限制性
内切酶的识别位点，因此本研究中利用 cDNA-AFLP
分析所获得的差异表达片段并不全面。而且这些差
异表达片段在花蕾败育过程中的作用还只是推测，
在后续的研究工作中，将选取与花蕾败育密切相关
的基因片段，获取全长基因并对基因特征进行分析，
进一步研究基因功能。
3材料与方法
3.1材料
将沈阳农业大学选育的乌塌菜核基因雄性不育
系 GMS-3种子，于 2012年 8月 30日播种于花盆
中，在沈阳农业大学蔬菜育种试验基地的温室中培
育。2013年 1月 10日，采用混合花蕾取样法，收集出
现败育现象的花序一级分枝的所有花蕾，建立败育
花蕾基因池，编号为 B；3月下旬植株开花转入正常
后，取发育正常的一级分枝的所有花蕾，建立正常花
蕾基因池，编号为 K。样品放置在-70℃下保存。同
时，取败育时期和正常开花时期植株的根、花茎、叶、
小蕾(<1 mm)、中蕾(1.5~2.5 mm)、大蕾(>3.0 mm)、花
瓣、萼片、花药、花丝，以及雌蕊组织，取样后放入液
氮中速冻，-80℃下保存，用于基因表达模式分析。
3.2试剂
引物的合成在北京奥科生物技术有限责任公司
完成。DNA分子量标准、dNTP、Taq酶、DNA凝胶回
收试剂盒、大肠杆菌 TOP10均购自天根公司。限制
性内切酶组合 EcoRⅠ和 MseⅠ购自 NEB公司。采用
Invitrogen公司生产的 Trizol试剂盒，提取总 RNA，
RQ1 RNase-Free DNase购自 Promega公司。采用天
根公司的 Real Master Mix (SYBR GreenⅠ)试剂盒进
行荧光定量分析。
3.3总 RNA提取及 cDNA合成
按照试剂盒说明提取总 RNA，用 RQ1 RNase
Free DNase进行处理，去除残留的痕量 DNA。采用
Invitrogen 公司的反转录系统 SuperScript Ⅲ合成第
1 链 cDNA。第 2 链 cDNA 的合成按照刘志勇等
(2011)的方法。
3.4 cDNA-ALFP分析及差异条带克隆
取 5 μL酶切、连接后的产物进行预扩增。将预
扩增产物稀释 30倍，作为选择性扩增的模板使用。
选择性扩增引物对分别为：EcoRⅠ：5-GACTGCG-
TACCAATTCNN-3 (N表示 A, T, C, G中任意一种碱
基 )；MseⅠ：5-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3 (N
表示 A, T, C, G中任意一种碱基)。用 6%聚丙烯酰胺
凝胶电泳检测选择性扩增产物，采用 Sanguinetti等
(1994)的银染法显示条带。cDNA-AFLP反应体系和
程序参照 Bachem等(1996)提出的方法。从总 RNA
提取到银染，均设置 2次重复。
将差异表达条带切下，按照凝胶回收试剂盒说
明书将胶中含有的差异表达产物回收与纯化。纯化
后，经连接、转化及克隆，挑选 3个阳性克隆在北京
华大基因研究中心进行测序。
3.5测序序列的分析
将测序得到的 TDF序列去除引物和载体序列，
在大白菜基因组数据库 BRAD (http://brassicadb.
org/brad/)和 NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)数据
库中进行 BLAST同源性比对，预测基因功能。
3.6差异片段的表达模式分析
利用 QRT-PCR技术分析部分差异表达基因在
花蕾败育池(B)和正常开花池(K)间的表达模式，对
cDNA-AFLP 分析结果进行验证。采用 Elongation
124
乌塌菜核雄性不育系花蕾败育相关基因的 cDNA-AFLP差异表达分析
cDNA-AFLP Differential Expression Analysis of Genes about Bud Aborting in Genetic Male Sterile Line of Wuta-tsai
Factor 1α作为内参基因，并利用 Primer 5引物设计
软件设计了 7对基因特异性引物用于 QRT-PCR反应
(表 2)，反应仪器为 iQ5荧光定量 PCR仪。方法参照
Real Master Mix (SYBR GreenⅠ)的试剂盒说明书。
采用 QRT-PCR分析基因在根、花茎、叶、小蕾(<
1 mm)、中蕾(1.5~2.5 mm)、大蕾(>3.0 mm)、花瓣、萼
片、花药、花丝、雌蕊组织中的表达模式，方法同上。
表 2 QRT-PCR反应所用的基因特异性引物
作者贡献
王秋实是本研究的实验设计和实验研究的执行
人，完成数据分析，论文初稿的写作；刘志勇参与实
验设计；冯辉是项目的构思者及负责人，指导实验设
计，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的
文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金(31201625; 31272-
157)资助。
参考文献
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表 2 QRT-PCR反应所用的基因特异性引物
Table 2 Spesific primer for QRT-PCR analysis
差异表达片段
TDF
H6
H7
H33
H34
H41
H49
H59
对应的引物名称及序列
Primer number and squences
ACACTTACGGTTGATGAA
CAGAGCAGATTTGATGTTT
CGTCACTTCGTATTCCAACTC
GAACGTGGAGATCGATGTGT
CTTCCACATTGTCCAGTAAC
GAGCACGGGTTTGTTTAC
TCCACTATCCGAACGAAT
AGCATAGGAAAGACCATTG
GGGAGAACGTGGATACAT
AAGCATTCATGGCAAGAC
TCGGATTGTCAAATGTCTGATT
TGGCTTGTAGGCGATGAA
CGGGTTCATCAGTCTCAT
GTAAGCAACACCTCTTCTC
125
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