全 文 ：上海交通大学学报(医学版)
Journal of Shanghai Jiaotong University (Medical Science) Vol． 32 No． 6 Jun． 2012
［基金项目］沈阳市科技计划项目(F10-149-9-31) (Shenyang Science and Technology Committee Foundation，F10-149-9-31)。
［作者简介］陈振军(1970—) ，男，主任医师，硕士;电子信箱:szchenzhenjun@ 163． com。
［文章编号］ 1674-8115(2012)06-0716-04 ·论 著·
土槿皮乙酸对胶质瘤 C6 细胞生长的抑制作用
陈振军， 孙冬弢， 袁 媛
(沈阳医学院 沈洲医院神经外科，沈阳 110002)
［摘要］ 目的 研究土槿皮乙酸(PAB)对大鼠胶质瘤 C6 细胞生长的抑制作用及其分子机制。方法 采用 MTT 法测定不同质量
浓度(0、0. 1、0. 2、0. 4、0. 8、1. 6、8. 0、16. 0 μg /mL)PAB对 C6 细胞增殖能力的影响。以 0(对照组)、0. 15、0. 3、0. 6 μg /mL PAB处
理后，采用 Annexin V-FITC /PI双染色法经流式细胞仪检测 C6 细胞的凋亡情况，RT-PCR和Western blotting法检测凋亡抑制蛋白
Survivin、自噬标志性分子微管相关蛋白 1 轻链 3-β(LC3)和凋亡剪切产物聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(Cleaved-PARP)的表达。
结果 MTT法测定结果显示，PAB呈时间剂量依赖性抑制 C6 细胞的生长，PAB处理 12、24、36、72 h后，PAB对 C6 细胞的半数致
死剂量(IC50)分别为 1. 23、1. 05、0. 30、0. 09 μg /mL。流式细胞仪检测结果显示，0. 15、0. 30、0. 60 μg /mL PAB作用 C6 细胞 36 h
后细胞出现凋亡，并且随着 PAB浓度的升高，细胞凋亡率呈上升趋势，分别为(24. 89 ± 0. 92)%、(31. 38 ± 0. 36)%和(62. 84 ±
2. 22)%，与对照组比较差异均有统计学意义(P ＜ 0. 05)。RT-PCR 和 Western blotting 检测结果显示:PAB 处理后的 C6 细胞内
Survivin表达下降，LC3 和 Cleaved-PARP表达升高，与对照组相比差异均有统计学意义(P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01) ;且随着 PAB浓度
的升高，细胞内 Survivin、LC3、Cleaved-PARP 的表达变化呈剂量依赖性。结论 PAB可抑制大鼠胶质瘤 C6 细胞增殖，并促进其凋
亡;下调 Survivin的表达，上调 LC3 和 Cleaved-PARP的表达为 PAB可能的作用机制。
［关键词］土槿皮乙酸;C6 细胞;生长抑制
［DOI］ 10． 3969 / j． issn． 1674-8115． 2012． 06． 006 ［中图分类号］ R739． 41;Q2 ［文献标志码］ A
Inhibition of pseudolaric acid B on growth of glioma C6 cells
CHEN Zhen-jun， SUN Dong-tao， YUAN Yuan
( Department of Neurosurgery， Shenzhou Hospital， Shenyang Medical College， Shenyang 110002， China)
［Abstract］ Objective To investigate the inhibitory effect of pseudolaric acid B ( PAB) on the growth of glioma C6 cells，
and explore the possible molecular mechanism． Methods The effects of different mass concentrations of PAB ( 0， 0. 1，
0. 2， 0. 4， 0. 8， 1. 6， 8. 0 and 16. 0 μg /mL) on the growth of C6 cells were analysed by MTT assay． After treatment with
0 ( control) ， 0. 15， 0. 3 and 0. 6 μg /mL PAB， the apoptosis of C6 cells was detected by flow cytometry with Annexin V-
FITC /PI double staining， and the expression of Survivin ( apoptosis inhibition protein) ， LC3 ( microtubule-associated protein
1 light chain 3-β) and cleaved poly( ADP-ribose) polymerase ( Cleaved-PARP) was determined by RT-PCR and Western
blotting． Results MTT assay revealed PAB inhibited the growth of C6 cells in a dose and time dependent manner． The
median lethal dosages ( IC50 ) of PAB on C6 cells were 1. 23， 1. 05， 0. 30 and 0. 09 μg /mL after treatment with PAB for 12，
24， 36， and 72 h respectively． Flow cytometry indicated that apoptosis of C6 cells occurred 36 h after treatment with 0. 15，
0. 30 and 0. 60 μg /mL PAB， and the apoptosis rates were ( 24. 89 ± 0. 92) % ， ( 31. 38 ± 0. 36) % and ( 62. 84 ± 2. 22) %
respectively， which were significantly different from that of control group ( P ＜ 0. 05 ) ． RT-PCR and Western blotting
demonstrated that the expression of Survivin in C6 cells decreased， and the expression of LC3 and Cleaved-PARP increased
after treatment with PAB， which was significantly different from that of control group ( P ＜ 0. 05 or P ＜ 0. 01) ． With the
concentration increase of PAB， the expression of Survivin， LC3 and Cleaved-PARP in cells changed in a dose dependent
manner． Conclusion PAB can inhibit the growth of glioma C6 cells and induce cell apoptosis， which may be associated
with the decreased expression of Survivin and increased expression of LC3 and Cleaved-PARP．
［Key words］ pseudolaric acid B; C6 cells; growth inhibition
·617·
No． 6 陈振军，等:土槿皮乙酸对胶质瘤 C6 细胞生长的抑制作用
脑胶质瘤是颅内最常见的原发性恶性肿瘤，也
是中枢神经系统最常见的肿瘤。目前，手术切除是
治疗脑胶质瘤的主要方法，但远期疗效较差，复发率
高。中药以其低毒、有效的优势作为治疗肿瘤的替
代疗法日益受到人们的重视。土槿皮乙酸(pseudolaric
acid B，PAB)是从松科植物金钱松的根皮中分离出来
的有效成分，有研究［1，2］表明 PAB 具有抗肿瘤、抗早
孕和抗真菌等作用。本研究采用细胞生物学方法检
测了 PAB对胶质瘤 C6 细胞增殖及凋亡的影响，同时
检测了凋亡抑制蛋白 Survivin、自噬标志性分子微管
相关蛋白 1 轻链 3-β(microtubule-associated protein 1
light chain 3-β，MAP1LC3-Ⅱ，简称 LC3)和凋亡剪切
产物聚腺苷二磷酸核糖聚合酶［Cleaved poly(ADP-
ribose)polymerase，Cleaved-PARP］mRNA 和蛋白表
达水平，对 PAB抑制肿瘤细胞生长的机制进行初步
探讨。
1 材料与方法
1． 1 材料
大鼠胶质瘤 C6 细胞株购自中国科学院上海细
胞库;PAB购自沈阳药科大学。主要试剂:F12K 培养
基(AppliChem，德国) ;胎牛血清和马血清(Hyclone，美
国) ;甲基噻唑蓝(methylthiophene tetrazolium，MTT)
(Sigma，美国) ;Annexin V-FITC /PI 细胞凋亡检测试
剂盒(碧云天生物技术研究所) ;Survivin、LC3 抗体
(Santa Cruz，美国) ，Cleaved-PARP抗体(CST，美国)。
主要仪器:CO2细胞培养箱(Heal Force，中国香港) ;
倒置显微镜(Motic，中国) ;酶标仪(Biotek，美国) ;流
式细胞仪(BD FACS Calibur，美国)。
1． 2 方法
1． 2． 1 细胞培养 大鼠胶质瘤 C6 细胞培养于含
10%胎牛血清和 2%马血清的 F12K 培养液中，置于
细胞培养箱中，在 37 ℃、5% CO2和饱和湿度条件下
培养。
1． 2． 2 MTT法检测 C6 细胞的增殖能力 将大鼠胶
质瘤 C6 细胞以 104个 /孔的浓度接种于 96 孔培养
板，培养 12 h，使其充分贴壁，然后分别换液为含 0、
0. 1、0. 2、0. 4、0. 8、1. 6、8. 0、16. 0 μg /mL PAB 的
F12K培养液培养，每个浓度设 5 个复孔，CO2培养箱
中孵育 12、24、36、72 h。每孔加入5 mg /mL MTT 溶
液 20 μL，置于 CO2培养箱中孵育 4 h，吸去上清，加
入 200 μL 二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶
解细胞内形成的结晶，用酶标仪测定 490 nm 处的吸
光度值，计算 PAB对 C6 细胞增殖的抑制率，筛选出
PAB最佳的作用浓度和作用时间。细胞增殖抑制率
=(空白孔吸光度值―实验孔吸光度值)/空白孔吸
光度值 × 100%。
1． 2． 3 流式细胞仪检测 C6 细胞的凋亡情况 以 0
(对照)、0. 15、0. 3、0. 6 μg /mL PAB 处理 C6 细胞
36 h后，消化、收集各组细胞，小心吸除上清，PBS 漂
洗 2 次，将细胞重悬于 200 μL 结合缓冲液(binding
buffer) ，加入 10 μL Annexin V-FITC 和 10 μL PI，轻
轻混匀，避光 4 ℃反应30 min后，再加入 300 μL结合
缓冲液，采用流式细胞仪进行上机检测，分析细胞的
凋亡率。实验重复 3次。
1． 2． 4 Western blotting 法检测 C6 细胞内 Survivin、
LC3 和 Cleaved-PARP 蛋白的表达 以 0(对照)、
0. 15、0. 3、0. 6 μg /mL PAB 处理 C6 细胞 36 h 后，胰
蛋白酶消化收集细胞，BCA 法测定蛋白质浓度，取
20 μg等量蛋白质进行十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺
凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel
electrophoresis，SDS-PAGE) ，Western blotting 法检测
目标蛋白，采用凝胶成像及分析系统测定细胞内
Survivin、LC3 和 Cleaved-PARP的灰度值。
1． 2． 5 RT-PCR 法检测 C6 细胞内 Survivin、LC3 和
PARP mRNA 的表达 收集以 0(对照)、0. 15、0. 3、
0. 6 μg /mL PAB处理后的 C6 细胞，抽提总 RNA，取
1 μg总 RNA 反转录获得 cDNA，进行 PCR 反应。各
基因的引物序列和扩增产物长度见表 1。PCR 反应
条件:95 ℃预变性 5 min;95 ℃变性 20 s、60 ℃退火
20 s、72 ℃复性 30 s，共 35 个循环;72 ℃延伸 5 min。
反应体系中 β-actin作为内参照。
表 1 基因的引物序列和产物长度
Tab 1 Primer sequences and product length in gene amplification
responses
基因名称 引物序列(5→3) 产物长度 /bp
Survivin 上游:TTTGCTCTATTGTGACCTGGACT 229
下游:GGTAGGAGGACTCATCAGAAGGA
LC3 上游:CTACGGCTGCTCTTTATACTCAG 103
下游:AAGCCATCTTCTTCAATCATCTC
PARP 上游:TGTGACGAGGTGGATGGAATAGA 194
下游:GGTACTTGCTGCTGGTTGAAGAT
β-actin 上游:ACGTTGACATCCGTAAAGAC 200
下游:GAAGGTGGACAGTGAGG
1． 3 统计学分析
采用 SPSS 16. 0 软件进行数据分析，计量资料以
珋x ± s 表示，组间比较采用单因素方差分析，P ＜ 0. 05
表示差异有统计学意义。
·717·
上海交通大学学报(医学版) Vol． 32
2 结 果
2． 1 PAB对大鼠胶质瘤 C6 细胞增殖的抑制作用
经不同质量浓度(0、0. 1、0. 2、0. 4、0. 8、1. 6、8. 0、
16. 0 μg /mL)PAB作用后，C6细胞的增殖能力明显受
到抑制(P ＜0. 05) ;不同浓度 PAB作用于 C6细胞后不
同时间，对 C6 细胞的毒性作用呈现明显的时间和剂
量依赖性(图 1)。加药处理时间为 12、24、36、72 h，
PAB对 C6 细胞的半数致死剂量(IC50)分别为 1. 23、
1. 05、0. 30、0. 09 μg /mL，因此采用 PAB 质量浓度为
0. 15、0. 30、0. 60 μg /mL以及 36 h 作用时间点进行后
续实验。
2． 2 PAB对大鼠胶质瘤 C6 细胞凋亡的影响
Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪检测显示，
经 0. 15、0. 30、0. 60 μg /mL PAB 作用 36 h 后，C6 细胞
均出现凋亡现象，凋亡率分别为(24. 89 ± 0. 92)%、
(31. 38 ± 0. 36)% 和(62. 84 ± 2. 22)%，与对照组
(0. 16%)相比，细胞凋亡率明显升高，差异有统计学意
义(P ＜0. 05) (图 2)。
2． 3 PAB 对大鼠胶质瘤 C6 细胞内 Survivin、LC3 和
Cleaved-PARP表达水平的影响
Western blotting检测结果显示，经不同浓度PAB
处理后，C6 细胞内的凋亡抑制蛋白 Survivin 的表达
呈下调趋势，自噬标志性分子 LC3 和 Cleaved-PARP
蛋白表达上调，与对照组比较差异均有统计学意义
(P ＜ 0. 01) (图 3) ;RT-PCR 检测结果显示，Survivin、
LC3 和 Cleaved-PARP 的 mRNA 表达趋势与蛋白表
达变化一致，随着 PAB 浓度升高，呈现剂量依赖性
(图 4、5)。
注:①P ＜ 0. 05，②P ＜ 0. 01 与前一浓度梯度比较;③P ＜ 0. 05，④P ＜
0. 01 与前一时间点比较。
图 1 PAB对 C6 细胞增殖的抑制作用(n = 5)
Fig 1 Inhibition of PAB on growth of C6 cells (n = 5)
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No． 6 陈振军，等:土槿皮乙酸对胶质瘤 C6 细胞生长的抑制作用
注:A ～ D分别为 0(对照组)、0. 15、0. 3 和 0. 6 μg /mL PAB组。
图 4 PAB对 C6 细胞内 Survivin、LC3 和 Cleaved-PARP mRNA表达的影响
Fig 4 Effects of PAB on the expression of Survivin，LC3 and Cleaved-PARP mRNA in C6 cells
注:A ～ D分别为 0(对照组)、0. 15、0. 3 和 0. 6 μg /mL PAB组;①P ＜
0. 05，②P ＜ 0. 01 与对照组比较。
图 5 PAB 作用后 C6 细胞内 Survivin、LC3 和 Cleaved-PARP
mRNA的相对表达量(n = 3)
Fig 5 Relative expression of Survivin，LC3 and Cleaved-PARP
mRNA in C6 cells after treatment with PAB (n = 3)
3 讨 论
天然药物单体化合物可通过抑制肿瘤细胞增
殖、诱导肿瘤细胞分化或凋亡而发挥抗肿瘤作用［3］，
对其抗肿瘤作用机制的研究尤为重要。PAB 是从土
槿皮中分离得到的新型二萜酸化合物，分子式为 C23
H28O8，现代药理实验表明 PAB 具有抗肿瘤、抗早孕
和抗真菌等多种作用。PAB 能诱导人胃癌细胞
SGC7901 和 MGC803 凋亡，通过上调 bax表达和下调
bcl-2 表达导致线粒体膜电位下降，激活 Caspase，最
终导致细胞凋亡［4，5］。同时，PAB 可通过诱导人黑色
素瘤细胞凋亡，抑制其增殖［6，7］，但 PAB对胶质瘤 C6
细胞的作用还鲜有报道。
本研究应用细胞生物学和分子生物学方法检测
了 PAB对 C6 细胞生长的抑制作用，结果显示 PAB
可显著抑制大鼠胶质瘤 C6 细胞的增殖，在 PAB质量
浓度为 0. 1 ～ 0. 8 μg /mL范围内呈现剂量依赖性，但
加药浓度高于 1. 6 μg /mL 时，细胞增殖抑制率增加
趋于平缓。利用 Annexin V-FITC /PI 双染色法检测
PAB作用后细胞的凋亡情况，发现经 PAB 处理后凋
亡细胞比例有所增加，证实 PAB 诱导了 C6 细胞凋亡
的发生。同时，本研究还进行了细胞内因子 Survivin、
LC3 和 Cleaved-PARP 表达的检测。Survivin 是凋亡
抑制蛋白中的一员，是凋亡的抑制剂，主要表达于胚
胎及未分化成熟的组织，在多数肿瘤组织中呈现高
表达［8，9］。LC3 是在高等真核细胞中发现的第一种
自噬体膜蛋白，可作为自噬的标志性分子用于检测
自噬活动［10，11］。PARP 是一种锌指状 DNA 结合蛋
白，可被单链或双链 DNA 片段激活，催化烟酸胺腺
嘌呤二核苷酸裂解，造成能量耗竭，从而导致细胞凋
亡;PARP 还是 Caspase-3 的剪切底物，剪切产物
Cleaved-PARP将随着凋亡的加剧而增多［12］。本研
究结果显示，经不同浓度 PAB 处理后，C6 细胞内
Survivin蛋白和 mRNA 表达呈现下调趋势，LC3 和
Cleaved-PARP的表达则有所增加。
综上所述，PAB可抑制大鼠胶质瘤C6细胞增殖，并
诱导其凋亡;Survivin 表达下调，LC3 和 Cleaved-PARP
表达上调可能是 PAB 作用机制，但 PAB 对 C6 细胞
生长影响的确切作用机制还有待进一步研究。
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［收稿日期］2012-02-05 ［本文编辑］
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张皙康
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［收稿日期］2012-01-17 ［本文编辑］周珠凤
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