全 文 ：收稿日期: 2009 - 10 - 10
基金项目: 浙江省卫生厅中医药青年基金研究计划项目资助
( 2005A12 )
作者简介:郭勇 ( 1961 - ) ,男,教授、主任医师,博士研究生导师,
博士后流动站指导教授, 主要从事中药与化疗、生物治
疗结合的基础与临床研究。
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CH INESE ARCH IVES OF TRAD IT IONAL CH INESE MED IC INE
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复方藤梨根制剂下调乙酰肝素酶表达抑制胃癌细胞转移
郭 勇 1,秦建岭 1,方 勇2,潘宏铭 2
( 1.浙江中医药大学附属第一医院,浙江 杭州 310006;
2. 浙江大学医学院附属邵逸夫医院肿瘤内科, 浙江 杭州 310016)
摘 要:目的: 研究探讨复方藤梨根制剂抑制胃癌细胞转移的机制。方法: 以 SGC - 7901胃癌细胞株建立胃
癌裸鼠原位移植瘤模型, 将裸鼠随机分为生理盐水组, 复方藤梨根制剂低剂量、中剂量及高剂量组, 接受连续 21
天口服灌注治疗。根据胃癌细胞转移的部位进行赋值评分, 观察复方藤梨根制剂对裸鼠胃癌移植瘤转移的影响,
并用荧光定量 PCR仪 ( FQ -PCR )检测胃癌细胞乙酰肝素酶 mRNA表达的影响。结果: 根据胃癌细胞转移部位的
赋值评分,生理盐水组与低剂量治疗组评分显著高于中、高剂量组; 经 FQ -PCR法检测,生理盐水组与低剂量治
疗组的胃癌组织乙酰肝素酶 mRNA表达显著高于中、高剂量治疗组。结论:在裸鼠动物模型, 复方藤梨根制剂可
能是通过下调乙酰肝素酶 mRNA表达来抑制胃癌细胞的远处转移,发挥其抗肿瘤作用。
关键词:藤梨根;胃癌; 裸鼠;乙酰肝素酶; 转移
中图分类号: R285. 5 文献标识码: A 文章编号: 1673 - 7717( 2010) 03 -0461 - 03
The S tudy of the Inh ib it Effec ts ofMetastasis By Fufang Teng ligen Through
Down - regu late Heparanase Expression in Gastric Cancer
GUO Yong1, Q IN Jian-lin1, FANG Yong2, PAN H ong-m ing2
( 1. Dep .t ofM ed icalOncology, The Fris tA ffiliatedH osp ita l ofZhejiang Ch inese M edica lUniversity,
H angzhou 310006, Zhejiang, Ch ina; 2. Dep.t ofM ed icalOnco logy, Sir Run Run Sh aw H osp ita,l Zhejiang Un iversity
School ofM edicine, H angzhou 310016, Zhejiang, Ch ina)
Abstrac t: Ob jective: To study and exp lo re the inhib it effec ts and mechanism s of Fufang Teng ligen m ix ture ( FFTLM )
on the m etastasis of ga stric cance r. M ethods: The nude m ice w ith the o riginal gastric cancer transplant mode o f SGC -
7901 ga stric cancer ce ll linew ere random ized into four g roups, sa line contro l g roup, low do se g roup o f FFTLM , m idd le
do se g roup of FFTLM and h igh dose group of FFTLM, accepted 21 day s of oral infusion treatm en.t The effects on them e-
ta stasis o f gastric cancer we re observed acco rding to the score of them e tasta tic o rgan, and the expression o f heparanase
mRNA expression w as de tected by FQ -PCR technique. Results: Based on the score o f the me tastatic organ, the sco re of
the sa line contro l g roup and low dose g roup o f FFTLM were m arkedly higher than tha t o fm iddle and high dose group of
FFTLM . A fter the de tec tion by FQ - PCR technique, the heparanase mRNA gene expressions in saline contro l g roup and
low do se g roup o f FFTLM were g rea tly h igher than that in m iddle and h igh dose group of FFTLM. Conc lus ion: Fufang
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DOI：10.13193/j.archtcm.2010.03.14.guoy.032
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Teng ligen m ix ture can inh ib it them e tastasis o f gastric cancer which is associate w ith the dow n - regu late the heparanase
mRNA expression in nudem ice m ode.l
Keyw ords: fu fang teng ligen m ix tu re; ga stric cance r; nude m ice; heparanase gene; m e tasta sis
复方藤梨根制剂由藤梨根、虎杖根、水杨梅根、党参、白
术、茯苓等纯中药材组成, 其中藤梨根为猕猴桃科猕猴属植
物硬毛中华猕猴桃的根, 始载于 5开宝本草6, 其性味苦、
寒,具有清热解毒活血的功效 ,临床上常用于防治消化道肿
瘤。近些年的一些文献报道及其前期课题组的研究证实,
复方藤梨根制剂具有较好的抗肿瘤及抑制肿瘤转移。但其
确切的作用机制尚未完全阐明。乙酰肝素酶 ( Heparanase,
HPA )是新近克隆出来的一种内切糖苷酶,它编码的蛋白被
认为是唯一降解硫酸乙酰肝素蛋白多糖 ( Heparan Sulfa te
P roteogcyean, HSPG )的硫酸乙酰肝素 ( H epa ran Su lfate, HS)
侧链侧链的核苷内切酶, 对肿瘤的侵袭和转移具有重要作
用 [1 - 2], 是目前肿瘤研究的热点之一。本研究以 SGC -
7901胃癌细胞株建立裸鼠原位转移模型, 观察复方藤梨根
制剂对胃癌细胞转移及其乙酰肝素酶 mRNA表达的影响。
现报道如下。
1 材料与方法
1. 1 细胞及培养体系
SGC -7901胃癌细胞株由上海细胞生物研究所提供。
培养条件: 10% 小牛血清 RPM I - 1640培养液、5% CO2恒
温孵育箱、温度为 36. 5e , 湿度为 100%。
1. 2 动物
雄性 BALB /C nu /nu裸鼠, 由浙江中医药大学实验动
物中心提供,鼠龄 5~ 6周,体重 21g左右, 其实验和饲养均
在 SPF条件下的超净层流架中进行, 灭菌水和饲料供动物
自由摄入。
1. 3 药物
复方藤梨根制剂由藤梨根、虎杖根、水杨梅根、党参、白
术、茯苓等纯中药材组成, 由浙江中医药大学中药浓缩机煎
熬浓缩,经高压灭菌处理,冰箱贮存备用。
1. 4 其它试剂及仪器
试剂: RM PI- 1640细胞培养液 ( G IBCO公司 ); 新生牛
血清 (杭州四季青生物工程材料有限公司 ); 注射用硫酸链
霉素 (大连美罗大药厂 ); 注射用青霉素钠 (华北制药股份
有限公司 ); 0. 25% 胰蛋白酶 (美国 Sigma公司 ) ;医用吻合
型 OB胶 (广州白云医用胶有限公司 )。主要仪器: 荧光定
量 PCR ( Pe rkin E lm er公司生产 ); 电泳仪 ( B io Rad Inc,
USA ); 凝胶成像仪 ( Bio Rad Inc, USA )。
1. 5 方法
1. 5. 1 皮下移植瘤模型的建立与传代 参照笔者课题组
前期建立的人类胃癌裸鼠原位移植模型的建立的方法 [3 ],
通过以下几个步骤完成:第一 :收集体外培养的对数生长期
的 SGC - 7901胃癌细胞,制成细胞混悬液, 调节细胞数为 1
@ 107 /L。第二:将胃癌细胞悬液接种到 3只裸鼠 ( 5 ~ 6
周 )右前腋部皮下, 每只裸鼠接种 0. 2mL。第三: 1个月后,
皮下肿瘤直径长至 1. 0cm 左右, 于无菌条件下剥取瘤体,
剪切成 1. 5mm的小块, 再接种至新一代裸鼠皮下; 如此反
复进行鼠间传代,每代 3只, 共 8代。第四:传至第 8代时,
无菌条件下剥取瘤体, 剪切成 1. 5mm 左右的小块, 用于后
续的原位移植瘤模型。
1. 5. 2 人胃癌裸鼠原位移植瘤模型 笔者使用出血少、
移植成功率高的捆扎联合 OB胶法。其具体操作步骤: 所
有裸鼠术前禁食 6h,常规消毒皮肤, 用 0. 6%的戊巴比妥钠
腹腔注射麻醉 ( 50m g /kg)。正中旁左侧切口, 打开腹腔后
将胃拉出 ,用手术刀片轻轻划伤胃大弯前壁浆膜层, 分离浆
膜暴露浆膜下组织。用 5 - 0肠溶丝线把被移植的肿瘤组
织捆扎固定于胃壁上, 使大部分肿瘤组织与胃壁接触。用
医用 OB胶涂于表面。 10 s后固化成膜,最后以 4 - 0丝线
分别缝合腹膜 (含肌层 )及皮肤。精心饲养观察。
1周后, 24只裸鼠按随机数字表随机分为 4组, 即生理
盐水组 (每天灌服生理盐水 0. 6mL /只 )、复方藤梨根低剂
量 (每天灌服制剂 0. 6mL /只, 含生药 0. 3g ), 中剂量组 (每
天灌服制剂 0. 6m L /只, 含生药 0. 6g)和高剂量组 (每天灌
服制剂 0. 6mL /只,含生药 1. 2g ),每组 6只,连续 21天口服
灌注治疗。待裸鼠自然衰竭或死亡后解剖裸鼠观察肝、肺
等转移情况并记录其生存期,生理盐水组裸鼠全部死亡后,
同期处死其它各组裸鼠,打开腹腔, 取胃壁肿瘤组织及转移
灶存入 -80e 冰箱。
1. 5. 3 观察复方藤梨根制剂对裸鼠胃癌移植瘤转移的影
响 根据胃癌细胞转移的部位进行赋值评分, 来观察统计
复方藤梨根制剂对胃癌细胞转移能力的影响。如肝脏是胃
癌的主要转移部位 [4] ,是影响生存时间的主要参数。给肝
脏转移部位赋值为 2分, 其余部位均为 1分,没有转移者为
0分, 统计比较各个组评分。
1. 5. 4 FQ - PCR检测乙酰肝素酶方法 实验方法: ¹
RNA提取: 取 50m g肿瘤组织放入 1m L研磨器中, 加 0. 8m L
Trizo l匀浆后,按说明书提取 RNA。所得 RNA 溶于焦碳酸
二乙酯 ( DEPC ) 水中,紫外分光光度仪测得 RNA的吸光度
A 260 /A280均在 1. 8~ 2. 0范围内。º cDNA合成: 取 RNA
2Lg,寡脱氧胸苷酸 150. 5Lg, 10nmo l /L dNTP混合液 1LL,
65e 加热 5m in后, 加入 0. 1m ol / L DTT 2LL、RNAsin 40LL、
Super Sc ript Ò 1LL ( G ibco公司 ), 42 e 孵育 50m in, 70 e
加热 15m in,终止反应。所得 cDNA用于 PCR扩增。 »引
物序列和 PCR扩增条件确定: 乙酰肝素酶上游引物 AGA
CCT TTG GGA CCT CAT GGA; 下游引物 GCA ACT TTG
GCA TTT CTT ATC ACA A (宝生物工程有限公司 )。内参
照 B - actin上游引物 CAT GCC ATC CTG CGT CTG GACC;
下游引物 TAC TCC TGC TTG CTG ATC CAC ATC TGC (宝
生物工程有限公司 )。RT - PCR最佳扩增条件为: 94 e 变
性 5 m in, 94 e 30 s, 62 e 30 s, 72 e 15 s, 30个循环, 最后
72 e 延伸 5 m in。¼ FQ -PCR:使用 Tag PCR多聚酶 ( G ib-
co公司 ),在 FQ - PCR仪上以最佳 PCR条件扩增 40个循
环。FQ - PCR仪自动采集信号,并转换为目的基因的扩增
起始拷贝数及荧光信号达到设定域值时所经历的循环次数
( CT值 ) 。
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1. 5. 5 结果判定 乙酰肝素酶 mRNA精确含量 =目的片
段乙酰肝素酶 CT值 /内参照 B - ac tinCT值。
1. 6 统计学处理
计量资料采用单因素方差分析和 t检验,统计学处理
采用 SPSS13. 0统计软件完成。
2 结 果
2. 1 复方藤梨根制剂对裸鼠胃癌移植瘤转移的影响
根据胃癌细胞转移的部位进行赋值评分, 来观察统计
复方藤梨根制剂对胃癌细胞转移能力的影响。结果如图
1、表 1所示,生理盐水组与与低剂量组之间比较无显著性
差异 ( P > 0. 05), 但显著高于中、高剂量组, 有显著性差异
( P < 0. 05)。而高剂量组的赋值评分低于中剂量组, 但无
显著性差异。说明复方藤梨根制剂能够抑制胃癌转移的发
生,并与剂量相关。
2. 2 复方藤梨根制剂对胃癌细胞乙酰肝素酶表达的影响
经 FQ - PCR法检测各个裸鼠组胃癌组织的乙酰肝素
酶 mRNA表达, 结果显示生理盐水组与低剂量治疗组比较
无显著性差异 ( P > 0. 05), 但显著地高于中、高剂量治疗
组 ( P < 0. 05) (见图 2及表 2)。说明复方藤梨根制剂有
抑制乙酰肝素酶 mRNA表达的作用。
表 1 各组胃癌转移部位赋值评分的比较 ( €x ? s)
分组 n 评分
生理盐水组 6 4. 20 ? 2. 17*
低剂量组 6 2. 60 ? 1. 95* *
中剂量组 6 1. 00 ? 0. 71w
高剂量组 6 0. 80 ? 0. 84v
注: * 分别与w和v比较均 P < 0. 05; * 与* * 比较 P > 0. 05。
表 2 各组乙酰肝素酶表达相对含量 ( €x ? s )
分组 n 相对含量值
生理盐水组 6 0. 847 ? 0. 150*
低剂量组 6 0. 751 ? 0. 113* *
中剂量组 6 0. 499 ? 0. 175w
高剂量组 6 0. 401 ? 0. 179v
注: * 分别与w和v比较均P < 0. 05; * 与* * 比较 P > 0. 05。
3 讨 论
肝素酶是一种 B -D -葡萄糖苷酸内切酶, 裂解连接于
硫酸乙酰肝素蛋白多糖 ( H SPGs)核心分子上的硫酸肝素,
与包括胃癌在内的多种肿瘤细胞转移及临床不良预后均密
切相关 [5 ]。本课题组的前期临床研究 [6]、Endo K [7 ]和
TakaokaM等 [5]均报道肝素酶基因的表达水平可作为胃癌
患者预后诊断的指标之一, 并证实胃癌组织中乙酰肝素酶
mRNA的表达高于癌旁和远癌组织,而且它的表达与胃癌
浸润深度、分化程度、肿瘤大小、肿瘤的血管、淋巴管和神经
浸润等病理特征相关, 其表达随肿瘤浸润深度的增加而增
高,侵犯浆膜或浆膜外者明显高于侵犯限于黏膜内者和侵
犯肌层者。众多的基础细胞学试验及动物学研究表明,通
过抑制乙酰肝素酶的表达, 可以显著地抑制肿瘤细胞的转
移、复发 [8]。
本实验研究的复方藤梨根制剂经过长期、大量的临床
实践证实该方对多种恶性肿瘤有较好的疗效, 可改善胃癌
患者的营养状况, 延长生存期 [9 ]。细胞学、免疫学、分子生
物学等方面的前期研究表明该方具有控制原发性肿瘤的生
长、控制肿瘤的远处转移及广泛的免疫调控作用 [10 ], 能诱
导胃癌细胞凋亡 [11 ],对化疗药物的减毒增效作用 [12 ], 但其
确切的作用机制目前尚未完全阐明。那么, 乙酰肝素酶是
否为复方藤梨根制剂的抑制肿瘤作用靶点之一, 从而实现
其抑制肿瘤生长及转移的作用, 是本研究的关注的核心问
题。
通过人胃癌细胞原位移植瘤裸鼠动物研究证实, 灌服
藤梨根制剂后可以改善裸鼠的营养状况,延长其生存期, 并
可抑制肿瘤细胞原位移植接种后的局部浸润及远处转移。
进一步分子生物学实验证实, 在复方藤梨根制剂中高剂量
组,肿瘤组织的乙酰肝素酶 mRNA表达水平明显减低 ( P
< 0. 01)。结果提示复方藤梨根制剂可能是通过下调乙酰
肝素酶 mRNA表达来抑制胃癌细胞的远处转移, 发挥其抗
肿瘤作用的。笔者下一步拟借助 siRNA技术干扰阻断胃
癌细胞株乙酰肝素酶 mRNA表达, 观察复方藤梨根制剂对
其表达的影响,以进一步证实复方藤梨根制剂抑制胃癌细
胞远处转移的机制。
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