全 文 ：全科医学临床与教育 2010 年 1 月 第 8 卷第 1 期 Clinical Education of General Practice Jan． 2010, Vol．8, No．1
·基础研究·
复方藤梨根制剂抑制胃癌转移与 MMP-9、
TIMP-1和 E-cad表达的关系研究
方勇 秦建岭 郭勇 潘宏铭
基金资助： 浙江省卫生厅中医药青年基金研究计划项目
资助（2005A12）
作者单位：310016 浙江杭州，浙江大学医学院附属邵逸
夫医院肿瘤内科（方勇、潘宏铭）；浙江中医药大学附属医院肿
瘤科（秦建岭、郭勇）
[摘 要] 目的 观察复方藤梨根制剂对胃癌细胞 MMP-9、TIMP-1 和 E-cad 蛋白表达的影响，探讨其抗胃癌
细胞转移的作用机制。 方法 以 SGC-7901 胃癌细胞株建立胃癌裸鼠原位移植瘤模型，将裸鼠随机分为 0.9%
氯化钠溶液组（对照组）、复方藤梨根制剂低剂量、中剂量及高剂量组，接受连续 21 d 灌服治疗。 待裸鼠衰竭或
死亡后解剖观察肿瘤转移等情况； 用免疫组化方法检测肿瘤组织中 MMP-9、TIMP-1 和和 E-cad 蛋白表达的
变化。结果 根据胃癌裸鼠动物模型的转移部位进行赋值评分，氯化钠溶液与中、高剂量组比较差异有统计学
意义（F＝5.15，P<0.05），与低剂量组之间比较差异无统计学意义（F=1.27，P>0.05）。 经免疫组化法检测，对照组
的胃癌细胞的 MMP-9 明显高于中、高剂量复方藤梨根制剂组（F=3.86，P<0.05）；对照组的胃癌细胞的 TIMP-1
蛋白表达明显低于中、高剂量复方藤梨根制剂组（F=4.30，P<0.05）；而 E-cad 表达各组之间差异无统计学意义
（F=0.41，P>0.05）。 结论 复方藤梨根制剂可能是通过下调 MMP-9 和上调 TIMP-1 的途径发挥抗胃癌转移作
用；而对 E-cad 的异常表达没有明显调节作用。
[关键词] 复方藤梨根制剂； 胃癌； 转移； MMP-9； TIMP-1
Relationship study among MMP-9, TIMP-1 and E-cad with the inhibition of metastasis activity of gastric
cancer induced by Fufang Tengligen mixture FANG Yong, QIN Jianlin, GUO Yong, et al. Department of
Medical Oncology, Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310016, China
[Abstract] Objective To study and explore the effects on the expression of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9),
tissue inhibitor of metalloproteinase -1 (TIMP-1) and E-cadherin (E-cad), and the possible mechanisms on the
metastasis of gastric cancer by Fufang Tengligen mixture(FFTLM). Methods The nude mice with the original gastric
cancer transplant mode of SGC-7901 gastric cancer cell line were randomized into saline control group, low dose
group of FFTLM, middle dose group of FFTLM and high dose group of FFTLM and accepted 21 days of oral infusion
treatment. The tumor metastasis situation were observed and recorded after the dissecting of the dead nude mice.
The expression of MMP-9, TIMP-1 and E-cad in the tumor tissue was detected by immunohistochemistry. Results
After recorded and counted the score of the metastasis organ, a significant difference was observed between the saline
control group and the middle, high dose group of FFTLM respectively (F＝5.15， P<0.05). And theres no significant
difference between the saline group and the low dose group (F =1.27, P >0.05). The expression of the MMP -9
increased greatly in the saline control group compared with that in the middle, high dose group of FFTLM (F=3.86,
P<0.05). Meanwhile, the expression of the TIMP-1 decreased markedly in the saline control group compared with that
in middle, high dose group of FFTLM(F=4.30，P<0.05). But for the expression of the E-cad, there were no statistically
differences among the four groups (F=0.41，P>0.05). Conclusions The inhibition of metastasis by compound FFTLM
was by down -regulation of the expression of MMP -9, up -regulation of the expression of TIMP -1, and without
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DOI:10.13558/j.cnki.issn1672-3686.2010.01.048
全科医学临床与教育 2010 年 1 月 第 8 卷第 1 期 Clinical Education of General Practice Jan． 2010, Vol．8, No．1
significant effects on the expression of E-cad.
[Key words] Fufang Tengligen mixture; gastric cancer; metastasis; matrix metalloproteinase -9; tissue
inhibitor of metalloproteinase-1
复方藤梨根制剂配方由藤梨根、虎杖根、水杨
梅根、党参、白术、茯苓等纯中药材组成。 经长期、大
量的临床实践, 证实它能有效降低消化道肿瘤包括
胃癌患者的复发和转移率， 改善患者生存质量, 延
长患者生存期。 但其确切的作用机制及靶点尚未明
确[1,2]。 肿瘤侵袭转移是引起恶性肿瘤患者预后不良
和死亡的主要原因。 肿瘤细胞分泌的多种蛋白水解
酶对细胞外基质降解是肿瘤侵袭转移过程的一个
重要环节 ， 在此环节中基质金属蛋白酶 （matrix
metalloproteinase, MMPs） [3]、 金属蛋白酶抑制剂
（tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMPs） [4] 发挥
着重要要作用。钙粘蛋白（E-cadherin，E-cad）[5]介导
细胞与细胞间互相粘附的同质型钙依赖型跨膜糖
蛋白， 对上皮组织的形成和维持起着关键作用，与
肿瘤的转移密切相关。 本次研究采用捆扎法和医用
OB 胶联合法建立人胃癌原位移植裸鼠转移模型，
研究复方藤梨根制剂对胃癌细胞的 MMP-9、TIMP-
1和 E-cad蛋白表达的影响， 探讨其抗胃癌细胞转
移的可能作用机制。
1 材料与方法
1.1 细胞及培养体系 SGC-7901胃癌细胞株由上
海细胞生物研究所提供。 培养条件：10%小牛血清
RPMI-1640 培养液、5% CO2 恒温孵育箱、 温度为
36.5℃，湿度为 100％。
1.2 动物 雄性 BALB/C nu/nu 裸鼠， 由浙江中医
药大学实验动物中心提供， 鼠龄 5～6 周， 体重 21g
左右。 实验和饲养均在无特殊病原体 （specific-
pathogen free，SPF）条件下的超净层流架中进行，灭
菌水和饲料供动物自由摄入。
1.3 药物 复方藤梨根制剂由藤梨根、 虎杖根、水
杨梅根、党参、白术、茯苓等纯中药材组成，由浙江
中医药大学中药浓缩机煎熬浓缩， 经高压灭菌处
理，冰箱贮存备用。
1.4 其它试剂及仪器 试剂：MMP-9、TIMP 和 E-
cad 免疫组化染色试剂盒 （美国圣克鲁兹生物技术
公司）；S-P免疫组织化学试剂盒 （北京中山生物技
术有限公司）；RMPI-1640 细胞培养液和新生牛血
清（美国 GIBCO 公司）；注射用硫酸链霉素（大连美
罗大药厂）；注射用青霉素钠（华北制药股份有限公
司）；0.25％胰蛋白酶（美国 Sigma 公司）；医用吻合
型 OB胶（广州白云医用胶有限公司）。
1.5 方法
1.5.1 胃癌原位移植瘤模型的建立与传代 参照
课题组前期建立的人类胃癌裸鼠原位移植模型的
建立的方法[6]，收集体外培养的对数生长期的 SGC-
7901 胃癌细胞（细胞混悬液 1×107/L）0.2 ml 接种到
裸鼠右前腋部皮下，反复进行鼠间传代，共 8代。 分
离瘤体， 采用捆扎联合 OB 胶移植法建立原位移植
瘤模型[6]。 一周后，24 只原位移植瘤裸鼠随机分为 4
组，每天每只灌服 0.6 ml 药物连续 21 d。 根据前期
动物预实验的结果， 按成年人一日剂量 10～15 倍，
换算成裸鼠等效剂量，即分为灌服 0.9%氯化钠溶液
组（对照组）、复方藤梨根低剂量组（含生药 0.3 g），
中剂量组（含生药 0.6 g）和高剂量组（含生药 1.2 g）。
待裸鼠自然衰竭或死亡后解剖裸鼠，观察并记录裸
鼠体内肿瘤转移情况。 根据转移的部位进行赋值评
分是一种比较合理的方法 [7，8]。 因此，肝脏转移部位
赋值为 2 分， 其余部位均为 1 分， 没有转移者为 0
分，然后比较各组评分，并且进行统计学处理。 取胃
壁肿瘤组织及转移组织进行石蜡包埋或存入－80℃
冰箱。
1.5.2 免疫组织化学法检测胃癌组织 MMP-9、
TIMP 和 E-cad 的表达 采用 S-P 法， 各组胃癌肿
瘤组织切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化后置于
枸椽酸缓冲液中微波加热至 92～98℃ 15 min 以修
复抗原，冷却至室温后依次按说明书完成免疫染色
步骤。 用已知阳性片作阳性对照，用 PBS 代替一抗
作阴性对照。
1.5.3 结果判断 用已证实的 MMP-9、TIMP-1 和
E-cad细胞切片作阳性对照。结果判定标准： MMP-
9 和 TIMP-1 阳性表达细胞的细胞浆有棕黄色颗粒
沉着。 E-cad细胞浆呈棕黄色或细胞膜不连续染色
为异常表达。 染色切片在显微镜放大 400 倍下，随
机选取 10 个视野，观察染色情况，记数每个视野中
的阳性细胞数。
1.6 统计学方法 采用 SPSS 13.0统计软件。 计量
资料采用单因素方差分析和 t 检验。 设 P<0.05 为差
异有统计学意义。
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全科医学临床与教育 2010 年 1 月 第 8 卷第 1 期 Clinical Education of General Practice Jan． 2010, Vol．8, No．1
2 结果
2.1 复方藤梨根制剂对裸鼠胃癌移植瘤转移的影
响见表 1
由表 1 可见， 经解剖观察 24 只裸鼠胃壁均有
肿瘤生长，一部分裸鼠出现肝、肺、胸腔和腹腔等转
移。 对照组与中、高剂量组比较差异有统计学意义
（F=5.15，P<0.05），与低剂量组之间比较差异无统计
学意义（F=1.27，P>0.05）。
2.2 复方藤梨根制剂对胃癌细胞 MMP-9、TIMP-1
和 E-cad表达的影响见表 2
由表 2 可见 ， 对照组胃癌细胞 MMP-9 和
TIMP-1 表达的阳性细胞数与中、 高剂量组比较均
差异有统计学意义 （F 分别=3.86、4.30，P 均<0.05）
（见封二图 1、2）。各组之间的胃癌细胞 E-cad表达，
经比较差异无统计学意义（F=0.41，P>0.05）（见封二
图 3）。
3 讨论
复方藤梨根制剂主要由藤梨根、 水杨梅根、虎
杖根、党参、白术、茯苓等组成。 藤梨根具有健胃、清
热解毒、消痈医疡之功效；虎杖以根茎入药，具有清
热解毒、祛痰止咳、活血化瘀之功效；水杨梅根具有
清热解毒、消肿止痛之功效。 方用藤梨根为君药，取
其能清热解毒消毒瘤，所用水杨梅根和虎杖根为臣
药，能加强藤梨根抗毒瘤之效，并具有祛痰、消肿和
散瘀功效，使瘤消、痰化、血脉畅；方中所用党参、白
术、茯苓具有健脾益气之功能；综观药方，具有祛除
毒邪和扶助正气之功效， 从而达到抗肿瘤的效果。
但对于复方藤梨根制剂抑制肿瘤细胞转移的作用
及其可能机制还鲜有研究。
肿瘤细胞需要穿过细胞外基质侵入血管，才能
转移到达远处器官。 ECM 的降解依靠蛋白水解酶，
其中最为重要的是基质金属蛋白酶（MMP）。MMP活
化是一种复杂的生物学过程，Burlaka 等 [9]发现肿瘤
细胞内活性氧自由基和一氧化氮的增加导致肿瘤
细胞 MMP-9、MMP-2 的活化。 MMP-9 可以通过血
管内皮生长因子的释放参与肿瘤血管的形成，还参
与募集骨髓来源细胞到达肿瘤间质，促进肿瘤新生
血管的形成和肿瘤生长 [10]。 研究结果提示，MMP-9
在人胃癌侵袭和转移过程中起着重要作用，是胃癌
生物学行为中新的标志物。 王凤安等 [11]和高阳等 [12]
都分别用免疫组化法证实胃癌组织中 MMP-9 表达
与肿瘤细胞增殖指数、恶性程度、淋巴结转移以及
肿瘤侵袭性呈正相关。 本次研究通过裸鼠动物模型
和免疫组化法证实， 胃癌细胞 MMP-9 的表达对照
组与复方藤梨根制剂低剂量组比较差异无统计学
意义，与复方藤梨根制剂中、高剂量组比较差异有
统计学意义（P＜0.05）。 这说明了复方藤梨根制剂能
够抑制胃癌细胞 MMP-9 的表达， 其抗胃癌转移的
部分机制是通过下调 MMP-9表达发挥作用的。
TIMPs 为 MMPs 特异性组织抑制因子， 能与
MMPs催化中心的 Zn2+结合，封闭其催化活性。 作为
MMP-9 的天然抑制剂，TIMP-1 在细胞外基质中与
MMP-9之间存在着微妙的平衡关系，在胃癌细胞的
移行、侵袭转移及细胞外基质的重建过程中均有着
重要的作用[13]。 Seo 等[14]以及杜华贞等[15]以免疫组化
的方法检测了胃癌切除术后肿瘤组织中 TIMP-1 蛋
白的表达，证实在伴有癌旁组织浸润及淋巴结转移
的患者标本中，TIMP-1 的表达是水平显著增加，认
为 TIMP-1 的表达可以判断胃癌恶性行为及临床预
后的一项重要生物学指标。 本次研究结果显示，复
方藤梨根制剂中、 高剂量组的胃癌细胞 TIMP-1 表
达均显著高于对照组和复方藤梨根制剂低剂量组，
说明了复方藤梨根能够提高胃癌细胞的 TIMP-1 表
达。 其抗胃癌转移的部分机制是通过上调 TIMP-1
表达而起作用的。
E-cad 是一种重要的细胞粘附分子和信号转导
分子, 参与组织形态发生、 胚胎发育和细胞转归过
程。 近年来发现它与肿瘤的发生发展有密切关系，
E-cad介导的细胞粘附系统在肿瘤的侵袭及转移中
起着重要的作用。 E-cad 基因启动子区域单核苷酸
组别 n 肝 肺 胸腔 肠系膜 血性腹水 赋值评分
低剂量组 6 3 1 2 2 2 2.60±1.95
中剂量组 6 1 1 0 1 1 1.00±0.71*
高剂量组 6 1 0 0 1 1 0.80±0.84*
对照组 6 4 3 3 4 3 4.20±2.17
表 1 各组裸鼠转移部位情况以及胃癌转移部位赋值
评分的比较/例
注：*：与对照组比较，P＜0.05。
组别 n E-cad MMP-9 TIMP-1
低剂量组 6 54.83±10.82 48.67±14.02 43.33±11.36
中剂量组 6 50.50± 8.89 34.50±19.12* 58.83±12.83*
高剂量组 6 51.50± 9.47 30.67±18.00* 62.17±14.05*
对照组 6 57.17±16.42 59.00±13.25 38.00±16.69
表 2 复方藤梨根制剂对胃癌细胞 E-cad、MMP-9和
TIMP-1表达情况的影响（阳性细胞数/高倍视野）
注：*：与对照组比较，P＜0.05。
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的多态性与胃癌的发生和发展有一定的相关性 [5]。
但有学者报道 E-cad 与肿瘤发生的关系可能更为
密切[16]。研究表明[17]E-cad表达下调或缺失的胃癌发
生淋巴结转移的频率显著高于 E-cad 表达基本正
常者。 本次研究结果显示各组之间 E-cad异常表达
差异无统计学意义， 说明了复方藤梨根制剂对 E-
cad 表达没有影响， 其抗胃癌转移机制主要不是通
过调节 E-cad而实现的。
本次研究初步证实， 复方藤梨根制剂可以抑制
原位胃癌移植瘤裸鼠动物模型的肿瘤细胞转移，其
作用机制可能与下调胃癌细胞的 MMP-9 和上调
TIMP-1 的表达相关， 而对 E-cad 的表达没有明显
影响。由于客观原因也存在不足部分，如没有对原位
肿瘤和转移灶部位的基因表达进行对照性研究。 需
要对复方藤梨根制剂的抗肿瘤转移的作用机制进行
深入探讨和研究。
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（收稿日期：2009-08-23）
（本文编辑 王劲）
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