全 文 ：参考文献:
［1］ Tazuma S． Gallstone disease:Epidemiology，pathogenesis，and classifi-
cation of biliary stones (common bile duct and intrahepatic)［J］． Best
Pract Ｒes Clin Gastroenterol，2006，20(6) :1075．
［2］ Ｒygiel KA，Ｒobertson H，Marshall HL，et al． Epithelial － mesenchymal
transition contributes to portal tract fibrogenesis during human chronic
liver disease［J］． Lab Invest，2008，88(2) :112．
［3］ 唐乾利，刘祖军，伍松合，等．大黄灵仙胶囊降低胆石症术后残石率
及复发率疗效观察［J］．新中医，2002，34(6):17．
［4］ Schiffer M，von Gersdorff G，Bitzer M，et al． Smad proteins and trans-
forming growthfactor － β signaling［J］ ． Kidney Int Suppl，2000，58:
S45．
［5］ Ｒygiel KA，Ｒobertson H，Burt AD，et al． Demonstration of the transition
of intrahepatic biliary epithelia cells to fibroblasts during chronic inflam-
matory liver diseases［J］． J Hepatol，2006，45:S241．
［6］ Ｒobertson H，Xu X，Burt AD，et al． Epithelial to mesenchymal transition
in chronic cholestatic liver disease［J］． J Pathol，2005，207:30A ．
［7］ Kelley T J，Elmer H L，Corey D A． Ｒeduced Smad3 protein expression
and altered transforming growth factor － beta1 － mediated signaling in
cystic fibrosis epithelial cells［J］． Am J Ｒespir Cell Mol Biol，2001，25
(6) :732．
［8］ 牛兵占，侯仙明，黄帝内经灵枢［M］．北京:中医古籍出版社，2009:
237．
收稿日期:2013-10-27; 修订日期:2014-06-24
基金项目:国家自然科学基金(No． 81260632);
国家自然科学基金(No． 81102350)
作者简介:于冬梅(1988-)，女(汉族)，黑龙江佳木斯人，大理学院硕士研
究生，主要从事天然来源植物抗肿瘤研究工作．
* 通讯作者简介:李春艳(1983-)，女(白族)，云南云县人，大理学院讲师，
硕士学位，主要从事天然来源植物抗肿瘤研究工作．
云南松松塔提取物对人肝癌细胞增殖的影响
于冬梅，李冬梅，刘 熙，丁 云，李春艳*
(大理学院药学与化学学院，云南 大理 671000)
摘要:目的 研究云南松松塔乙醇提取物(YN － DEF)体外对人肝癌细胞的作用。方法 采用四甲基偶氮唑盐比色法
(MTT法)，观察云南松提取物对肝癌细胞(HEPG2、Huh － 7)增殖的影响及对正常肝细胞(L － 02)的作用。结果 与阴性
对照组比较，在浓度 1000μg /ml，72h 时，YN － DEF 对 HEPG2、Huh － 7 的抑制率分别为 72． 55%、60． 66%，且抑制作用均
呈浓度依赖性;正常肝细胞(L － 02)与不同浓度为 YN － DEF 共同孵育 72h 后，高浓度下(1000μg /ml)的存活率为
73． 51%。结论 云南松松塔乙醇提取物(YN － DEF)具有抑制肝癌细胞增殖的作用，高浓度下对正常肝细胞毒性小。
关键词:云南松; 松塔; 提取物; 抗肿瘤
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2014． 12． 007
中图分类号:Ｒ962 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2014)12-2835-03
The effect of proliferation on hepatocellular carcinoma cells from pinecone extract of Pi-
nus yunnanenis Fr．
YU Dong-mei，LI Dong-mei，LIU Xi，DING Yun，LI Chun-yan*
(College of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China)
Abstract:Objective To study the proliferation effect on hepatocellular carcinoma cells with alcohol extract from pinecone of Pi-
nus yunnanenis Fr． (YN － DEF)in vitro． Methods To observe YN － DEF on the influence of hepatocellular carcinoma cells
(HEPG2，Huh － 7)and the effect of the normal human liver(L － 02)cell by MTT method． Ｒesults To compare with the negative
control group，under the concentration 1000μg /ml，the inhibition ratio of HEPG － 2，Huh － 7 proliferation with YN － DEF were
resptctively 72． 55%，60． 66% in 72h;After co － incubation with the normal human liver cell and the different concentrations YN
－ DEF ，the livability of normal human liver cell was 73． 51% under the concentration 1000μg /ml． Conclusion It had a inhibition
on hepatocellular carcinoma cells，and had low cytotoxicity with alcohol extract from pinecone of Pinus yunnanenis Fr．
Key words:Pinus yunnanenis Fr．; Pinecone; Extracts; Anti － cancer
肝癌是指发生于肝脏的恶性肿瘤，全世界每年新发肝癌患者
约 60 万，而中国每年大约有 13 万人死于肝癌［1］，占全球肝癌死
亡总数的 40%。目前临床上治疗肝癌常用手术、化疗和放疗的
方式，但是由于肝癌被发现时多为晚期且术后复发率较高，因此
手术切除的比例并不高，而放疗与化疗效果不太理想并且在杀灭
癌细胞的同时对患者机体也会造成损害，因此加强对抗肝癌药物
的研究显得尤为迫切。
云南松是松属科松属植物，主要分布于云南，资源十分丰富。
松塔是其球果，别名松实、松元、松果、松球。松塔药用历史悠久，
《本草纲目》中记载了松塔具有抗病毒、祛痰、止咳平喘、祛风、润
肠、安神等功效［2］。现代药理研究发现，松属植物松塔所含化学
成分结构多，药理作用广泛，具有抗病毒(HIV)、抗氧化和增强免
疫等作用的多种活性成分［3 ～ 5］。近年来有文献报道［6，7］云南松
提取物具有一定抗癌活性，如日本白松松塔的水提取物可抑制移
·5382·
LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 12 时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 12 期
植于小鼠的腹水瘤及实体瘤细胞生长，且呈剂量依赖性［8］，又如
Nagasawa等［9，10］报道称日本白松松塔提取物能使小鼠乳汁中鼠
乳房肿瘤病毒的含量降低。但未曾见对肝癌药理活性及毒性方
面的研究，因此本文以两株肝癌细胞(HepG2、Huh － 7)和一株正
常肝细胞(L0 － 2)为研究对象，初步探讨云南松松塔乙醇提取物
(YN － DEF)的体外抗肿瘤及毒性作用，为云南松松塔抗肿瘤机
制的进一步研究及云南松的药用开发提供理论依据。
1 仪器与材料
1． 1 仪器 无菌操作台(Yj － 1450 型)购自苏州安泰空气技术有
限公司;倒置相差显微镜(Olympus IX － 7 型);水套式 CO2 细胞
培养箱购自美国 thermo公司;高压灭菌器(Es － 315 型)购自日本
Tomykogyo公司;连续波长酶标仪购自 BIO － Tek公司。
1． 2 材料 YN － DEF:云南松松塔采自大理州漾濞县，经大理学
院生药教研室夏从龙教授鉴定为松科属植物云南松 Pinus yun-
nanensis Fr． 的松塔。YN － DEF 为云南松松塔乙醇提取物;DDP
(顺铂):粉针剂(山东罗欣药业股份有限公司);DMEM 培养基及
胎牛血清(FBS)购自 Gibco公司;0． 25%胰蛋白酶购自 Thermo公
司;噻唑蓝(MTT)、Hepes 和二甲基亚砜(DMSO)购自 Sigma 公
司。0． 22μm微孔滤膜购自 Millipore公司。
1． 3 细胞株 HepG2、Huh － 7:人肝癌细胞，L0 － 2:正常人肝细
胞，均购自中国科学院昆明动物研究所细胞库。
2 方法
2． 1 样品配制 将 YN － DEF粉末及 DDP用含 10%灭活 FBS 的
DMEM培养基(含 HEPES4． 746 g /L，青霉素 100 mg /L，链霉素
100mg /L)超声溶解，配制成浓度为 1mg /ml 的溶液，用 0． 22μm
的滤膜过滤后，梯度稀释成终浓度为 250，62． 5，15． 63，3． 91，0． 98
μg /ml的样品溶液，并设置 10%灭活胎牛血清的 DMEM 溶液为
空白对照组。
2． 2 细胞接种 HepG2、Huh － 7、L0 － 2 分别用含 10%灭活 FBS
的 DMEM培养基在 37℃、5% CO2 培养箱中培养，取对数生长期
的上述 3 株细胞，用 0． 25%胰酶消化后，离心，弃去上清液，用完
全培养基将细胞浓度调至 1 × 105 个 /ml，接种于 96 孔板，每孔
100μl，置于 37℃、5%CO2 培养箱中培养过夜。
2． 3 YN － DEF对 HepG2、Huh － 7 癌细胞增殖的影响 取已培养
过夜的 HepG2、Huh － 7 培养板，弃去上清液，分别在每个实验孔
中加入不同浓度的 YN － DEF样品溶液，每个浓度设 4 个复孔，同
时设置阳性对照组(DDP)、阴性对照组和空白对照组。放入
37℃，5%CO2 培养箱中培养 72 h 后，弃去上清液，加入 5mg /ml
的 MTT溶液 20μl /孔，继续培养 4 h 后，分别加入 DMSO 溶液
150μl /孔，待紫色结晶溶解后，在 λ570检测各孔 OD 值，按下式计
算抑制率。
抑制率(%)= 100 ×［1 － (OD实验 － OD空白)/(OD阴性 －
OD空白)］
2． 4 YN － DEF对 L0 － 2 细胞毒性作用 取已培养过夜的 L0 － 2
培养板，弃去上清液，加入浓度梯度 YN － DEF 溶液，每个浓度设
置 4 个复孔，同时设置阴性对照组和空白对照组。将 96 孔板置
于 37℃，5% CO2 培养箱中培养 72 h 后，弃去上清液，每孔加入
5mg /ml MTT 20μl，继续培养 4 h 后，再分别加入 DMSO 溶液 150
μl，待紫色结晶溶解后，在 λ570检测各孔 OD 值，按下式计算出存
活率。
存活率(%)= 100 ×(OD实验 － OD空白)/(OD阴性 － OD空白)
2． 5 统计学处理 实验数据均采用 SPSS(17． 0)统计软件进行处
理，数据以 珋x ± s表示，各组数据进行 t检验。
3 结果
3． 1 云南松松塔乙醇提取物作用 72h 时对 HepG2 增殖的影响
YN － DEF72h时对 HepG2 增殖的影响结果见表 1。从表 1 中可
知，与阴性对照组比较，阳性药物顺铂在浓度 1000 ～ 15． 63μg /ml
对 HepG2 细胞均有抑制作用(P ＜ 0． 01)，且抑制作用表现出浓
度依赖性;YN － DEF在高浓度下(1000μg /ml)，与阴性对照组比
较，HepG2 细胞的增殖被抑制，其抑制作用具有统计学差异(P ＜
0． 01)，在 250μg /ml时，其对 HepG2 的抑制作用减弱。
表 1 作用 72h时 YN － DEF对 HepG2 增殖作用的影响(珋x ± s)
样品
浓度
/μg·ml －1
抑制率
/%
YN － DEF 1000 72． 55 ± 0． 01＊＊
250 25． 49 ± 0． 03*
62． 5 13． 73 ± 0． 02
15． 63 9． 80 ± 0． 04
3． 91 9． 80 ± 0． 05
0． 98 1． 97 ± 0． 02
DDP 1000 76． 64 ± 0． 01＊＊
250 68． 44 ± 0． 01＊＊
62． 5 63． 93 ± 0． 01＊＊
15． 63 62． 30 ± 0． 02＊＊
3． 91 49． 18 ± 0． 01
0． 98 35． 25 ± 0． 00
阴性 0 0． 00 ± 0． 25
空白 0 0． 00 ± 0． 05
与阴性对照组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01;n = 3
3． 2 云南松松塔乙醇提取物作用 72h 时对 Huh － 7 增殖的影响
从表 2 可知，YN － DEF在 1000 ～ 62． 5μg /ml 时，对肝癌细胞 Huh
－ 7 的抑制率分别为 60． 66%(P ＜ 0． 01)、43． 31%(P ＜ 0． 05)、
42． 65%(P ＜ 0． 05)，其抑制肝癌细胞 Huh － 7 的作用随着浓度的
降低而减少;与阴性对照组比较，顺铂在浓度 3． 91μg /ml时，其抑
制率为 82． 94%(P ＜ 0． 01)。见表 2。
表 2 作用 72h时 YN － DEF对 Huh － 7 增殖作用的影响(珋x ± s)
样品
浓度
/μg·ml －1
抑制率
/%
YN － DEF 1000 60． 66 ± 0． 08＊＊
250 44． 31 ± 0． 11*
62． 5 42． 65 ± 0． 07*
15． 63 8． 53 ± 0． 06
3． 91 4． 50 ± 0． 16
0． 98 － 4． 73 ± 0． 13
DDP 1000 87． 44 ± 0． 00＊＊
250 86． 73 ± 0． 00＊＊
62． 5 84． 60 ± 0． 00＊＊
15． 63 84． 36 ± 0． 00＊＊
3． 91 82． 94 ± 0． 00＊＊
0． 98 24． 88 ± 0． 02
阴性 0 0． 00 ± 0． 42
空白 0 0． 00 ± 0． 06
与阴性对照组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01;n = 3
3． 3 云南松松塔乙醇提取物作用 72h 时对 L － 02 细胞的毒性作
用 从表 3 中结果可知，与不同浓度梯度的 YN － DEF 共同孵育
72 h后，高浓度下(1000μg /ml)，L － 02 细胞的存活率为73． 51%，
其余浓度梯度下，对 L － 02 无杀灭作用，云南松松塔乙醇提取物
·6382·
时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 12 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 12
对正常人肝细胞毒性小。
表 3 作用 72h时 YN － DEF对 L － 02 细胞的毒性作用(珋x ± s)
样品
浓度
/μg·ml －1
存活率
/%
YN － DEF 1000 73． 51 ± 0． 03*
250 100． 69 ± 0． 04
62． 5 100． 65 ± 0． 03
15． 63 100． 75 ± 0． 04
3． 91 100． 79 ± 0． 05
0． 98 100． 35 ± 0． 05
阴性 0 100． 00 ± 0． 38
空白 0 0． 00 ± 0． 062
与阴性对照组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01;n = 3
4 讨论
原发性肝癌是临床常见的恶性肿瘤之一，素有肿瘤之王的称
号［11］，是死亡率仅次于食道癌和胃癌的第三大恶性肿瘤。肝癌
易复发，即便患者通过手术治疗，也很可能复发。因此寻找新途
径、新技术治疗肝癌，延长患者生存期，提高生命质量、降低复发
率有重要的意义。中医以整体观念根据患者的全身特点辨证论
治，作用于肿瘤的发生和发展等多个环节，在诱导肿瘤细胞凋亡
与分化、抑制肿瘤血管生长以及减轻放化疗不良反应等方面发挥
重要作用，可以适用于各型各期肝癌。因此，从中草药中寻找高
效低毒的抗肿瘤新药具有极其重要的现实意义。
在我国与日本等多个国家，松塔都有着悠久的药用历史。近
年来，国内外已有多位学者对不同松科植物进行了研究。Tanu-
ma等［12，13］对日本五针松 Pinus parviflora的化学成分及药理作用
进行了研究，发现日本五针松松塔中的木质素与糖的结合体具有
抗肿瘤活性。Hiroshi Sakagami等［14］发现赤松、湿地松、火炬松以
及樟子松松塔中的木质素 －糖复合物具有较好的体内抗肿瘤和
抗菌活性。本文从细胞水平探讨了云南松松塔乙醇提取物(YN
－ DEF)对 HepG2、Huh － 7 及 L0 － 2 增殖的影响，由结果可知:
YN － DEF在 1000μg /ml下均对 HepG2、Huh － 7 有增殖抑制作用
(P ＜ 0． 01)，且随着浓度降低，抑制作用减弱。在此浓度下，YN －
DEF对 L0 － 2 正常肝细胞毒性小(L0 － 2 细胞的存活率为
73． 51%)，其余浓度下对 L0 － 2 无毒性作用。表明:云南松松塔
乙醇提取物有抗肝癌细增殖活性，且在高浓度下对正常人肝细胞
毒性小。但具体作用机制需进一步实验研究。
参考文献:
［1］ 黄赞松． 原发性肝癌的非手术治疗进展［J］．中国综合临床，2002，
18(11):966．
［2］ 国家中医药管理局． 中华本草［M］． 上海:上海科学技术出版社，
1999:306．
［3］ 吕小满，胡艳芬，刘光明，等． 松塔化学成分及生物活性的研究进
展［J］．医学综述，2010，16(7):1071．
［4］ 刘光明，吕永俊，李好枝，等． 云南松松塔中抗 HIV 活性成分的研
究初报［J］．大理学院学报，2009，8(2):69．
［5］ 刘中禄，吕铁钢，张永亮． 松子壳多糖对小鼠主要免疫细胞功能的
影响［J］．中国比较医学杂志，2010，20(10):33．
［6］ Süntar，I． Tumen I． Ustün O，et al． Appraisal on the wound healing
and anti － inflammatory activities of the essential oils obtained from the
cones and needles of Pinus species by in vivo and in vitro experimental
models［J］． Ethnopharmacol，2011，139(2) :533．
［7］ 吕永俊，王士贤，彭 芳，等． 红松与油松松塔及松子壳的抗癌活
性［J］．大理学院学报，2008，7(2):1．
［8］ Sakagami H，Ikeda M，Unten S，et al． Antitumor activity of polysaccha-
ride fractions from pine cone extract of Pinus parviflora Sieb et Zucc
［J］． Anticancer Ｒes，1987，7(6) :1153．
［9］ Nagasawa H，Iwai Y，Iwai M，et al． Suppression by a pine cone extract
of pinus parviflora Sieb et Zucc of mammary tumour virus in milk of
mice［J］． Anticancer Ｒes，1992，12(3) :845．
［10］ Nagasawa H，Sakamoto S，Sawaki K． Inhibitory effect of lignin － relat-
ed pine cone extracton cell proliferating enzyme activity of spontaneous
mammary tumours in mice［J］． Anticancer Ｒes，1992，12(2) :501．
［11］ 骆 丹，叶丽红． 中药治疗肝癌在实验研究领域的发展现状及趋
势［J］．世界华人消化杂志，2008，16(26):2964．
［12］ Tanuma，Yasukazu． Lignin － carbohydrate complexes (LCC)with an-
titumor activity［P］． JP．，1990．
［13］ An WW，Kanazawa Y，Ozawa M，et al． Dendritic cell differentiation and
tumor cell apoptosis induced by components of a poly － phenylpropanoid
polysaccharide comples［J］． Anticancer Ｒes，2010，30(2) :613．
［14］ Sakagami H，Kushida T，Oizumi T，et al． Distribution of lignin － car-
bohydrate complex in plant kingdom and its functionality as alternative
medicine［J］． Pharmacol Ther，2010，128(1) :91．
·7382·
LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 12 时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 12 期