全 文 ：收稿日期:2011 － 03 － 23
基金项目:浙江省卫生厅中医药青年基金研究计划资助项目
(2005A12 )
作者简介:徐玲(1980 －) ，女，浙江嘉兴人，医师，硕士，研究方向:
肿瘤内科。
通讯作者:郭勇(1961 －) ，男，浙江杭州人，教授、主任医师，博士研
究生导师、博士后流动站指导教授，研究方向:中药与化
疗、生物治疗结合的基础与临床研究。
要途径。醋酸泼尼松抑制哮喘小鼠气道炎症更明显，但小
鼠体重、毛色，饮食等可见醋酸泼尼松对小鼠有明显不良反
应。温补肾阳汤 +醋酸泼尼松组各项指标改善与单独应用
大剂量醋酸泼尼松组相当，提示哮喘治疗中予以温补肾阳
汤可减轻激素剂量。
参考文献
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第 29 卷 第 8 期
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中 华 中 医 药 学 刊
CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
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复方藤梨根制剂对胃癌细胞乙酰肝素酶、
基质金属蛋白酶 － 9 mRNA表达的影响
徐玲1，郭勇2，秦建领3，方勇4，潘宏铭4
(1．浙江省中西医结合医院肿瘤内科，浙江 杭州 310003;2．浙江中医药大学附属第一医院肿瘤内科，浙江 杭州 310006;
3．郑州市第三人民医院，河南 郑州 450000;4．浙江大学医学院附属邵逸夫医院肿瘤内科，浙江 杭州 310016)
摘 要:目的:探讨复方藤梨根制剂抑制胃癌转移机制。方法:建立裸鼠胃癌腹腔移植瘤模型 24 只，随机分
成生理盐水组、复方藤梨根制剂低剂量、中剂量和高剂量组;18 天后，给予复方藤梨根制剂灌胃 21 天。随后观察
裸鼠生存天数和死亡后肿瘤转移浸润情况;用 RT － PCR方法检测各组肿瘤组织中 HPA、MMP －9 mRNA的表达。
结果:对照组与低剂量治疗组转移部位的赋值评分显著高于中、高剂量组;对照组胃癌细胞的 HPA mRNA表达高
于中、高剂量组(P ＜ 0． 05) ;对照组胃癌细胞的 MMP －9 mRNA表达明显高于各给药组(P ＜ 0． 05)。结论 复方藤
梨根制剂可能通过下调 HPA、MMP －9 基因的表达而抑制胃癌转移并延长生存时间。
关键词:复方藤梨根制剂;胃癌;乙酰肝素酶;基质金属蛋白酶 － 9
中图分类号:R285． 5 文献标识码:A 文章编号:1673 － 7717(2011)08 － 1798 － 03
Effect of Compound TengLiGen Recipe on Gene Expression of
Heparitinase and Matrix Metalloproteinase － 9 in Gastric Cancer Cell
XU Ling1，GUO Yong2，QIN Jian-ling3，FANG Yong4，PAN Hong-ming4
(1． Dept of Medical Oncology，Integrated Chinese and Western Medicine Hospital of Zhejiang Province，Hangzhou310003，Zhejiang，China;
2． Dept of Medical Oncology，The Frist Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310006，Zhejiang，China;
3． Zhengzhou Third People’s Hospital，Zhengzhou 450000，Henan，China;
4． Dept of Medical Oncology，SIR RUN RUN SHAW HOSPITAL Zhejiang University School of Medicine，Hangzhou 3100016，Zhejiang，China)
8971
DOI：10.13193/j.archtcm.2011.08.96.xul.046
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Abstract:ObjectiveTo investagate the mechanism of Compound TengLiGen Recipe on metastasis of gastric cancer．
Method24 models of the intraperitoneal xenografts of nude mouse were randomly devided into saline，low dose group，me-
dium dose group and high dose group． After 18 days，the four groups were treated by Compound TengLiGen Recipe intra-
gastric administration respectively for 21 days，Record the change of number of survival days，and metastasis / infiltrating
status after death． Detect the mRNA expression of HPA ＆ MMP － 9 in the tumor tissue after death． ResultAfter the treat-
ment of 3 weeks，the score of metastasis / infiltrating of control group and low dose grope were higher than medium and
high dose group;the mRNA expression of HPA of control group is higher than medium and high dose group (P ＜ 0． 05) ;
the mRNA expression of MMP － 9 of control group is higher than each treated group (P ＜ 0． 05)． ConclusionCompound
TengLiGen Recipe down regulation the gene expression of HPA and MMP － 9 can be one of the reasons of its effects that
anti － metastasis，prolong the survival time of gastric cancer patients．
Key words:Compound TengLiGen Recipe;gastric cancer;heparitinase;matrix metalloproteinase － 9
复方藤梨根制剂在扶正祛邪治疗原则的指导下组方而
成，由藤梨根、水杨梅根、虎杖根、党参、白术、茯苓等纯中药
组成，具有益气健脾，清热解毒的功效。复方藤梨根制剂体
外细胞学实验证实，可显著抑制肿瘤细胞的增殖［1］。乙酰
肝素酶(HPA)和基质金属蛋白酶 － 9(MMP － 9)是两种重
要的细胞外基质降解酶，被证明与肿瘤转移密切相关。本
研究通过人胃癌裸鼠腹腔移植瘤模型，观察复方藤梨根制
剂对胃癌细胞 HPA、MMP － 9 基因表达的影响，以了解其
抗胃癌转移机制。
1 材料与方法
1． 1 细胞株及实验动物 SGC － 7901 胃癌细胞株邵逸夫
医院中心实验室提供。雄性 BALB /C － nu /nu 裸小鼠 24
只，鼠龄 5 ～ 6 周，体重(20 ± 2)g，购于中科院上海实验动物
中心。
1． 2 药物 由藤梨根、虎杖根、水杨梅根、党参、白术、茯苓
等纯中药材组成，由浙江中医药大学中药浓缩机煎熬浓缩，
经高压灭菌处理，冰箱贮存备用。
1． 3 主要试剂及仪器试剂 RMPI － 1640 细胞培养液
(GIBCO公司) ;新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有
限公司) ;0． 25%胰蛋白酶(美国 Sigma公司) ;TRIZOL RE-
AGENT(美国 Invitrogen公司) ;主要仪器:荧光定量 PCR (
Perkin Elmer公司) ;电泳仪(Bio Rad Inc，USA) ;凝胶成像
仪(Bio Rad Inc，USA)。
2 方 法
2． 1 建立皮下移植瘤模型和传代 收集体外培养的对数
生长期的 SGC － 7901 胃癌细胞(细胞混悬液 1 × 107 /L)0． 2
mL 接种到裸鼠右前腋背部皮下，建立人类胃癌裸鼠皮下
移植模型［2］，反复鼠间传代，共 8 代。
2． 2 建立人胃癌 SGC － 7901 细胞株裸鼠腹腔移植瘤模型
①取第 8 代裸鼠皮下移植瘤，清除坏死组织，放入 RMPI
－ 1640 细胞培养液中，用眼科剪刀将组织约 3mm 大小。
放入玻璃匀浆器，加入 4mL 细胞培养液，在无菌条件下顺
时针研磨，制成细胞悬液，再用 200 目滤过器过滤制成混悬
细胞液，调整浓度至 1 × 106 /mL左右。②抽取 0． 2mL细胞
悬液注入裸鼠腹腔。共注射裸鼠 24 只。注射完后，将裸鼠
饲养于 SPF条件下。
2． 3 实验分组及给药 腹腔移植后，24 只裸鼠随机分为 4
组，接种 18 天后，每天每只灌服 0． 6mL，连续 21 天。根据
前期动物预实验的结果，按成年人 1 日剂量 10 ～ 15 倍，换
算成裸鼠等效剂量，即分为灌服生理盐水组(对照组)、低
剂量组(含生药 0． 3g) ，中剂量组(含生药 0． 6g)和高剂量
组(含生药 1． 2g)。
2． 4 观察及检测指标 观察与解剖即将衰竭或死后裸鼠
肿瘤转移和浸润的情况，并记录各组生存天数;②分离腹腔
肿瘤组织并保存在 － 80℃冰箱;③运用 RT － PCR方法检测
肿瘤组织 HPA、MMP －9mRNA的表达。
2． 5 RT － PCR检测方法 ①RNA提取:取 60 － 80mg肿瘤
组织放入 1mL研磨器中，加 0． 5mL Trizol匀浆后，按说明书
提取 RNA。所得 RNA溶于 DEPC水中，紫外分光光度仪测
得 RNA的吸光度 A 260 /A280 均在 1． 8 ～ 2． 0 范围内。②
cDNA合成，所得 cDNA 用于 PCR 扩增。③引物序列和
PCR 扩增条件:HPA上游引物 5＇－ AGA CCT TTG GGA CCT
CAT GGA －3＇;下游引物 5＇－ GCA ACT TTG GCA TTT CTT
ATC ACA A － 3 ＇。MMP － 9 上游引物 5 ＇ － CTG GTC ATA
AGG GCT AAA T － 3＇;下游引物 5＇－ TCT TGG CGT CAC TTC
TCA － 3＇。GAPDH上游引物 5＇－ TGA TGA CAT CAA GAA
GGT GAA G － 3 ＇;下游引物 5 ＇ － TCC TTG GAG GCC ATG
TGG GCC AT － 3 ＇。HPA 的 PCR 扩增条件:预变性 94℃
2min;变性 94℃ 1min、退火 59℃ 1min、延伸 72℃ 1min，共
30 个循环;最后延伸 72℃ 10min。MMP －9 的 PCR扩增条
件:预变性 94℃ 2min;变性 94℃ 1min、退火 54℃ 1min、延
伸 72℃ 1min，共 30 个循环;最后延伸 72℃ 10min。④电
泳及成像。
2． 6 结果判定 取电泳凝胶图像，用 Quanlity one 图像分
析系统进行光密度扫描分析，以目的产物光密度值与对应
内参光密度值的比值作为该样品中目的产物的相对半定量
值。最后以该比值作为参数进行统计分析。
2． 7 统计学方法 采用统计软件包 SPSS 13． 0 版统计，计
量资料采用单因素方差分析和 t 检验;等级评分资料采用
Mann － Whitney U秩和检验。
表 1 各组裸鼠肿瘤转移部位情况
组别 动物数 肝 肺 胸腔 肠系膜 血性腹水生理
盐水组 6 4 3 3 5 4
低剂量组 6 3 1 2 4 3
中剂量组 6 1 1 0 2 2
高剂量组 6 1 0 0 2 1
3 结 果
3． 1 复方藤梨根制剂对裸鼠人胃癌腹腔移植瘤的影响作
用 见表 1、表 2。
查阅以往文献［3 － 5］。我们认为单器官出现转移，按肿
瘤结节数比较是合适的，而对于多个器官转移，如按行列表
来应用卡方检验进行比较，由于样本量小，产生误差较大。
因此我们对多部位转移进行量化处理，根据转移部位进行
赋值评分。由于转移器官不同，其临床预后差异较大，因此
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我们给肝脏转移赋值为 2 分，其余部位转移均为 1 分，然后
比较各组评分，并且采用 Mann － Whitney U统计学处理。
表 2 各组裸鼠转移转移评分的比较
组别 动物数
转移评
分均值
秩和评分
治疗组 /生理盐水组
秩和检验
P
生理盐水组 6 3． 83 － －
低剂量组 6 2． 67 4． 83 / 8． 17 0． 132
中剂量组 6 1． 17 4． 08 / 8． 92 0． 015*
高剂量组 6 0． 83 3． 92 / 9． 08 0． 009＊＊
注:与生理盐水组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01。
由表 1、表 2 可见，生理盐水组与中剂量和高剂量组比
较差异均有统计学意义(P ＜ 0． 05) ，而与低剂量组比较差
异无统计学意义(P ＞ 0． 05)。提示复方藤梨根制剂能够抑
制胃癌转移的发生。
3． 2 复方藤梨根制剂对荷瘤裸鼠生存期的影响 见表 4。
表 3 各组裸鼠生存时间比较(天)
组别 动物数(只) 生存时间生理
盐水组 6 79． 50 ± 6． 16
低剂量组 6 86． 67 ± 3． 27＊＊
中剂量组 6 88． 00 ± 0． 00＊＊
高剂量组 6 88． 00 ± 0． 00＊＊
注:与生理盐水组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01。
由表 3 可见，应用复方藤梨根制剂的裸鼠生存期明显
长于生理盐水组。生理盐水组与各给药组之间比较差异有
统计学差异(P ＜ 0． 01)。
3． 3 复方藤梨根制剂对胃癌细胞 HPA mRNA表达的影响
见表 5
表 4 各组 SGC － 7901 胃癌荷瘤裸鼠肿瘤组织中
HPA mRNA的表达(珋x ± s)
组别 动物数(只) HPA mRNA /GAPDH mRNA
生理盐水组 6 0． 95 ± 0． 05
低剂量 6 0． 81 ± 0． 12
中剂量 6 0． 65 ± 0． 21＊＊
高剂量 6 0． 53 ± 0． 23＊＊
F = 6． 862，P = 0． 002 ﹤ 0． 01
注:与生理盐水组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01。
由表可见，随着复方藤梨根制剂剂量增加，条带的密度
递减。生理盐水组与低剂量组比较差异无统计学差异(P
＞ 0． 05) ，而与中、高剂量组比较差异有统计学意义(P ＜
0． 01) ，各给药组间比较差异有统计学意义(P ＜ 0． 05)。
3． 4 复方藤梨根制剂对胃癌细胞 MMP － 9 mRNA 表达的
影响 见表 5
表 5 各组 SGC － 7901 胃癌荷瘤裸鼠肿瘤组织中
MMP －9 mRNA的表达(珋x ± s)
组别 动物数(只) MMP －9 mRNA /GAPDH mRNA
生理盐水组 6 0． 94 ± 0． 04
低剂量 6 0． 71 ± 0． 14*
中剂量 6 0． 54 ± 0． 20＊＊
高剂量 6 0． 43 ± 0． 16＊＊
F = 13． 684，P = 0． 000 ﹤ 0． 01
注:与生理盐水组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01。
由表 6，生理盐水组、低、中、高剂量组条带亮度依次变
淡，胃癌细胞 MMP － 9 mRNA 表达有逐渐降低的趋势。生
理盐水组与低剂量组比较差异有统计学意义(P ＜ 0． 05) ，
而中、高剂量组与之比较差异也有统计学意义(P ＜ 0． 01) ;
各给药组间比较差异有统计学意义(P ＜ 0． 05)。
4 讨 论
研究证实［6 －7］，HPA在恶性肿瘤细胞中普遍存在，HPA
表达水平越高，肿瘤恶性程度越高，转移潜能就越大，生长速
度也就越快。其机理可能分泌乙酰肝素酶蛋白，降解参与
ECM稳定性，并释放 HS 结合的碱性成纤维细胞生长因子、
血管内皮细胞生长因子等，促进肿瘤生长、血管生成。HPA
是哺乳动物体内唯一能降解 HSPGs 的一种 β － D －葡萄糖
醛酸内切酶，能降解硫酸乙酰肝素和乙酰肝素蛋白聚糖上的
聚糖侧链，因此 HPA已经成为抑制肿瘤转移理想的靶点之
一。因此 HPA基因治疗在肿瘤治疗领域具有重要的意义。
MMP －9是 MMPs家族中主要成员之一，几乎能降解细胞外
基质的所有成分，主要能有效降解细胞外基质中的Ⅳ、Ⅴ型
胶原和明胶，在肿瘤细胞突破基底膜屏障而浸润转移中起重
要作用。de Mingo等［8］研究发现胃癌组织中的 MMP － 9 浓
度高出正常组织 6 倍。MMP － 9 通过破坏基底膜和对细胞
外基质的改建，促进肿瘤新生血管的形成，促进肿瘤的浸润
转移。抑制其表达可能会有效地抑制肿瘤的侵袭和转移［9］。
本实验结果显示复方藤梨根制剂可以抑制胃癌转移并
能延长裸鼠生存期。复方藤梨根制剂对胃癌细胞中 HPA
mRNA的表达的影响，生理盐水组与低剂量组比较差异无
统计学差异(P ＞ 0． 05) ，而与中、高剂量组比较差异有统计
学意义 (P ＜ 0． 01) ，各给药组间比较差异有统计学意义(P
＜ 0． 05)。对胃癌荷瘤裸鼠肿瘤组织中 MMP － 9 mRNA 的
影响。生理盐水组与低剂量、中、高剂量组与之比较差异均
有统计学意义(P ＜ 0． 01) ;各给药组间比较差异有统计学
意义(P ＜ 0． 05)。这说明复方藤梨根制剂抑制胃癌转移部
分机制是通过下调 HPA、MMP －9 mRNA的表达起作用的，
且有一定的剂量正相关性。
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