全 文 ：［收稿日期］ 20120809(006)
［基金项目］ 国家自然科学基金项目(30860365)
［通讯作者］ * 李冬梅，硕士，讲师，从事天然药物化学成分研
究， Tel: 0872-2257418， E-mail: ldm200805
@ 163. com
正交试验法优选云南松松塔总黄酮的提取工艺
李冬梅* ，李莉，吴五谊，刀志琪，刘光明
( 大理学院药化学院，云南 大理 671000)
［摘要］ 目的:优选云南松松塔总黄酮的提取工艺。方法:采用超声波辅助法提取云南松松塔总黄酮，以总黄酮提取率
为指标，考察料液比、提取温度、乙醇体积分数和提取时间对总黄酮提取率的影响，通过正交试验法优选总黄酮的提取工艺。
结果:最佳提取工艺为加 30 倍量 60%乙醇于 60 ℃超声辅助提取 30 min，云南松松塔总黄酮质量分数 3. 23%。结论:优选的
提取工艺省时、稳定、提取率高。
［关键词］ 云南松;松塔;总黄酮;正交试验;提取工艺
［中图分类号］ R283. 6 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2013)01-0037-03
Optimization of Extraction Technology of Total Flavonoids from
Pinecone of Pinus yunnanensis by Orthogonal Test
LI Dong-mei* ，LI Li，WU Wu-yi，DAO Zhi-qi，LIU Guang-ming
(College of Pharmacology and Chemistry，Dali University，Dali 671000，China)
［Abstract］ Objective:To optimize extraction technology of total flavonoids in pinecone of Pinus
yunnanensis． Method:Total flavonoids in pinecone of P． yunnanensis were extracted by ultrasonic assisted
extraction method，with extraction rate of total flavonoids as index，orthogonal test was applied to investigate
influence of four factors (including ratio of material-liquid， ultrasonic extraction temperature， ethanol
concentration and extraction time)on extraction technology of total flavonoids from pinecone of P． yunnanensis．
Result:Optimum extraction technology was as following:ultrasonic assisted extracted 30 min with 30 times the
amount of 60% ethanol at 60 ℃，the content of total flavonoids in pinecone of P． yunnanensis was 3. 23% ．
Conclusion:Optimized extraction technology was simple and stable with high extraction rate of total flavonoids．
［Key words］ Pinus Yunnanensis;pinecone;total flavonoids;orthogonal test;extraction technology
云南松别名青松、飞松、长毛松等，是我国西南
林区的主要树种之一。松塔是松树的球果，又名松
实、松元、松果、松球［1］。据《中华本草》记载，松塔
具有祛风除痹、化痰、止咳平喘、利尿、通便等功
效［2］。主要化学成分有氨基酸、皂苷、蒽醌、黄酮、
香豆素、萜类、糖及木质素等［3-9］，提取物具有抗肿
瘤、抗 HIV、抗氧化、抗炎及抑突变等作用［10-16］。
常用的黄酮类化合物的提取方法有回流提取
法、超声辅助提取法、微波辅助提取法等，超声辅助
提取法具有耗时少、提取效率高等优点，近年来被广
泛用于天然产物成分的提取［17-19］。黄酮单体类化
合物的含量测定常用 HPLC，而总黄酮的含量测定
多采用在碱性介质中加入铝盐显色的分光光度法，
Al(NO3)3 比色法是最常用的总黄酮含量测定方法，
此方法主要以 Al(NO3)3 为显色剂，在碱性条件下
利用其与黄酮类化合物形成有色络合物，以芦丁为
对照品测定总黄酮含量［20-25］。本试验利用超声回
流法提取云南松松塔中的总黄酮，NaNO2-Al
(NO3)3-NaOH方法显色，以芦丁为对照品测定云南
松松塔总黄酮的含量，采用 L9(3
4)正交设计法优选
云南松松塔总黄酮的提取工艺。
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第 19 卷第 1 期
2013 年 1 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 1
Jan．，2013
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2013.01.016
1 材料
AL204-IC型电子分析天平(梅特勒-托利多仪
器有限公司) ，TU-1901 型双光束紫外-可见分光光
度计(北京普析通用仪器有限责任公司) ，XFB-200
型中药材料粉碎机(湖南科技机械厂) ，DHG9120A
型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司) ，
60 目筛(浙江上虞市华丰五金仪器有限公司) ，芦丁
对照品(中国药品生物制品检定所，纯度 95%，批号
100080-200707) ，其他试剂均为分析纯。
云南松松塔采自云南省漾濞县，经大理学院生
药教研室周浓副教授鉴定为松科松属植物云南松
Pinus yunnanensis Faranch的球果，即云南松松塔，样
品标本保存于大理学院有机药化教研室。
2 方法与结果
2. 1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品
0. 010 70 g，置 50 mL 量瓶中，加 50%乙醇溶解，定
容，摇匀，即得 0. 214 g·L －1的芦丁对照品溶液。
2. 2 供试品溶液的制备 云南松松塔干燥后粉碎，
过 60 目筛，精密称取 2. 008 1 g粉末置于 100 mL圆
底烧瓶，加 50%乙醇溶液 50 mL，50 ℃超声回流提
取 0. 5 h，冷却后抽滤，即得，备用。
2. 3 检测波长的选择 吸取上述对照品溶液和供
试品溶液各 1. 0 mL，分别置于 50 mL量瓶中，加 5%
NaNO2 溶液 0. 5 mL，摇匀，室温放置 5 min，加 10%
Al(NO3)3 溶液 0. 5 mL，摇匀，室温放置 5 min，加
4%NaOH溶液 5 mL，摇匀，室温放置 5 min，加 50%
乙醇溶液定容，摇匀，室温放置 10 min 显色，同法对
空白对照溶液显色。紫外-可见分光光度计 200 ～
700 nm全波长扫描，结果显示在 510 nm 处有最大
吸收，故确定检测波长 510 nm。
2. 4 标准曲线的绘制 精密吸取 2. 1 项下对照品
溶液 0. 0，0. 5，1. 0，1. 5，2. 0，2. 5，3. 0 mL，分别置于
10 mL量瓶中，同 2. 3 项下方法显色，加 50%乙醇定
容，以空白溶液作对照，于 510 nm 处测定吸光度
(A)。以 A为纵坐标，质量浓度为横坐标，得到回归
方程 A = 12. 597C + 0. 006 9(r = 0. 999 8) ，线性范围
0. 010 7 ～ 0. 642 g·L －1。
2. 5 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液 1. 0
mL置于 25 mL 量瓶中，同 2. 3 项下方法显色，用
50%乙醇定容。分别于 0，2，4，6，8，10，12 h测定 A，
每份样品平行测定 3 次，RSD 0. 93%，表明供试品溶
液在 12 h内稳定。
2. 6 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液 1. 0
mL于 25 mL量瓶中，同 2. 3 项下方法显色，加 50%
乙醇定容，于 510 nm 处测定 A，平行测定 5 次，RSD
0. 40%，表明仪器精密度良好。
2. 7 重复性试验 精密称取同一批云南松松塔粉
末 5 份，按 2. 2 项下方法制备供试品溶液。精密吸
取上述供试品溶液各 1. 0 mL 于 25 mL 量瓶中，同
2. 3 项下方法显色，加 50%乙醇定容，于 510 nm 测
定 A，每份样品平行测定 3 次，RSD 0. 48%，说明该
方法重复性较好。
2. 8 加样回收率试验 精密吸取 5 份已知质量浓
度的同一供试品溶液 1. 0 mL，置于 25 mL 量瓶中，
分别精密加入 2. 1 项下对照品溶液 1. 0，2. 0，3. 0，
4. 0，5. 0 mL，同 2. 3 项下方法显色，加 50%乙醇定
容，于 510 nm测定 A，结果见表 1。
表 1 云南松松塔总黄酮加样回收率试验
No．
加入量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均回收率
/%
RSD
/%
1 0． 214 0． 215 6 100． 75 99． 81 0． 41
2 0． 428 0． 426 2 99． 58
3 0． 642 0． 641 9 99． 98
4 0． 856 0． 851 8 99． 51
5 1． 070 1． 061 8 99． 23
2. 9 提取工艺优选 在单因素试验基础上，选取料
液比、提取温度、乙醇体积分数和提取时间为考察因
素，以总黄酮提取率为指标，精密称取 9 份干燥云南
松松塔粉末，每份 5. 0 g，按 L9(3
4)正交表进行试
验，因素水平见表 2，试验安排及结果见表 3，方差分
析见表 4。
表 2 云南松松塔总黄酮的提取工艺正交试验因素水平
水平
A
料液比
B
提取温度 /℃
C
乙醇体积分数 /%
D
提取时间 /min
1 1∶ 10 50 50 30
2 1∶ 20 60 60 40
3 1∶ 30 70 70 50
由表 3 可知，各提取因素对总黄酮提取率的影
响为提取温度 ＞料液比 ＞乙醇体积分数 ＞提取时
间;以极值最小的 D 因素为误差项进行方差分析，
表明因素 A，B对提取工艺有显著影响，C 因素无显
著影响，确定最佳提取工艺为 A3B2C2D1，即料液比
1∶ 30，提取温度 60 ℃，乙醇体积分数 60%，提取时
间 30 min。
2. 10 验证试验 精密称取 5 份不同批次的干燥云
南松松塔粉末各 5. 0 g，按优选的提取工艺进行 3 次
验证试验，分别测定吸光度(n = 3)次求平均值，计
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第 19 卷第 1 期
2013 年 1 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 1
Jan．，2013
表 3 云南松松塔总黄酮的提取工艺正交试验
No． A B C D
总黄酮质量
分数 /%
1 1 1 1 1 2. 41
2 1 2 2 2 2. 98
3 1 3 3 3 2. 61
4 2 1 2 3 2. 59
5 2 2 3 1 3. 07
6 2 3 1 2 2. 70
7 3 1 3 2 2. 73
8 3 2 1 3 3. 14
9 3 3 2 1 3. 05
K1 2. 670 2. 577 2. 750 2. 843
K2 2. 787 3. 067 2. 877 2. 807
K3 2. 973 2. 787 2. 803 2. 780
R 0. 303 0. 490 0. 127 0. 063
表 4 提取工艺方差分析
方差来源 SS f F P
A 0. 140 2 23. 333 ＜ 0. 05
B 0. 363 2 60. 500 ＜ 0. 05
C 0. 024 2 4. 000 ＞ 0. 05
D(误差) 0. 006 2 1. 000
注:F0. 05(2，2)= 19. 00。
算总黄酮平均质量分数 3. 23%，RSD 0. 48%，说明
优选工艺稳定可行。
3 讨论
本实验利用超声波辅助法提取云南松松塔总黄
酮，该法操作简单、稳定性好，适合云南松松塔总黄酮
的提取。超声波提取法现已广泛用于化学成分的提
取工作中，它具有提取率高、提取时间短、有效成分易
于溶出等优点，节省溶剂，同时简化了提取操作步骤。
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［责任编辑 仝燕］
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