全 文 ：土槿皮乙酸诱导人胃癌 SGC7901细胞凋亡及机制
徐永红 1, 2 ,王学清 1 ,鞠晓华1 ,赵立杰 1 ,李　岩 1
(1.中国医科大学盛京医院消化内科 ,辽宁 沈阳　110004;2.青岛大学医学院附属医院消化内科 , 山东 青岛　266003)
收稿日期:2007-11-14,修回日期:2008-02-18
作者简介:徐永红(1968-),女 , 博士生 , 副主任医师 ,研究方向:中
药与肿瘤 , Tel:0532-82911304, E-mail:yonghong6868 @si-
na.com;
李　岩(1956 -), 男 , 博士 , 教授 , 通讯作者 , Tel:024-
83956416, E-mail:yanli0227@ 126.com
中国图书分类号:R284.1;R329.24;R329.25;R73-351;
R735.202.2;R977.3
文献标识码:A 文章编号:1001-1978(2008)05-0601-06
摘要:目的　研究土槿皮乙酸(pseudolaricacidB, PAB)诱导
人胃癌 SGC7901细胞株凋亡及其分子机制。 方法　MTT法
检测细胞增殖的抑制作用 , 电镜观察细胞的形态学变化 , An-
nexinV/PI双染法检测细胞早期凋亡率 , 罗丹明染色流式细
胞仪检测线粒体膜电位 , Westernblot检测 PAB对 caspase-3、
caspase-9剪切片断 , bcl-2、bax蛋白表达 , 及对 MAPKs通路
相关蛋白 , 包括 p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38、p38表达的
影响。结果　PAB对人胃癌 SGC7901细胞株生长具有明显
的抑制作用 , 并呈时间和浓度依赖性。电镜结果显示 0.5
μmol· L-1 PAB作用 24h后 , 核染色体聚集 、边集 , 72h凋亡
小体形成。用 0.5 μmol· L-1 PAB处理 SGC7901细胞 12、
24、48、72h, AnnexinV/PI双染检测细胞的早期凋亡 , 其早期
凋亡率分别为 10.06%、15.98%, 23.12%, 29.06% , 而对照
组的早期凋亡率仅为 0.9%(P<0.05)。罗丹明染色检测
线粒体膜电位 , 0.5 μmol· L-1浓度的 PAB作用于 SGC7901
细胞 12 h后 , 线粒体膜电位开始下降并随时间延长而逐渐
增加 , 12、 24、 48、 72 h线粒体膜电位下降分别为 26.36%、
33.26%、41.28%、 52.13%(P<0.05或 0.01)。 0.5 μmol·
L-1浓度的 PAB作用于 SGC7901细胞 24 h后 , Westernblot
法检测发现 caspase-3、 caspase-9 2种蛋白均出现断裂片断 ,
并随着时间的增加断裂更明显。进一步研究发现 , PAB处理
SGC7901细胞后 , bax蛋白表达升高 , bcl-2蛋白表达下降 , 同
时 JNK、p38的磷酸化水平明显升高 , ERK表达水平下降。
结论　PAB具有明显的细胞毒作用 , 能诱导 SGC7901细胞
凋亡 , JNK和 p38途径激活后通过对 bax和 bcl-2表达的调
控 , 导致线粒体膜电位的下降 , 进而激活 caspase最终导致细
胞死亡 , 可能是其诱导胃癌细胞凋亡的分子机制之一。
关键词:土槿皮乙酸;SGC7901细胞;细胞凋亡;信号转导
　　土 槿皮是 松科 植物金 钱松 (Pseudolarix
kaempferiGord)的根皮 ,土槿皮乙酸(pseudolaricacid
B, PAB)为其主要有效成分 。近年的研究表明土槿
皮乙酸有抗真菌 、抗生育 、抗癌作用 [ 1] ,但其抗癌机
制未完全明了 。丝裂原激活蛋白激酶(mitogenacti-
vatedproteinkinase, MAPK)级联是细胞内的主要信
息传递系统 ,可将细胞外信息传递至细胞核中 ,从而
介导细胞的生存 、凋亡[ 2] 。已确定 MAPK信号转导
通路有 3条 ,即 ERK、JNK、p38通路[ 3, 4] , ERK途径
主要与细胞的增殖相关 [ 5] , JNK和 p38通路则主要
介导细胞的炎症和凋亡 [ 6, 7] 。最近在许多人类肿瘤
中发现 , MAPK信号传导通路异常与肿瘤发生 、发展
关系密切 ,因此此通路成为抗肿瘤治疗的一个新靶
点[ 8, 9] 。本研究试图探讨 PAB对胃癌细胞增殖的影
响 ,及其诱导胃癌细胞凋亡与 MAPKs信号转导通路
之间的关系。
1　材料与方法
1.1　细胞株与细胞培养　人胃癌细胞株 SGC7901
由我科传代培养 ,在含 10%胎牛血清的 RPMI1640
培养液 、饱和湿度 ,饱和温度为 37℃, CO2浓度为
5%的培养箱中培养 。
1.2　材料　RPMI1640培养基购自 Gibco公司 、胎
牛血清购自天津灏洋生物制品公司;噻唑蓝
(MTT)、罗丹明 123购自 Sigma公司;AnnexinV-
FITC凋亡检测试剂盒购自晶美公司;p-JNK、JNK、p-
p38、p38、p-ERK、ERK均购自 CelSignal公司;bax、
bcl-2、 caspase-3, caspase-9、β-actin及抗兔和抗鼠的
二抗均为 SantaCruz公司产品。土槿皮乙酸标准品
购自中国药品生物制品检定所 ,批号:110880,其化
学结构式见 Fig1。
Fig1　ChemicalstructureofpseudolaricacidB
1.3　MTT法　收集对数生长期的 SGC7901细胞 ,
接种于用 96孔培养板中 ,每孔 100μl。实验组一组
·601·中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2008 May;24(5):601 ～ 6
加 0.5μmol· L-1 PAB分别培养 8、16、24、48、72 h,
另一组加入不同浓度的 PAB使其终浓度分别为
2.5、1、1.5、0.5、0.25、0.125 μmol· L-1 ,培养 24 h。
对照调零组加入 100μl培养基作本底 ,空白对照组
加入二甲基亚砜(DMSO)的培养液 ,每组设 6个平
行孔 ,于上述培养时间后 ,每孔加入新鲜配制的浓度
为 5 g·L-1的 MTT20 μl。继续培养 4 h后取出培
养板 ,小心吸弃培养基 ,每孔加 DMSO150 μl,轻轻
振荡 10 min后 ,用酶联仪于 570 nm处测出各孔吸
光度值 ,计算生长抑制率 ,实验重复 3次。
1.4　AnnexinV-FITC /PI荧光染色检测细胞凋亡
　以 0.5 μmol·L-1 PAB处理 SGC7901细胞 , 以不
同时间点分别消化 、收集各组细胞。调整细胞浓度
至 1×106· L-1。各取 100 μl, PBS洗涤两次后 ,弃
上清液 。加入预冷的结合缓冲液 100 μl重悬细胞 ,
加入 5 μlAnnexinV-FITC和 10 μlPI于细胞悬液
中 ,轻轻混匀 ,将试管置于室温避光染色 15min。补
加 400 μl结合缓冲液混悬细胞 , 流式细胞仪进行检
测 , 分析细胞凋亡的百分比。
1.5　透射电子显微镜观察凋亡细胞形态　细胞培
养 24h后换液 ,实验组加入 PAB使其终浓度为 0.5
μmol· L-1 ,分别孵育 24、 48、72 h,设不加药对照
组 ,收获细胞 , 1000 r· min-1离心 10 min,弃上清 ,
4℃预冷戊二醛固定 2 h, PBS洗涤 ,锇酸固定 ,梯度
乙醇 、丙酮脱水 ,常规包埋 、聚合 、超薄切片 、铅染 、透
射电镜观察 。
1.6　线粒体膜电位的测定　分别收集 0.5 μmol·
L-1 PAB作用 12、24、48、72h后细胞 ,设不加药对照
组 , 1 000r·min-1 ,离心 10min,弃上清 ,加入 10mg
· L-1 Rhodamine123 500μl, 37℃避光孵育 30min,
PBS洗细胞 3次 ,在流式细胞仪检测线粒体膜电位
的变化 。Rhodamine123是一种阳离子荧光染料 ,由
于线粒体内膜的负电性而滞留在活细胞线粒体内 ,
以其荧光强度变化表示线粒体膜电位变化 。
1.7　Westernblot法　取处于对数生长期的细胞 ,
0.5μmol· L-1同一浓度 PAB处理不同时间后 ,收
集细胞 , PBS洗涤 2次 , 加入细胞裂解液 100 μl,
12 000 r·min-1离心 50 min,定量蛋白 ,取 30 μg蛋
白 ,加入上样缓冲液 , 100℃下变性 10 min。 10% ～
15%的聚丙烯酰胺 SDS凝胶电泳后 ,电转移至硝酸
纤维素膜上 , 5%脱脂牛奶封闭后依次加入第一 、二
抗体 ,在室温下孵育 2 h, TBST缓冲液洗涤 3次 ,每
次 10min,碱性磷酸酶法显色后扫描测灰度值。
1.8　数据分析与处理　应用 SPSS11.0对实验数
据进行分析 ,数据结果采用 x±s表示 ,多组间比较
先行方差齐性检验 ,方差齐者进行方差分析;方差不
齐者进行成组秩和检验 ,两两比较用 t检验 。
2　结果
2.1　PAB对胃癌 SGC7901细胞体外增殖的抑制
作用　PAB在 0.5μmol·L-1以下的浓度对 SGC7901
胃癌细胞增殖无明显抑制作用 , 0.5、1、1.5、2.5 μmol
·L-1浓度处理 SGC7901细胞 1 d,对肿瘤细胞增殖
的抑制率分别为 60.05%、 80.11%、 90.31%、和
95.42%,较对照组差异有显著性 (P<0.01或 P<
0.05),并呈现明显的剂量效应关系(Fig2A)。同一
浓度 0.5μmol· L-1 PAB的对胃癌细胞的抑制作用
随着时间的延长也逐渐增强(Fig2B)。
Fig2　GrowthinhibitionofPABinSGC7901cels
　　Celswereincubatedintheabsenceorpresenceofvariousconcentra-
tionsofPABfor24h(A), orin0.5μmol· L-1 ofPABfordifferentin-
cubationtime(B).Then, thecytotoxicefectwasdeterminedusingMTT
assay.＊P<0.05, ＊＊P<0.01vscontrol
2.2　PAB诱导胃癌 SGC7901细胞凋亡
2.2.1　PAB对细胞形态影响　透射电镜观察凋亡
细胞形态 ,对照组细胞呈卵圆型 ,细胞膜 、核膜完整。
0.5 μmol· L-1 PAB作用 SGC7901细胞 24 h后 ,细
胞核内异染色质凝聚 ,且靠近核膜呈半月状。随着
药物作用时间的延长 , 72 h后细胞核膜溶解 ,核内
异染色质凝聚破碎成多块于胞质中 ,并见有膜包裹 ,
形成凋亡小体(Fig3)。
·602· 中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2008 May;24(5)
Fig3　ThemorphologicalchangeofSGC7901by
PABunderelectronicmicroscope
　　A:control, withoutbeingtreatedbyPAB;B:Celswereincubated
inpresenceof0.5μmol· L-1 concentrationofPABfor24 h;C:Cells
wereincubatedinpresenceof0.5 μmol· L-1 concentrationofPABfor
72h
2.2.2　早期凋亡率的检测　磷脂酰丝氨酸外翻 (
PS)是早期细胞凋亡的重要特征之一 , AnnexinV被
当作检测细胞表面 PS的敏感探针 , PI则能从 An-
nexinV染色细胞中将凋亡和坏死细胞区分开来 。
0.5μmol· L-1处理 SGC7901细胞 , 于不同时间点
收集细胞并用 AnnexinV-FITC/PI双染细胞 , 12、24、
48、72 h细胞早期凋亡率分别为 10.06%、15.98%、
23.12%、29.06%,与对照组(0.9%)相比 , 细胞早
期凋亡率增加(P<0.05, Fig4)。
2.3　PAB对人胃癌 SGC7901细胞 ΔΧm的影响结
果　0.5μmol·L-1 PAB作用于 SGC7901 12、24、48
和 72 h后 , 处理的细胞内的 ΔΧm峰值下降
26.36%、 33.26%、 41.28%、 52.13%, 与对照组
(5.02%)比较 ,罗丹明在细胞中的平均荧光度均明
显减少 (P<0.05或 P<0.01)。同时细胞内的
ΔΧm峰出现有意义的向左移的趋势 ,结果见 Fig5。
2.4　 pseudolaricacidB对 SGC7901 细胞中
caspase-3、caspase-9蛋白剪切的影响 　完整的
caspase-3和 caspase-9没有活性 ,当其发生剪切后激
活 ,同一浓度 0.5 μmol· L-1 PAB作用于 SGC7901
细胞 24、48、72h后 , Westernblot法检测显示 , 35 ku
的 caspase-3出现 17 ku的断裂片段 , 47 ku的
caspase-9出现 37 ku的断裂片断 ,而对照组无断裂
片段 , 只有分子量为 35、 47完整的 caspase-3、
caspase-9 。结果表明 caspase-3和 caspase-9已被快
速活化 ,从而参与细胞凋亡的发生(Fig6)。
2.5　PAB对 SGC7901细胞 bcl-2、bax表达的影响
0.5 μmol·L-1 PAB处理 SGC7901细胞 12、24、48、
72h, Westernblot方法检测结果显示 , 12h后 bax蛋
白表达水平升高 ,并随时间的延长逐渐增加 ,而 bcl-
2蛋白表达水平随时间的增加逐渐降低(Fig7)。
2.6　PAB对 MAPKs通路的影响 　PAB处理
SGC7901细胞 12、24、48、72 h后 , Westernblot方法
检测结果显示 24 h后磷酸化的 JNK和 p38增加 ,
48、72h维持在高水平 ,总的 JNK、p38的量没有变
化 。磷酸化 JNK和 p38分别是其活性形式 ,这表明
Fig4　ApoptosisinducedbyPABinSGC7901cels
　　SGC7901 celsweretreatedwith0.1%DMSO(A)orwith0.5μmol· L-1 ofPABfor12h(B), 24h(C), 48h(D)or72h(E).Thecellswere
colectedsequentialyandstainedwithAnnexinVandPIandanalyzedbyflowcytometry.ThecelsintheareasofA4, B4, C4, D4, E4wereearlyapoptot-
iccels.
Fig5　ChangesinmitochondrialmembranepotentialofSGC7901celsinducedbyPAB
　　A:negativecontrolSGC7901cels;B、C、D、E:positivecontrolSGC7901 celsincubatedwith0.5μmol· L-1 PABfor12、 24、 48、 72h.SGC7901
celswerestaindwithRhodamine123todetectΔΧm
·603·中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2008 May;24(5)
Fig6　Cleavageofcaspase-3andcaspase-9
inducedbyPABinSGC7901cels
　　SGC7901celswerebeingtreatedwith0.5μmol· L-1 concentra-
tionofPABfor12、24、 48、 72h.Thecelswerecollectedandanalysed.
Westernblotanalysiswasconductedandprobedwithantibodiesto
caspase-3orcaspase-9.A:0.1%DMSO;B:12h;C:24h;D:48h;
E:72h.
Fig7　Changesinbcl-2andbaxofSGC7901celsinducedbyPAB
　　SGC7901 celsweretreatedwith0.5μmol· L-1 concentrationof
PABfor12、24、48、 72h.Thecelswerecolectedandanalysed.West-
ernblotanalysiswasconductedandprobedwithantibodiestobcl-2 and
bax.A:negativecontrolSGC7901 cels;B、C、D、Epositivecontrol
SGC7901celsincubatedwithC:0.5μmol· L-1 PABfor12、 24、 48、
72h
PAB激活了 JNK、p38信号转导通路。磷酸化 JNK
和 p38升高的同时 ,磷酸化的 ERK表达下降 ,总的
ERK的量没有改变 ,表明 PAB通过降低 ERK的活
性抑制 SGC7901细胞的增殖(Fig8)。
Fig8　EfectofPABonJNK、p38andERK
activationinSGC7901cels
　　SGC7901celsweretreatedwith0.1%DMSO(A)or0.5μmol·
L-1 ofPABfor12h(B), 24h(C), 48h(D), 72h(E).Thecells
weresequentialyharvestedandanalysed.Totalprotein(30μg/ lane)
wasloadedonSDS-PAGEgel, transferedtoNCmembraneandprobed
withantibodiestophosphor-JNK, JNK, phosphor-p38, p38, phosphor-
ERKorERK.
3　讨论
许多天然药物单体化合物如肉桂酸 、冬凌草已
素等可通过诱导肿瘤细胞分化或诱导其凋亡而发挥
抗肿瘤作用 [ 10, 11] ,因此 ,对其作用靶点的寻找 、抗肿
瘤机制的阐明至关重要。 PAB是从松科植物金钱
松的根皮(土槿皮)中分离出来的三帖内酯类化合
物。 PAB可诱导胃癌细胞凋亡 [ 12] ,进一步研究表明
其可通过 MAPK通路诱导 HeLa细胞凋亡 [ 9] ,但其
诱导胃癌细胞凋亡是否通过 MAPK信号转导通路
未见报道 ,促使我们对其诱导胃癌细胞凋亡的分子
机制进行进一步的研究 。实验结果表明 , PAB具有
明显的抑制胃癌肿瘤细胞生长的作用 ,并具有时间
和剂量依赖性 。电子显微镜观察到 0.5 μmol·L-1
PAB作用 SGC7901细胞 24h后 ,细胞核内异染色质
凝聚 ,且靠近核膜呈半月状 ,随着药物作用时间的延
长核内异染色质凝聚破碎成多块于胞质中 ,并见有
膜包裹 ,形成凋亡小体等一系列凋亡的特征性变化。
凋亡早期凋亡细胞膜不对称性丢失 ,导致磷脂酰丝
氨酸(PS)暴露于胞膜外表面 ,用异硫氰酸荧光素
FITC标记的 Annexin-V对细胞膜进行染色 ,可使早
期凋亡细胞膜外面暴露的 PS与 Annexin-V特异性
结合而出现绿色荧光 ,与 PI同时染色 ,借助 FCM可
定量分析受标记的凋亡坏死细胞数 ,此法简单 、灵
敏 、可靠 ,是近年来应用较广泛可靠的测定凋亡的方
法。 Annexin-V/PI双染实验研究表明同一浓度 PAB
作用于细胞 12 h后 ,早期凋亡细胞比例明显增加 ,
72 h后最高达 29.8%。这些证实了 PAB诱导了
SGC7901细胞凋亡的发生 。
　　细胞凋亡主要有两种通路:一种是以 Fas和
TNFR为代表死亡受体信号转导途径;另一种是以
线粒体为核心的凋亡途径。线粒体在细胞生理活动
中起着关键作用 ,线粒体膜电位的下降将影响线粒
体乃至整个细胞的功能活动 ,最终使线粒体内凋亡
活性物质如 Ca2+、活性氧及细胞色素 C等释放。而
线粒体膜电位的下降 、细胞色素 C的释放进而进一
步激活位于凋亡途径的上游 caspase-9,而活化的
caspase-9作为始 动 caspase进一步 诱导 效应
caspase-3的活化 ,导致 caspase-3也发生断裂 ,最终
使细胞走向凋亡[ 13] 。我们首先测定了线粒体膜电
位 ,随着药物作用时间的延长 ,线粒体膜电位水平逐
渐下降 ,同时 caspase-3和 caspase-9蛋白发生断裂 ,
且呈时间依赖关系。表明 PAB可能通过线粒体膜
电位的下降 ,进而促进细胞色素 C等物质的释放 ,
导致 caspase-9和 caspase-3的激活诱导了胃癌细胞
凋亡 。
·604· 中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2008 May;24(5)
bax和 bcl-2是 bcl-2家族的两个成员 ,通常是
以复合物的形式存在 。前者为促凋亡因子 ,后者为
抗凋亡因子 ,在细胞凋亡过程 ,促凋亡蛋白 bax可与
线粒体电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent
anionchannel, VDAC)相互作用促进线粒体通透性
转变孔 (mitochondrialpermeabilitytransitionpore,
MPTP)开放 , 。 MPTP高水平开放的直接效应是导
致线粒体膜电位的下降 ,细胞色素 C(cytochromeC,
CytC)释放 , 进而激活 caspase最终导致细胞死亡 。
抗凋亡蛋白 bcl-2则可拮抗 bax的上述作用而抑制
细胞凋亡 [ 14] 。PAB上调 bax,下调 bcl-2表达同时 ,
线粒体膜电位水平下降 ,表明 PAB可能通过 bcl-2、
bax蛋白表达的改变进而通过上述途径导致线粒体
膜电位的下降 ,细胞色素 C的释放 , caspase激活导
致细胞凋亡 。
为了进一步探讨 PAB诱发 SGC7901细胞凋亡
的可能的信号转导通路 ,我们检测了 MAPK这条途
径 。MAPK是一族胞质内广泛分布的含有丝氨酸 /
苏氨酸残基的蛋白激酶 ,在静止细胞中 , JNK与 p38
定位于细胞质与细胞核 。磷酸化的 ERK、JNK、p38
是其活性形式 ,一旦激活可调节基因的表达 、细胞增
殖 、凋亡等活动[ 2, 5 ～ 7] 。其中 JNK可通过 bcl-2磷酸
化 、诱导 bax线粒体转位 ,从而调控凋亡 [ 15, 16] 。在
PAB作用下 ,磷酸化的 JNK、p38表达升高 ,非磷酸
化的 JNK、p38无明显改变 。说明 PAB可能促使
JNK和 p38的激活进而通过 bcl-2、 bax诱导肿瘤细
胞的凋亡。在磷酸化的 JNK、p38表达升高同时 ,磷
酸化 ERK表达下降 。ERK的活性增强与细胞生长
密切相关[ 5] , PAB可能通过 ERK活性的降低抑制了
肿瘤细胞的增殖 。
总之 , 我们的研究表明 PAB能明显抑制胃癌
SGC7901细胞的增殖 , JNK和 p38途径激活后 ,通过
bcl-2和 bax导致线粒体通透性的改变 ,并进一步导
致 caspase-9和 caspase-3激活 ,可能是其诱导胃癌
细胞发生凋亡的分子机制之一 。
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cationtomitochondriathroughphosphorylationof14-3-3 proteins
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·605·中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2008 May;24(5)
MolecularmechanismsofpseudolaricacidBinducedapoptosisinSGC7901cels
XUYong-hong1, 2 , WANGXue-qing1 , JUXiao-hua1 , ZHAOLi-jie1 , LIYan1
(1.DeptofDigestiveDiseases, ShengjingHospitalofChinaMedicalUniversity, Shenyang110004, China;
2.DeptofDigestiveDiseases, theAffiliatedHospitalofQingdaoUniversity, QingdaoShangdong266003, China)
Abstract:Aim　Tostudymolecularmechanismsof
pseudolaricacidB(PAB) induced apoptosisin
SGC7901 cels.Methods　Cytotoxicitywasanalyzed
byMTT.Electronmicroscopywasusedtoobservemor-
phologicalchanges.Earlyapoptoticcelsstainedwith
AnnexinV/PIandthelossofmitochondrialmembrane
potential(ΔΧm)stainedwithRhodamine123 wereex-
aminedusingflowcytometry.Theproteinexpressionof
ERK、JNK、p38 、bax、bcl-2、 caspase-3 and-9 were
detectedbyWesternblotanalysis.Results　 PAB
couldinduceapoptosisinhumanSGC7901 cels, as
characterizedbymorphologicalchanges, thelossof
ΔΧm, activationofcaspase-3 and-9.Moleculardata
showedthatPABdecreasedbcl-2 proteinandincreased
baxprotein.Moreover, PAB couldactivatec-Jun
NH2-terminalkinase(JNK)andp38kinase.Conclu-
sions　ThesefindingsindicatedthatJNK-andp38ki-
nasemediatedmitochondrialpathwaysmightbein-
volvedinPAB-inducedapoptosisandenhancedtheun-
derstandingoftheanticancerfunctionofPABinherbal
medicine.
Keywords:pseudolaricacidB;SGC7901cels;apop-
tosis;signalpathway
褪黑素对动脉粥样硬化模型兔动脉肌球
蛋白轻链激酶表达及活性的影响
朱华庆 ,程筱雯 ,江志奎 ,肖林林 ,左　莉 ,胡若磊 ,张素梅 ,周　青 ,桂淑玉 ,汪　渊
(安徽医科大学分子生物学实验室和生物化学教研室 , 安徽省和省部共建重要遗传病
基因资源利用重点实验室 ,安徽 合肥　230032)
中国图书分类号:R-332;R 322.121;R 329.24;R 345.57;
R347;R466.1;R543.502.2;R977.3
文献标识码:A 文章编号:1001-1978(2008)05-0606-05
摘要:目的　探讨褪黑素(melatonin, MLT)对动脉粥样硬化
模型兔动脉肌球蛋白轻链激酶(MLCK)表达与活性的影响。
方法　复制动脉粥样硬化兔模型 , 采用免疫组化和 Western
blot分析主动脉 MLCK蛋白表达 , γ-32P-ATP参入法检测
MLCK活性。结果　成功建立动脉粥样硬化兔模型 , 高脂喂
食 12wk, 兔主动脉 MLCK蛋白表达水平增加 , 活性上升 , 经
MLT治疗后动脉粥样硬化斑块减少 , MLCK蛋白表达下降 ,
活性下降。结论　动脉粥样硬化的形成与 MLCK蛋白表达
收稿日期:2007-12-14,修回日期:2008-02-21
基金项目:国家自然科学基金资助项目(No30570750);安徽省自然
科学基金(No070413079);安徽省教育厅基金资助项目
(NoKJ2007B275)
作者简介:朱华庆(1974-),男 , 博士 ,副教授 ,研究方向:动脉粥样
硬化发病机制 , E-mail:aydzhq@ 126.com;
汪　渊(1958-),男 , 教授 ,博士生导师 , 研究方向:动脉
粥样硬化发病机制 , 通讯作者 , Tel:0551-5161140, E-mail:
wangyuan@anhu.edu.cn
与活性升高有关 , MLT能降低动脉 MLCK蛋白表达和活性。
关键词:褪黑素;动脉粥样硬化;肌球蛋白轻链激酶;Westernblot
　　动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的形成与发
生是一个长期 、慢性 、多种因素作用的过程[ 1] 。 AS
的形成过程与动脉内皮细胞的收缩有着紧密的联
系 ,动脉内皮细胞的收缩破坏细胞之间的紧密连接 ,
使得动脉血管内膜的屏障功能破坏 ,脂质易于浸
润[ 2] 。肌球蛋白轻链激酶 (myosinlightchainki-
nase, MLCK)是肌细胞收缩的关键酶。现已知 ML-
CK在骨骼肌细胞收缩的调节和平滑肌细胞收缩的
启动中发挥关键作用。 MLCK在非肌肉细胞中的作
用目前仍不清楚 ,但研究表明 , MLCK在非肌肉细胞
中有着广泛的分布 , MLCK的磷酸化水平 、细胞质内
Ca2 +浓度的变化以及肌球蛋白轻链 (myosinlight
chain, MLC)磷酸化的相关性表明 MLCK在非肌肉
细胞的生命活动中具有重要的作用[ 3, 4] 。
褪黑素 (melatonin, MLT)主要是由松果体分泌
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