全 文 ：第 2 期
Study on Antioxiant Active Fraction from a Seaweed, Ishige okamurai
CHEN Jing-ming1， HUANG Xiao-dong2， CAI Jian-xiu2， GU Ya-qing2
（1.Quanzhou Preschool Education College, Quanzhou, Fujian 362000, China; 2.Fujian Advanced Education Key Laboratory of
Inshore Resourses Biotechnology, Quanzhou Normal University, Quanzhou, Fujian 362000, China）
Abstract： DPPH radical scavenging capacity,TEAC value and main chemical component content were taken as indexes to
singled out the seaweed and its active extract with higher content polyphenol and stronger antioxidant activity from ten kinds
of seaweeds in Fujian weitou bay.Then, DPPH radical scavenging ability, reducing power and total antioxidant capacity (T-
AOC) of the active extract was investigated respectively, preliminary analysis into the effects of metal ion on its antioxidant
activity was also studied.The results showed that methanol extract of Ishige okamurai had higher content of polyphenol,
higher TEAC value and stronger DPPH radical scavenging ability among 10 seaweeds, ethyl acetate fraction of methanol
extract from Ishige okamurai was mian antioxidant active fraction with the EC50 value of DPPH radical scavenging of
0.17mg/mL, which was less than that of BHT(0.23 mg/mL), and with the EC50 value of reducing power of 0.30 mg/mL, which
was far less than that of Vit C(0.91 mg/mL),and with T-AOC value of 13.16 U/mg. The effects of metal ion on DPPH radical
scavenging activity of ethyl acetate fraction from Ishige okamurai showed that metal ion such as K+,Cu2+, Zn2+,Ca2+,Fe3+ had
some synergistic effects, but Na+,Mn2+,Mg2+ had antagonistic effects.
Key words: seaweed; Ishige okamurai Yendo; ethyl acetate fraction; antioxidant activity
海藻铁钉菜抗氧化活性部位研究
陈景明 1, 黄晓冬 2, 蔡建秀 2, 顾雅青 2
(1.泉州幼儿师范高等专科学校,福建泉州 362000；2.泉州师范学院近海资源生物技术福建省高校重点
实验室,福建泉州 362000）
摘 要： 以 DPPH 自由基清除能力、TEAC 值与主要化学成分含量为指标，从福建省围头海域的 10 种海藻中筛选
出总酚含量较高、 抗氧化活性较强的海藻及其抗氧化活性部位. 进一步对该海藻的抗氧化活性部位进行 DPPH
自由基清除能力、还原力与总抗氧化能力的测定，初步分析金属离子对其抗氧化活性的影响. 结果表明：10 种海
藻中，铁钉菜甲醇提取物具有较高含量的多酚、TEAC 值与较强的 DPPH 自由基清除能力，乙酸乙酯部位是其主
要的抗氧化活性部位. 铁钉菜乙酸乙酯部位对 DPPH 自由基清除的半效应浓度 EC50为 0.17 mg/mL， 小于 BHT
EC50 0.23 mg/mL；还原力的 EC50为 0.30 mg/mL，远远小于维生素 C EC50 0.91mg/mL；总抗氧化能力约为 13.16 U/
mg. 金属离子对铁钉菜乙酸乙酯部位的 DPPH 自由基清除的影响表现为 K+、Cu2+、 Zn2+ 、Ca2+ 、Fe3+等的增效作用
与 Na+、Mn2+、Mg2+等的降效作用.
关键词： 海藻； 铁钉菜； 乙酸乙酯部位； 抗氧化活性
中图分类号： Q949.2, R282.705 文献标志码：A 文章编号：2095-7122（2016）02－0073－07
在有氧以及金属离子催化作用下，食品尤其是油炸过或者添加了油脂的预包装食品，极易发生氧化
反应影响食品的营养价值和感官品质. 为了提高食品的抗氧化能力往往在食品加工、 贮存和保鲜过程中
添加二丁基羟基甲苯（BHT）、特丁基对苯二酚（TBHQ）等化学合成的抗氧化剂，然而随着人们对健康、安全
收稿日期: 2016-05-18
基金项目： 福建省教育厅 A类科技项目(JA14431); 泉州市科技计划项目(2014Z129)
作者简介： 陈景明（1966-）， 男， 福建省泉州市人， 副教授.
2016 年第 2 期 No．2．2016 年
(总第 92 期) General No．92
闽南师范大学学报(自然科学版)
Journal of Minnan Normal University（Nat. Sci.）
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DOI:10.16007/j.cnki.issn2095-7122.2016.02.012
2016 年 闽南师范大学学报(自然科学版)
的关注，此类抗氧化剂不断发现可能具有细胞毒性，导致肝损伤与癌变 [1-2]. 因此，越来越多的国家开始限
制或禁止使用化学合成抗氧化剂，并致力从植物中寻求高效、无毒、安全的天然抗氧化剂[3-4].
海藻（seaweed）即大型藻类（marine macroalgae）是海洋中的低等隐花植物，种类繁多、资源丰富，已
鉴定的约有 6,000 种，主要分成绿藻 (Chlorophyceae)， 红藻(Rhodophyceae)和褐藻(Phaeophyceae) 等 3 种
类别[5-6]. 研究者指出由于海藻长期暴露生长在强光和高氧浓度的海洋环境， 在强光和高氧浓度双重作用
下容易产生自由基和其它强氧化物，但海藻细胞通过一些保护性抗氧化机制和化合物使其在代谢中很少
受到严重的光动力损伤 [7-8]. 这种特殊的生境使得海藻产生多样、丰富、独特的天然抗氧化活性成分，成为
海洋源抗氧化剂筛选的主要资源[9]. 福建省泉州围头半岛海域自然分布着多种大型海藻，文献尚未见对该
海域大型海藻抗氧化活性研究的报道，本实验在该海域采集了 10 种大型海藻，对其进行抗氧化活性比较
分析，旨在从中筛选出具有较高抗氧化活性的海藻，并研究其抗氧化活性部位，为开发海藻源抗氧化剂提
供科学依据.
1 材料与方法
1.1材料
10 种供试海藻采自中国福建泉州围头半岛海域，分别为褐藻 4 种（羊栖菜 Sargasum fusiforme (Harv.)
Setch，裙带菜 Undaria pinnatifida (Harvey) Suringar，鼠尾藻 Sargassum thunbergi i (Mert.) O Kuntze，铁钉菜
Ishige okamuraeYendo）；红藻 4 种（江篱 Gracilaria confervoides (L.) Grev.，珊瑚藻 Corallina offcinalis L.，叉
珊藻 Jania decussato -dichotoma Yendo， 叉节藻 Amphiroa ephedraea Decaisne）； 绿藻 2 种 （肠浒苔
Enteromorpha intestinalis (L.) Link.，长石莼 Ulva linza L.）.
1.2 海藻提取物制备
新鲜海藻用海水洗除杂质与杂藻，室温风机阴干，粉碎过 35 目筛（孔径 0.5 mm），－20°C 密封贮存备
用. 取 100 g 干藻粉加入 10 倍量体积（mL）的 MeOH，暗处振摇（180 rpm）提取 3 次，72 h/次，提取液抽滤，
合并滤液，滤液过 0.22 μ 尼龙滤膜以滤除微细不溶物，所得滤液再经 40 °C 减压浓缩去甲醇得甲醇提取
物[10]. 甲醇提取物以二甲亚砜（DMSO）配成浓度为 10 mg/ml母液，4 °C贮存备用.
用蒸馏水溶解甲醇提取物制成混悬液，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇等不同极性溶剂
充分萃取，真空旋转浓缩各萃取液，干制后获得石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及
水部位，低温保存备用.
1.3 总酚、总黄酮、总糖含量测定
微板－福林酚法测定总酚含量，结果以等量没食子酸（GAE）计[11]；总黄酮含量测定采用微板法，含量以
等量芦丁（RE）计[12]；总糖含量采用苯酚-硫酸法，含量以等量葡萄糖(GE)计[13].
1.4 抗氧化活性检测
1.4.1总抗氧化能力检测 (ABTS法)
在适当的氧化剂作用下，2,2-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) 氧化成绿色的
ABTS+，当存在抗氧化物，ABTS+的产生会被抑制，测定 734 nm 处 ABTS+的吸光度，可计算出样品的总抗氧
化能力. 按 ABTS 试剂盒法（碧云天 Beyotime 公司）将 ABTS 溶液与氧化剂溶液等体积混合，室温暗处放
置 16 h 作为 ABTS 工作母液，使用前把 ABTS 工作母液用 PBS 或 80%乙醇稀释成 ABTS 工作液，并调节
734 nm 处的吸光度为 0.700 ± 0.05. 在 96 孔板的每个检测孔中加入 190 μL ABTS 工作液，空白对照孔中
加入 10 μL 蒸馏水；样品检测孔内加入 10 μL 样液，标准曲线检测孔内加入 10 μL 各种浓度的 Trolox 标
准溶液，轻轻混匀. 室温孵育 6 min 后测定 A734，设 3 次重复. 计算出 ABTS+自由基清除率，并根据 Trolox
标准曲线计算出样品的总抗氧化能力，总氧化能力以 Trolox-Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC，mmol/
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mg)来表示.
1.4.2 DPPH自由基清除能力测定
微孔板法参照黄晓冬等 [14]的方法. 分光光度法参照陆占国 [15]的方法稍加改动：在试管中加入样液(以
DMSO 配制)0.2 mL，4.0 mL 6×10-5 mol/L 的 DPPH 甲醇液， 混匀，15 min 后于波长 517 nm 处测定吸光度
A1；以等体积的 DMSO 代替样液，测得吸光度 A0，以等体积的甲醇代替 DPPH 甲醇液测得本底值 A2. 按下
式计算样液对 DPPH 自由基的清除率 C%＝[A0-(A1-A2)]/A0 ×100%，以 2,6-二叔丁基对甲酚（BHT）为阳性
对照，实验重复 3次，结果以平均值±标准差（X±SD）表示.
1.4.3还原力测定
采用蔡建秀等[16]的测定方法. 样液(以 DMSO配制)1.0 mL与 2.5 mL pH 6.6的 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液
混合，加入 1.0 ％铁氰化钾 2.5 mL，50 ℃恒温水浴 20 min，冰浴冷却，再加入 2.5mL 10 ％三氯乙酸，离心
10 min. 离心后取上层清液 2.5 mL，加入 2.5mLH2O 和 2.5 mL0.1％FeCl3混合均匀，随即 700 nm 处测定吸
光度，以吸光度对样液浓度作图，拟合方程并求出吸光度为 0.500 时所对应的样品浓度，作为 EC50. 以维
生素 C为阳性对照，实验重复 3次，结果以平均值±标准差（X±SD）表示.
1.4.4总抗氧化能力测定（T-AOC法）
取 0.1 mL0.1 mg/mL 样液(以 DMSO 配制)按总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒(南京建成生物工程研
究所)的方法加入各种试剂，在 520 nm 下测定其吸光度值，按下式计算总抗氧化能力=[(测定管 OD 值-对
照管 OD值)×反应液总量×样液测试前稀释倍数]/（0.01×30×取样量）.
1.4.5 金属离子对样品自由基清除能力影响的测定
参照黄晓冬[17]等的方法. 选取样品对 DPPH自由基清除率为 50%时所对应的样液浓度进行实验，在总
体积为 5 mL的 DPPH自由基清除反应体系（0.2 mL 样液+4.0 mLDPPH 甲醇液+0.8 mLH20）中加入 MnCl2、
CuCl2、MgCl2、AlCl3、ZnCl2、KCl、NaCl、CaCl2、FeCl3等金属盐， 使体系中金属离子的质量体积浓度为 1.0 mg/
mL. 摇匀混合 15 min 后，于波长 517 nm 处测定吸光度，同时以甲醇代替 DPPH 甲醇液测定体系本底值，
以不加金属离子的为空白对照， 求出 DPPH 自由基清除率并按下式计算影响率 /%=(加金属离子后的
DPPH自由基清除率－空白对照 DPPH清自由基除率）/空白对照 DPPH自由基清除率×100%， 并以此评价
金属离子对样品自由基清除活性的影响.
2 结果与分析
2.1 10种海藻甲醇提取物抗氧化能力及其主要化学成分含量的比较
以 ABTS 法、DPPH 自由清除法比较 10 种海藻甲醇提取物的抗氧化能力， 并分别测定甲醇提取物的
总酚、总黄酮与总糖含量，结果见表 1. 由表 1 可知，铁钉菜甲醇提取物的 TEAC 值为 0.102 mmol/mg，10
mg/mL 浓度时 DPPH自由基清除率高达 94.56 %，总酚含量约为 51.37 mg/g，总黄酮含量约 43.16 mg /g，均
高于其它藻类甲醇提取物，差异具有统计学意义（P＜0.01）. 对海藻甲醇提取物总酚、总黄酮、总糖含量与
TEAC、DPPH 自由基清除率进行线性相关回归分析， 结果发现总酚含量与 TEAC、DPPH 自由基清除率之
间具有较好的线性正相关（见图 1），线性回归方程分别为 y = 0.0016x + 0.0161（R2 0.7357， P＜0.01）与 y=
1.9401x -8.8274（R2 0.8692 ，P＜0.01），表现为总酚含量高，TEAC、DPPH自由基清除率也高；总黄酮含量也
与 TEAC、DPPH自由基清除率之间具有一定的线性正相关， 但总糖含量与 TEAC、DPPH 自由基清除率不
具有线性相关 （P＞0.05）. 基于 10 种海藻甲醇提取物抗氧化活性及其主要化学成分含量的比较与分析可
知，相比于其它海藻，褐藻铁钉菜甲醇提取物具有高含量的总酚，并且也表现出较强的抗氧化活性，因此，
后续的研究选择该藻进一步深入分析其抗氧化活性部位.
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2.2 海藻铁钉菜甲醇提取物的抗氧化活性部位
为了筛选铁钉菜甲醇提取物的抗氧化活性部位，对其石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正
丁醇部位及水部位等萃取部位进行 DPPH自由基清除率与总酚含量的比较，实验结果见表 2. 表 2 显示在
相同的浓度下，铁钉菜乙酸乙酯部位的 DPPH 自由基清除率最高，与其它部位的差异具有统计学意义（P＜
0.01）；在 1.0 mg/mL 浓度时，铁钉菜乙酸乙酯部位的 DPPH 自由基清除率达到 89.48 %，相应的其总酚含
量也高于其它萃取部位（P＜0.01）.
种类 TEAC 值 10 mg/mL 样液 总酚含量 总黄酮含量 总糖含量
mmol/mg 浓度时的 DPPH mgGAE/g mg RE/g mgGE/g
自由基清除率/%
羊栖菜 0.030±0.001 23.26±0.39 10.60±0.95 10.54±3.07 33.43±4.95
裙带菜 0.049±0.003 24.39±1.73 10.99±2.14 11.86±3.46 27.79±3.03
鼠尾藻 0.022±0.002 12.97±2.92 7.14±2.72 6.90 ±0.48 15.59±3.03
铁钉菜 0.102±0.001 94.56±0.68 51.37±2.77 43.16±0.33 35.92±5.27
江篱 0.012±0.001 13.85±1.35 11.80±0.62 17.87±1.39 65.17±12.14
珊瑚藻 0.049±0.001 5.06±0.61 13.22±1.13 26.71±3.42 62.57±9.11
叉珊瑚藻 0.046±0.001 6.64±2.27 13.01±0.59 22.85±1.04 50.83±4.63
叉节藻 0.047±0.004 6.85±0.32 13.01±0.23 32.61±3.16 37.27±8.79
肠浒苔 0.026±0.000 8.67±2.89 7.48±0.21 30.50±2.05 7.91±2.40
长石莼 0.025±0.001 5.90±1.43 12.14±0.43 22.55±3.88 20.56±2.40
表 1 10 种海藻甲醇提取物抗氧化能力及其主要化学成分含量的比较
图 1 海藻甲醇提取物的 TEAC 值、DPPH 清除率与总酚含量之间的相关性分析
样品 DPPH 自由基清除率/% 总酚含量 mgGAE/g
0.1 mg/mL 0.5 mg/mL 1 mg/mL
石油醚部位 21.42±0.24A 49.52±0.16A 67.95±0.64A 13.75±1.08A
二氯甲烷部位 5.18±1.31B 7.59±0.33B 12.02±0.42B 20.10±0.22B
乙酸乙酯部位 49.36±0.42C 75.85±0.61C 89.48±0.33C 29.96±0.65C
正丁醇部位 15.54±0.73D 31.25±0.42D 44.71±1.00D 27.92±0.11D
水部位 27.24±0.32E 40.22±0.16E 51.01±0.49E 27.49±0.11D
表 2 铁钉菜 5 种不同溶剂萃取物的 DPPH 自由基清除能力与总酚含量
注：采用 Duncans multiple range test 方法分析，同列不同大写字母表示差异具有统计学意义（P＜0.01，n=3）
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进一步测定铁钉菜甲醇提取物乙酸乙酯部位对 DPPH 自由基清除的量效关系以及还原铁离子能力，
结果如图 2，3. 由图 2拟合曲线方程回归方程并求出铁钉菜甲醇提取物乙酸乙酯部位对 DPPH自由基.
图 2 铁钉菜乙酸乙酯部位的 DPPH 清除能力 图 3 铁钉菜乙酸乙酯部位的还原力
清除的半效应浓度 EC50为 0.17 mg/mL， 小于相同条件下测得的 BHT EC50 0.23 mg/mL. 图 3显示铁钉菜乙
酸乙酯部位在浓度为 0.0～0.8 mg/mL范围内还原力随样液浓度增高而增强，量效呈明显的线性正相关，经线
性方程拟合并计算出还原力的 EC50为 0.30 mg/mL，远远小于相同条件下测得维生素 C EC50 0.91 mg/mL. 另
外，总抗氧化能力（T-AOC）测定法测得铁钉菜乙酸乙酯部位的总抗氧化能力为 13.16 U/mg.
2.3金属离子对海藻铁钉菜活性部位抗氧化能力的影响
以加入金属离子前后 DPPH自由基清除率的变化表征金属离子对海藻铁钉菜活性部位抗氧化能力的
影响，实验结果如表 3. 由表 3 可知，DPPH 自由基清除体系中 1.0 mg/mL 的 K+、Cu2+、 Zn2+、Ca2+、Fe3+等可增
强铁钉菜乙酸乙酯部位的 DPPH自由基清除率，分别与空白对照组差异达统计学意义（P＜0.01），以 Cu2+、Fe3+
的增效作用最为显著；Na+、Mn2+、Mg2+等可抑制铁钉菜乙酸乙酯部位的 DPPH自由基清除率，分别与空白对
照组差异达统计学意义（P＜0.01）；Al3+对钉菜乙酸乙酯部位的 DPPH 自由基清除率没有较大影响，与空白
对照组差异不具有统计学意义（P＞0.05）.
金属离子 DPPH 自由基清除率/% 影响率/%
空白对照（CK） 48.45±0.45
K+ 51.91±0.60 7.14**
Na+ 45.90±1.05 -5.26**
Mn2+ 46.41±0.52 -4.20**
Al3+ 47.68±0.45 -1.58
Mg2+ 46.00±0.70 -5.04**
Cu2+ 62.09±0.60 28.16**
Zn2+ 60.46±0.24 24.79 **
Ca2+ 52.37±0.53 8.09 **
Fe3+ 62.19±0.15 28.36 **
表 3 金属离子对铁钉菜活性部位 DPPH 自由基清除能力的影响
注：** 表示与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.01，n=3）
陈景明, 黄晓冬, 蔡建秀, 顾雅青： 海藻铁钉菜抗氧化活性部位研究
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3 结论与讨论
对产自福建围头湾的 10 种海藻进行体外抗氧化活性的比较研究，发现 10 种海藻的抗氧化活性与总
酚含量呈正相关，褐藻铁钉菜甲醇提取物具有较强的抗氧化活性，总酚含量高达 51.37 mg/g. 实验进一步
对铁钉菜甲醇提取物进行梯度萃取并获得石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及水部
位等萃取部位，经测定与比较各部位的抗氧化活性与总酚含量，发现乙酸乙酯部位是铁钉菜主要的抗氧
化活性部位，其抗氧化活性与总酚含量（29.96 mg/g）均明显高于其它部位，差异均具有统计意义（P＜0.01）.
进一步的实验发现铁钉菜乙酸乙酯部位对 DPPH 自由基清除的半效应浓度 EC50为 0.17 mg/mL， 小于
BHT EC50 0.23 mg/mL；还原力的 EC50为 0.30 mg/mL，远远小于维生素 C EC50 0.91 mg/mL；总抗氧化能力
约为 13.16 U/mg. 但是，相关性分析发现各部位的抗氧化活性（以 DPPH 自由基清除率表示 ）与总酚含量
之间不存在显著的相关性（P＞0.05），这说明了各部位的抗氧化活性不是简单的取决于总酚含量，还可能与
所含酚类化合物的类型与结构有关. 研究者发现酚类化合物由于具有酚羟基而表现出抗氧化性， 但其抗
氧化性的强弱与酚羟基的数量、位置均有密切的关系[18]，褐藻多酚结构上的连三酚羟基就比间三酚羟基具
有较强的还原性和自由基捕捉活性[19]. 后续的研究可对铁钉菜乙酸乙酯部位进行柱层析分离，并进行活性
追踪以发现其抗氧化活性的物质基础.
在应用抗氧化剂时，抗氧化剂的稳定性是必须考虑的关键问题，温度、pH、食品添加剂与金属离子等
多种因素均可能影响抗氧化剂的稳定性与抗氧化活性. 中药配位化学学说指出中药的有效成分除主要是
有机分子外，还可以是其中的微量元素，更可能是有机分子与微量元素组成的配位化合物而实现药效活
性[20]. 开发使用铁钉菜乙酸乙酯部位作为食品抗氧化剂时，不同金属离子与铁钉菜乙酸乙酯部位的有机分
子有可能形成不同的配合物，从而对其抗氧化活性产生不同的影响. 有研究指出 Cu2+与芦丁[21]、Fe3+与槲皮
万寿菊素 [22]形成的配合物可明显增强 DPPH 自由基清除率作用，实验发现 DPPH 自由基清除体系中 1.0
mg/mL 的 Cu2+、Fe3+对铁钉菜乙酸乙酯部位的 DPPH自由基清除率亦有显著的增效作用， 由于 Cu2+、Fe3+等
在食品氧化中常起催化作用， 铁钉菜乙酸乙酯部位与 Cu2+、Fe3+的相互作用一方面增强了其自由基清除活
性，另一方面清除了 Cu2+、Fe3+对食品氧化的不良影响. 此外，根据 K+、Zn2+、Ca2+对铁钉菜乙酸乙酯部位的增
效作用与 Na+、Mn2+、Mg2+等的降效作用等特点，在食品中使用铁钉菜乙酸乙酯部位时，可使之具有高钾低
钠、增锌补钙的功能食品特点，但应尽量避免与 Mn2+、Mg2+接触，以免影响其抗氧化能力.
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［责任编辑： 钟国翔］
陈景明, 黄晓冬, 蔡建秀, 顾雅青： 海藻铁钉菜抗氧化活性部位研究
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