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菌物学报   
jwxt@im.ac.cn  22 March 2016, 35(3): 343‐354 
Http://journals.im.ac.cn  Mycosystema    ISSN1672‐6472    CN11‐5180/Q   
Tel: +86‐10‐64807521  Copyright © 2016 Institute of Microbiology, CAS. All rights reserved.
研究论文 Research paper      DOI: 10.13346/j.mycosystema.140267 
 
                                                                 
基金项目：公益性行业（农业）科研专项（201003004）；国家自然科学基金（31170022） 
Supported by the Special Fund for Agro‐scientific Research in the Public Interest of China (201003004) and the National Natural 
Science Foundation of China (31170022). 
*Corresponding author. E‐mail: hsyuan@iae.ac.cn 
Received: 2014‐11‐15, accepted: 2015‐05‐10 
 
桦褶孔菌漆酶固定化及其对染料的降解   
曹文娟 1, 2     袁海生 1* 
1中国科学院沈阳应用生态研究所 森林与土壤生态国家重点实验室 辽宁  沈阳  110164 
2中国科学院大学 北京  100049 
 
 
 
摘    要：采用壳聚糖交联法和海藻酸钠‐壳聚糖包埋交联法固定化桦褶孔菌产生的漆酶，探讨最佳固定化条件，固定化漆
酶的温度、pH 稳定性及操作稳定性，并以两种固定化酶分别对 4 种染料进行了降解。结果表明：（1）壳聚糖交联法固定
化漆酶的最佳条件为：壳聚糖 2.5%，戊二醛 7%，交联时间 2h，固定化时间 5h，给酶量 1g 壳聚糖小球:1mL 酶液（1U/mL），
固定化效率 56%；（2）海藻酸钠‐壳聚糖包埋交联法固定化漆酶的最佳条件为：海藻酸钠浓度 4%，壳聚糖浓度 0.7%，氯
化钙浓度 5%，戊二醛浓度 0.6%，给酶量 4mL 4%海藻酸钠:1mL 酶液（1U/mL），固定化效率高达 86%；（3）固定化的漆酶
相比游离漆酶有更好的温度和 pH稳定性；（4）比较两种固定化漆酶，海藻酸钠‐壳聚糖包埋交联法固定化酶的温度及酸度稳
定性要优于壳聚糖固定化酶，但可重复操作性要弱于后者，两者重复使用 8 次后的剩余酶活比率分别为 71%及 64%；（5）
两种固定化酶对所选的 4 种不同结构的合成染料均有较好的降解效果，其中壳聚糖固定化酶对茜素红的降解效果及重复
使用性极佳，重复降解 40mg/L 的茜素红 10 次，降解率仍保持在 100%。 
关键词：固定化漆酶，壳聚糖，海藻酸钠，条件优化，染料降解 
 
Immobilization and dye degradation of laccase from Lenzites betulina 
CAO Wen‐Juan1, 2      YUAN Hai‐Sheng1* 
1State Key Laboratory of Forest and Soil Ecology,  Institute of Applied Ecology, Chinese Academy of Sciences, Shenyang, Liaoning 
110164, China 
2University of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China 
 
Abstract: Chitosan  cross‐linking and  sodium alginate‐chitosan entrapment  cross‐linking methods were adopted  to  immobilize 
laccase  produced  by  Lenzites  betulina,  and  the  immobilization  conditions  were  optimized.  The  thermal,  pH  and  operation 
stability of the immobilized laccase were also investigated. The immobilized enzymes were used to degrade four synthetic dyes 
with different  chemical  structures. The  results  showed  that  the best  immobilized  conditions of  chitosan  cross‐linking method 
were  as  follows:  chitosan  2.5%,  glutaraldehyde  7%,  cross‐linking  period  of  2h,  immobilization  period  of  5h, mixture  ratio  of 
enzyme  (1U/mL)  and  chitosan  beads  (g)=1:1.  Under  these  conditions  the  immobilization  efficiency  reached  56%.  The  best 
   
  ISSN1672‐6472    CN11‐5180/Q    Mycosystema    March 22, 2016    Vol. 35    No. 3 
   
   
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immobilized  conditions  of  alginate‐chitosan  entrapment  cross‐linking  method  were:  4%  of  sodium  alginate  concentration, 
chitosan 0.7%, calcium chloride 5%, glutaraldehyde 0.6%, 1:4 mixing ratio of enzyme (1U/mL) and 4% sodium alginate solution. 
Under  these  conditions,  the  immobilization  efficiency  reached  86%.  The  results  indicated  that  the  immobilized  laccase  had 
higher temperature and pH stability than the free laccase. The stability of enzyme immobilized by alginate‐chitosan was higher 
than that by chitosan, but the reuse operability of the former was not as good as that of the latter. After eight times of repeated 
use, the remaining enzyme activity of alginate‐chitosan and chitosan were 71% and 64%, respectively. Both of the  immobilized 
enzymes were  proved  to  be well  capable  of  degrading  four  kinds  of  synthetic  dyes.  The  significant  degradation  effect was 
achieved by using chitosan‐immobilized enzyme on Alizarin red with 40mg/L concentration. The Alizarin red clearance was kept 
at 100% during ten times of repeated use in degradation. 
Key words: immobilized laccase, chitosan, alginate, condition optimization, dye degradation 
 
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，最早是从漆树
的汁液中发现的（Giardina et al. 2010；Morozova et 
al. 2007），后来也发现其存在于植物、昆虫和细菌
中（Madhavi &  Lele  2009），特别是白腐菌中分布
更广泛。漆酶具有底物广泛性、催化效率高等优点，
使其在有机合成（Witayakran & Ragauskas 2009）、
纸浆漂白（Moldes et al. 2010）、染料脱色（Khlifi 
et al. 2009；Daâssi et al. 2012；袁海生等  2010；司
静等  2011a，2011b；Si & Cui 2013；Si et al. 2013，
2014）、生物修复和环境中有毒化合物的消除
（Lloret et al. 2012）等多个领域受到人们的广泛关
注。然而，游离酶生产成本高，不能实现与产物的
分离，且不可重复利用，因此在工业应用中受到了
限制（Rehman et al. 2014）。固定化酶技术为以上
问题提供了解决途径，不但使酶具有了更好的稳定
性，还实现了酶与产物的分离，节省了经济成本，
实现了循环利用（Sheldon 2007）。 
目前，用于漆酶固定化的方法有多种，归纳为
以下4种：吸附法、包埋法、交联法和共价结合法。
Daâssi  et  al.（2014）利用海藻酸钠包埋法固定了
Coriolopsis gllica的漆酶，Jiang  et al.（2005）利用
磁性壳聚糖微球对Pycnoporus  sanguineus  漆酶进
行了固定化，而Merle et al.（2008）则以聚吡咯为
载体完成了对Trametes versicolor漆酶的固定化。没
有一种方法是可以用于所有酶的固定化的
（Stefano et al. 2009），因此对不同类型的漆酶进
行固定化酶方法的选择有着很重要的意义。选择的
固定化载体须具备以下特征：（1）不溶；（2）与酶
有很好的相容性；（3）在固定化的过程中能够保持
酶活性，还应该考虑酶与载体表面有无不良反应
（Silva et al. 2007）。此外，底物是否容易扩散进
入载体也应成为考虑的方面，无孔的载体有最小的
底物扩散限制，但是固定的酶比较少，多孔材料虽
然能够固定大量的酶，但大分子的底物扩散就受到
限制（Arica et al. 2009）。因此在选择载体的时候
应将固定化率和固定化以后的酶活两个方面加以
综合考虑。 
壳聚糖化学名称聚葡萄糖胺(1,4)‐2‐氨基‐B‐D
葡萄糖，是从甲壳动物的壳中提取出来的甲壳素脱
乙酰化以后的产物，其分子链上含有大量的氨基，
是固定化酶中的常用载体，如固定化果胶酶
（Rehman et al. 2014）、漆酶等。壳聚糖‐戊二醛交
联法固定化酶原理是利用戊二醛的两个醛基，可作
为双功能基团的交联剂，其中一个醛基可以与壳聚
糖上的氨基连接，而另一个氨基可以与要固定的蛋
白质连接，因此起到交联剂的作用，从而将酶固定
在已与戊二醛交联的壳聚糖内。 
海藻酸钠‐壳聚糖共固定化方法是一种包埋和
交联相结合的固定化方法。海藻酸钠是从海藻中提
取的一种亲水性胶态多糖，可生物降解，具有生物
相容性好、无毒、稳定、成球性好等优点，也广泛
用于固定化酶的载体（刘峥等 2006），如固定化脂
曹文娟和袁海生 /桦褶孔菌漆酶固定化及其对染料的降解
 
 
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肪酶（鲁玉侠等  2007）、谷酰胺转氨酶（张春红等 
2006）、漆酶（Rehman et al. 2014）等。在合适的
pH 下，壳聚糖的氨基易形成阳离子聚电解质，而
海藻酸钠的羧基易形成阴离子聚电解质，两者相互
吸引形成稳定的聚电解质化合物（Zhou  et  al. 
2010），同时在海藻酸钠外部的壳聚糖还可以与戊
二醛交联，形成 schiff 碱，在固定化的过程中起到
交联的效果。 
本研究的对象桦褶孔菌 Lenzites betulina Yuan 
4962是从 50多种白腐菌中筛选出的产漆酶能力较
强的菌株，目前对桦褶孔菌漆酶的固定化也缺少研
究，因此探讨和研究桦褶孔菌漆酶的固定化方法具
有一定理论和实际意义。实验前期我们通过 5 种方
式对桦褶孔菌所产漆酶进行了固定化基质初筛，分
别为海藻酸钠包埋法、海藻酸钠‐戊二醛交联包埋
法、壳聚糖‐铜法、壳聚糖‐戊二醛交联固定化、海
藻酸钠‐壳聚糖共固定化，由于前 3 种方式得到的
固定化率均小于 5%，因此本实验选择以壳聚糖固
定化以及海藻酸钠‐壳聚糖共固定化，研究固定化
酶的部分酶性质，并将其运用于合成染料的降解，
以期为固定化桦褶孔菌漆酶的开发和利用提供理
论依据。 
1 材料与方法 
1.1 实验材料和试剂 
1.1.1  菌种来源：桦褶孔菌 Lenzites  betulina  菌株
Yuan4962，采集于黑龙江省大亮子河国家森林公
园，经分离纯化获得，现保存于中国科学院沈阳应
用生态研究所森林与土壤生态国家重点实验室。 
1.1.2  漆酶：由本实验室将菌株桦褶孔菌  Lenzites 
betulina Yuan4962 的液体发酵液经盐析、透析、冷
冻干燥等步骤获得。 
1.1.3  试剂：壳聚糖（脱乙酰度 80%–85%，国药集
团），海藻酸钠，戊二醛（25%），冰醋酸，氯化钙，
磷酸氢二钠，柠檬酸等试剂均为分析纯。 
1.2 固定化漆酶的制备 
1.2.1  壳聚糖交联法固定化漆酶（以下简称 M1）：
称取 0.25g  壳聚糖于 10mL 1%冰醋酸中，搅拌至溶
解，用 5mL 无菌注射器吸取壳聚糖溶液，将其注
入成型剂 2mol/L  NaOH 溶液中，立即形成光滑微
球，滤出小球，去离子水洗至 pH 6.5；将小球放入
3%戊二醛溶液中于 4℃交联 2h，成为功能化的壳
聚糖小球，取出后洗净小球，以 1mL:1g（湿重）
的比例加入酶液与壳聚糖小球混合，25℃固定 4h，
取出小球，洗去残留酶液，即制得固定化漆酶（张
莉和贾志宽  2009）。 
1.2.2  海藻酸钠‐壳聚糖共固定化漆酶（以下简称
M2）：称取 0.4g 海藻酸钠于 10mL 蒸馏水中，搅拌
至完全溶解，以海藻酸钠与酶液体积比 4:1 的比例
加入酶液与海藻酸钠均匀混合，用 1%的冰醋酸配
制 1%的壳聚糖溶液，并向其中加入 CaCl2 至 5%，
混匀，磁力搅拌器匀速搅拌，备用。用 5mL 注射
器将已包埋酶的海藻酸钠溶液匀速注入壳聚糖‐氯
化钙混合液中，成细管状的固定化酶，20s 后滤出，
洗净，放入 1%的戊二醛中 4℃交联 2h。取出洗净，
即得固定化漆酶（张莉和贾志宽  2009）。 
1.3 固定化酶的单因素实验 
1.3.1  固定化漆酶 M1 单因素实验：漆酶浓度为
1–8U/mL，戊二醛浓度为 1%–10%，交联时间为
1–14h，固定化时间为 1–10h。 
1.3.2  固定化漆酶 M2 单因素实验：壳聚糖浓度为
0.2%–1%，CaCl2 浓度为 1%–9%，戊二醛浓度为
0.1%–1.2%，交联时间为 1–8h。 
1.4 游离漆酶与固定化漆酶酶活力的测定 
1.4.1  游离酶活性测定：1.8mL 50mmol/L pH 4.0 的
丙二酸‐丙二酸钠缓冲液，100μL 10mmol/L 的 ABTS
溶液，加入 100μL 酶液，摇床反应 3min，测 3min
内的吸光度变化。 
1.4.2  固定化酶活性测定：分别称取 0.1g M1、M2，
加入丙二酸‐丙二酸钠缓冲液 1.9mL以及 10mmol/L
的 ABTS 溶液 100μL，置于 25℃，140r/min 摇床反
   
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应 3min，420nm 测吸光度值。 
酶活力定义：25℃下，1min 转化 1μmol 底物
的酶量，称为 1 个酶活力单位。 
1.5 固定化酶酶活性保持率的计算方法 
固定化酶酶活性保持率(%)=固定化后固定酶
活力/加入溶液酶活力×100%。 
1.6 固定化酶和游离酶热稳定性比较 
分别称取 0.1g M1、M2，并取 100μL 酶液，分
别放于 3 支 5mL 塑料离心管中，置于 60℃恒温水
浴锅中，每隔半小时取出一组测酶活。以每种酶各
自最适条件下的酶活为 100%。 
1.7 固定化酶和游离酶 pH稳定性比较 
分别称取 0.1g M1、M2，并取 100μL 酶液，分
别放于 3 支 5mL 塑料离心管中，置于 pH  2–8（间
隔 0.5 个 pH 单位）的 50mmol/L 柠檬酸‐磷酸氢二
钠缓冲液中，4℃下放置 24h 后测剩余酶活。以每
种酶各自最适条件下的酶活为 100%。 
1.8 固定化酶操作稳定性研究 
按照 1.4 的方法称取 0.1g 固定化酶测酶活，每
次反应完成后，将固定化酶置于摇床上，用缓冲液
反复清洗，直至检测清洗的液体 420nm 吸光度
<0.001。再次重复以上方法进行漆酶活性测定，并
以第一次酶活力为 100%，计算每次重复使用的相
对酶活。 
1.9 固定化酶对染料的降解 
1.9.1  M1、M2 对 4 种染料的降解：用 50mmol/L     
pH 4.0的丙二酸‐丙二酸钠缓冲液配制 40mg/L的 4
种染料，分别为中性红、茜素红、结晶紫以及橙黄
G，分别于 526nm、419nm、578nm 和 474nm 测吸
光度。以 1g:5mL 染料的比例加入固定化酶，25℃、
140r/min 摇床降解 12h 后测吸光度。降解结束后，
缓冲液清洗固定化酶后继续加入 5mL 染料，再次
降解 12h，重复两次。 
降解率计算方法：染料降解率=(Ai‐A0)/Ai，
其中 Ai 为脱色前的吸光度，A0 为脱色 12h 后的
吸光度。 
1.9.2  壳聚糖固定化酶对茜素红的降解：方法与
1.9.1 类似，降解时间缩短为 20min，重复使用次
数增加至 20 次，记录每次的吸光度。 
2 结果与分析 
2.1 影响 M1固定化的因素 
2.1.1  戊二醛浓度对 M1 固定化的影响：戊二醛作
为交联剂使酶与载体结合，起着非常重要的作用。
当戊二醛质量分数在 1%–6%时，酶固定化率呈上
升趋势，7%时达到最大值，之后再增加戊二醛浓
度，酶固定化效率开始下降，当戊二醛浓度增加到
9%时，酶固定化率要比最大值低 40%（图 1）。可
见，戊二醛的浓度对固定化效果有很大影响。分析
原因：戊二醛是一种含有两个醛基的双功能基团试
剂，能够使壳聚糖的氨基通过它而偶联，在交联固
定中是一个优良的交联剂，作用是使壳聚糖载体的
氨基得到活化，具有连接酶的能力。过低的交联剂
浓度不能使壳聚糖的氨基得到充分活化，因此固定
化效率较低，相反，当交联剂浓度过高时，壳聚糖
上得到活化的氨基过多，造成酶的结合过于拥挤，
由此可能会使酶的活性位点的三维结构受到影响，
不能发挥酶活力（Rehman et al. 2014）。还有人认
为，过高的戊二醛浓度还有可能造成壳聚糖发生分 
 
 
 
图 1 戊二醛浓度对 M1固定化效果的影响 
Fig.  1  Effects  of  glutaraldehyde  concentration  on  the 
immobilization efficiency of M1. M1: Laccase immobilized by 
chitosan cross‐linking method (the same below). 
曹文娟和袁海生 /桦褶孔菌漆酶固定化及其对染料的降解
 
 
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子内或与壳聚糖分子间的交联，从而大大降低载体
与酶的结合能力（赵慕馨等  2002）。因此本实验
中戊二醛浓度选择 7%。 
2.1.2  交联时间对 M1 固定化的影响：在交联 2h
时，酶固定化效率最高，随着交联时间的进一步增
加，固定化效率呈下降趋势（图 2）。分析原因：
交联时间对固定化效果的影响与交联剂浓度的影
响基本一致，交联时间过短，壳聚糖的氨基得不到
充分活化，因而能结合的酶就少，固定化效率低，
若交联时间过长，就会造成在固定化过程中连接的
酶过多，可能改变酶活性位点的三维结构使得酶不
能发挥正常酶活性（Rehman et al. 2014）。如图所
示，交联时间 2h 时，酶固定化效率最高，可能此
时壳聚糖交联度正好适宜于漆酶分子的结合，因此
选择 2h 为最佳交联时间。 
 
 
 
图 2 交联时间对 M1固定化效果的影响 
Fig.  2  Effects  of  cross‐linking  period  on  the  immobilization 
efficiency of M1. 
 
2.1.3  酶浓度对 M1 固定化的影响：酶浓度太低则
会造成固定化酶的活力过低，太高则会造成固定化
效率降低造成酶的浪费，因此选择合适的酶浓度对
固定化有重要的意义（Wang et al. 2014）。随着酶
浓度的升高（0.5–8U/mL），固定化酶的酶活总体呈
上升趋势，而固定化率却不断下降（图 3）。综合两
方面考虑，选择酶浓度 1U/mL 作为固定化最佳酶
浓度。 
 
 
图 3 漆酶浓度对 M1固定化效果的影响 
Fig. 3 Effects of  laccase concentration on the  immobilization 
efficiency of M1. 
 
2.1.4  固定化时间对固定化的影响：固定化时间在
5h 时，固定化效率最高，继续延长固定化时间并
没有增加固定化率，相反还使其降低（图 4）。分析
原因：漆酶分子在固定化时不断与载体连接，若固
定化时间过短，会导致漆酶分子与载体连接，因此
造成固定化效率较低，随着固定化时间的延长，壳
聚糖完全结合漆酶达到一个最大值，这时得到的固
定化效率最高，再继续增加固定化的时间，就会造 
 
 
 
图 4 固定化时间对 M1固定化效果的影响 
Fig.  4  Effects  of  immobilized  period  on  the  immobilization 
efficiency of M1. 
   
  ISSN1672‐6472    CN11‐5180/Q    Mycosystema    March 22, 2016    Vol. 35    No. 3 
   
   
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成载体上的漆酶分子过于拥挤，影响酶活性位点的
正常结构，因此检测到的酶活就低（Rehman et al. 
2014）。也有人认为，当固定化时间过长，漆酶的
活性会因为与壳聚糖上的戊二醛过度反应而使酶
活降低（Zhang et al. 2009）。因此，本实验选择 5h
作为壳聚糖固定化酶的最佳时间。 
2.2 影响 M2固定化的因素 
2.2.1  壳聚糖浓度对 M2 固定化的影响：随着壳聚
糖浓度的增大，酶固定化率呈先增高后降低的趋
势，当壳聚糖质量分数在 0.7%时，固定化效率达
最大值，高达 76%（图 5）。分析原因：当壳聚糖
浓度较低时，不能与海藻酸钠形成一个有效的聚电
解质化合物，也不能与戊二醛有效交联，因此固定
化效果较差，当壳聚糖增加到合适的浓度时，壳聚
糖与海藻酸钠不仅可以形成稳定的聚电解质化合
物，而且与戊二醛交联可以形成一层致密的保护
膜，增加了微胶囊球的强度，从而使得固定化酶的
效率提高。但如果继续增加壳聚糖的浓度就会使得
壳聚糖分子排列过于紧密，不但造成底物扩散困
难，而且不利于与戊二醛的交联，因此固定化效率
降低（徐国英等  2008）。从图中可以确定最适壳
聚糖浓度为 0.6%。 
 
图 5 壳聚糖浓度对 M2固定化效果的影响 
Fig. 5 Effects of chitosan concentration on the immobilization 
efficiency  of  M2.  M2:  Laccase  immobilized  by 
alginate‐chitosan  entrapment  cross‐linking  method  (the 
same below). 
2.2.2  氯化钙浓度对 M2 固定化的影响：氯化钙浓
度在 5%时，固定化效率是最高的，继续增加钙离
子浓度反而会使固定化效率降低（图 6）。分析原因：
一定的钙离子浓度可以维持凝胶的强度，有利于固
定化，但同时钙离子对漆酶有一定的抑制作用，过
高的钙离子浓度会逐渐抑制漆酶活性，表现为固定
化率的降低（徐国英等  2008）。 
 
 
图 6 氯化钙浓度对 M1固定化效果的影响 
Fig.  6  Effects  of  calcium  chloride  concentration  on  the 
immobilization efficiency of M2. 
 
2.2.3  戊二醛质量分数对 M2 固定化的影响：随着
戊二醛浓度的增加，酶固定化率呈先增加后减小的
趋势，在 0.7%时固定化效果最好（图 7）。分析原
因：戊二醛浓度过高或过低都不利于在海藻酸钠表 
 
 
图 7 戊二醛浓度对 M2固定化效果的影响 
Fig.  7  Effects  of  glutaraldehyde  concentration  on  the 
immobilization efficiency of M2. 
曹文娟和袁海生 /桦褶孔菌漆酶固定化及其对染料的降解
 
 
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面与壳聚糖交联成合适的保护膜，浓度太低保护膜
较为稀疏，浓度太高则会造成底物扩散困难。因此
选择戊二醛浓度 0.7%为最佳浓度。 
2.3 固定化酶温度稳定性 
在 60℃时，固定化酶 M1，M2 的温度稳定性
要明显高于游离漆酶的温度稳定性，在保温 30min
时，游离漆酶的酶活力仅剩余 12%，而 M1，         
M2 分别剩余 47%、82%（表 1）。海藻酸钠固定化
Coriolopsis gallica漆酶时，当在 55℃保温 90min后，
固定化酶和游离酶分别剩余 91.2%和 25.6%的酶活
力，而在此温度保温 210min 后，分别剩余 67%和 
3%的酶活力（Daâssi et al. 2014）。 
 
表 1 M1、M2及游离漆酶在 60℃的温度稳定性比较 
Table 1 Thermal stability comparison between M1, M2 and free laccase 
温度 
Temperature (°C) 
保存时间 
Conserving period (min) 
剩余酶活力  Residual laccase activity (%) 
游离漆酶 Free enzyme  M1  M2 
60 30  12  47  82 
60  8  45  66 
90  4  21  40 
120  2  20  28 
150  2  20  27 
180  2  11  25 
 
 
 
 
 
2.4 固定化酶 pH稳定性 
固定化酶相比较游离酶 pH稳定性得到较大程
度的提高：当 pH 2.5 时，两种固定化酶的 pH 稳定
性分别为 50%和 90%，而游离酶的稳定性则仅在
10%以下；当 pH  3 时，固定化酶的稳定性比游离
酶高 60%以上（图 8）。可见，固定化酶有效地提
高了漆酶在酸性条件下的稳定性。而 pH>4 以后，
游离酶的稳定性急剧下降，当 pH 介于 4–6 时，壳
聚糖海藻酸钠共固定化酶的稳定性要显著优于壳
聚糖固定化酶，这说明前者的结构更有利于保护漆
酶，实验发现，当 pH>7 时，无论是固定化酶还是
游离酶都检测不到酶活。这一结果与 Daâssi  et  al.
（2014）研究海藻酸钠固定化 Coriolopsis gallica 漆
酶时的结果一致，其研究结果表明，固定化酶在酸
性条件下的稳定性比游离酶高 30%左右，在碱性条
件（pH 7–9）下也比游离酶稳定（约高 20%）。 
2.5 固定化酶操作稳定性 
两种固定化酶在重复使用 8 次以后，酶活力仍
能保持 70%以上，具有良好的操作稳定性（图 9）。
除了本研究中的方法以外，其他的一些固定化方法
也有较好的操作稳定性，如用活性聚乙烯醇固定化
Panus conchatus  漆酶，使用 10 次能保持 60%的活
力，使用 17 次仍能保留 50%以上的酶活力（Diao et 
al. 2002）；将 Pycnoporus sanguineus 的漆酶固定在
（CuTAPc）‐Fe3O4  磁性纳米复合物上，重复使用 5
次后剩余 80%的酶活力（Xiao et al. 2006）；用戊二
醛‐活性硅胶纳米颗粒作为载体固定化酶，重复使
用 10 次酶活力保持 55%（刘宇等  2008）。 
2.6  固定化酶对染料的降解 
2.6.1  两种固定化酶对 4 种染料的降解：壳聚糖固
定化酶对茜素红、橙黄 G、结晶紫 3 种染料的降解
效果较好，重复 3 次降解率仍在 90%以上，对中性
红染料的降解效果稍差，重复第 3 次降解率仅为
33.5%（表 2）。而海藻酸钠‐壳聚糖共固定化酶对中
性红和结晶紫的降解能力要优于橙黄 G和茜素红。
以 3‐氯‐环氧丙烷或 CPC‐硅胶为载体固定 Trametes 
versicolor 漆酶（Galliker  et  al.  2010；Osma  et  al. 
2010）等也取得了较好的染料降解效果。   
   
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图 8 M1、M2及游离漆酶的 pH稳定性比较 
Fig. 8 pH stability of M1, M2 and the free laccase. 
 
 
图 9 M1、M2操作稳定性比较 
Fig. 9 The operation stability of M1 and M2. 
表 2 M1、M2对 4种染料的降解 
Table 2 Degradation of four dyes by M1 and M2 
染料 
Dye 
索引编码 
Color  index 
number 
结构类别 
Chemical class 
特征波长 
Wavelength 
(nm) 
染料脱色率 
Dye decolorization rate (%) 
M1  M2 
1 次 
The 
first 
time 
2 次 
The 
second 
time 
3 次 
The 
third 
time 
1 次 
The 
first 
time 
2 次 
The 
second 
time 
3 次 
The 
third 
time 
茜素红 
Alizarin red 
58005  蒽醌类 
Anthraquinone 
419  100  100  100  99.8  69.8  34.8 
中性红 
Neutral red 
50040  杂环类 
Heterocyclic aromatic 
526  76.2  62.3  33.5  89.6  89.2  88.7 
橙黄 G 
Orange G 
16230  偶氮类 
Azo 
474  100  95.9  90.4  91.6  85.3  37.8 
结晶紫 
Crystal violet 
42555  三苯甲烷类 
Triphenylmethane 
578  97.2  94.6  90.1  77.7  68.9  60.5 
 
2.6.2  壳聚糖固定化酶对茜素红的降解：使用壳聚
糖固定化酶重复降解茜素红 10 次，降解率都达
100%（图 10）。10 次以后降解率有所下降，重复
降解第 20 次，降解效率仍然在 60%以上，说明壳
聚糖固定化酶对茜素红有较强的降解能力和良好
的重复使用性。 
3 讨论 
本研究用两种方法对桦褶孔菌进行了固定化，
并研究了固定化酶的温度、pH 稳定性及操作稳定 
 
图 10 M1对茜素红的重复降解 
Fig. 10 Repeated degradation of Alizarin Red by M1. 
曹文娟和袁海生 /桦褶孔菌漆酶固定化及其对染料的降解
 
 
菌物学报 
351
性，并用固定化酶对 4 种染料进行了降解。 
在本研究中，海藻酸钠‐壳聚糖共固定化率明
显优于壳聚糖交联法的固定化率。这一结果与其他
已有研究结果一致。如采用壳聚糖‐戊二醛交联法
固定化酶，固定化率达 52.2%到 55%（陈辉等 2006；
左莹等 2010），而采用海藻酸钠‐壳聚糖共固定化
法固定化酶，固定化率能够达到 74.87%到 83.8%
（王瑾等 2009；李晓静等 2014）。壳聚糖‐戊二醛
交联法单独用于固定化桦褶孔菌漆酶时，由于戊二
醛既是交联剂也是酶的变性剂，使酶在固定化的过
程中不可避免的损失活力，从而其固定化率相对较
低。而海藻酸钠有着较大的孔状结构，容易在固定
化的时候漏出大分子酶（Santagapita et al. 2012），
海藻酸钠外面包裹着壳聚糖“外壳”的固定化方法
结合了包埋和交联的优势，已被用于多种蛋白质的
固定化（Kumar et al. 2009）。因此可以认为包埋与
交联相结合的方式能更有效地对酶进行固定化，采
用两种或多种方式相结合的固定化方法有望取得
更好的固定化效果。此外，固定化载体的形状是否
均一，对固定化效果有一定影响。 
相比游离漆酶，固定化后的漆酶温度和 pH 稳
定性有不同程度的提高（Daâssi et al. 2014；Reyes et 
al. 1999；Rehman et al. 2014）。桦褶孔菌漆酶固定
化后，其在酸性条件下稳定性得到了较大程度的提
高，但是在碱性条件下酶活仍为零，可见虽然固定
化改善了桦褶孔菌漆酶在酸性条件下的稳定性，但
仍不能够适应碱性条件，这与该酶的蛋白特性有
关。海藻酸钠‐壳聚糖共固定化的漆酶在 60℃的温
度稳定性比壳聚糖固定化酶的要高，这与固定化载
体的特点有关系，前者利用包埋交联结合法，酶被
包埋在海藻酸钠的孔状结构中，同时外面有壳聚糖
与戊二醛交联形成的一层保护膜，因而对温度有更
强的抵抗力。开发对环境变化更稳定、对酶具有更
好保护效果的固定化方法对桦褶孔菌漆酶实现进
一步应用有重要的意义。 
固定化酶反复使用过程中酶活力下降，可能是
在重复过程中，固定化载体上的网格结构被堵塞，
从而使得固定化酶在后续的反应中不能发挥酶活
力，造成酶活降低（Daâssi et al. 2014），或是由于
每次反应结束后冲洗酶的过程中造成部分酶的流
失而导致（Anwar et al. 2009）。在本研究中，相比
海藻酸钠‐壳聚糖共固定化酶，壳聚糖固定化酶的
操作稳定性更好，这主要是由于壳聚糖固定化酶形
成的小球比共固定化时形成的管状结构更加坚挺，
更能抵抗外力。同一种酶，其固定化手段不同，酶
的操作稳定性也不同，因此继续研究新的更稳定的
固定化方法固定桦褶孔菌漆酶显得极为必要。 
两种固定化酶对 4 种不同化学结构的人工合
成染料均有较好的降解效果，壳聚糖固定化酶对茜
素红、橙黄 G、结晶紫 3 种染料的降解效果较好，
其中对茜素红的降解效果及重复使用性极佳，但是
对中性红染料的降解效果稍差；而海藻酸钠‐壳聚
糖共固定化酶对中性红和结晶紫的降解能力要优
于其他两种染料。以 3‐氯 ‐环氧丙烷固定化
Trametes  versicolor  漆酶降解染料活性黄 2、活性
蓝 4 的能力也有较大差异，降解率分别为 80%和
55%（Galliker et al. 2010）。可见固定化酶对染料
的降解效果与染料的化学结构及固定化所选择的
方法直接相关，其降解机制有待深入研究。 
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（本文责编：王敏）