全 文 ：收稿日期:2011-03-10
作者简介:李春芳(1984-) ，女(汉族) ，河北邢台人，硕士研究生，E-mail lichunfang168@ 126． com;袁丹(1963-) ，女
(汉族) ，辽宁丹东人，教授，博士，主要从事中药新药用资源及其成分分析方法的研究，Tel． 024-23986502，E-mail
yuandan_kampo@ 163． com。
文章编号:1006-2858(2011)10-0801-06
短梗五加果提取物中总黄酮、总酚及 3 种指标
成分的含量测定
李春芳1，刘 汶2，曲佳琳1，王 虹1，张 琳1，袁 丹1
(1. 沈阳药科大学 中药学院，辽宁 沈阳 110016;2. 沈阳市食品药品检验所，辽宁 沈阳 110023)
摘要:目的 建立短梗五加果提取物中总黄酮与总酚及原儿茶酸、绿原酸、金丝桃苷 3 种指标成分
的含量测定方法。方法 采用紫外-可见分光光度法:以芦丁为对照品，AlCl3 显色，在 273 nm 处测
定短梗五加果提取物总黄酮含量;以绿原酸为对照品，Al(NO3)3 显色，在 520 nm 处测定短梗五加
果提取物总酚含量。采用 HPLC法测定 3 种指标成分含量:色谱柱为 Hypersil ODS2 柱(150 mm ×
4. 6 mm，5 μm) ，流动相为甲醇-乙腈-水-冰醋酸溶液，梯度洗脱，流速为 1. 0 mL·min －1，柱温40 ℃，
检测波长 254 nm。结果 紫外-可见分光光度法:芦丁质量浓度在 5. 00 ～ 40. 00 mg·L －1(r = 0. 999
8)内、绿原酸质量浓度在 4. 98 ～ 59. 70 mg·L －1(r = 0. 999 9)内线性关系良好，芦丁、绿原酸的平均
回收率分别为 101. 8%、100. 7%，RSD分别为 1. 1%、0. 74%。HPLC法:3 种指标成分线性范围分
别为:原儿茶酸 0. 1 ～ 2. 5 mg·L －1、绿原酸 16. 8 ～ 420 mg·L －1、金丝桃苷 3. 68 ～ 92 mg·L －1，r 均为
0. 999 9，平均回收率为 96. 8% ～ 101. 2%，RSD分别为 1. 7%、1. 2%和 0. 99%。结论 两方法简便、
准确、重复性好，可综合用于短梗五加果提取物的质量控制。
关键词:短梗五加果;提取物;总黄酮;总酚;紫外-可见分光光度法;高效液相色谱法
中图分类号:R 917 文献标志码:A
短梗五加果为五加科植物短梗五加(Acan-
thopanax sessiliflorus(Rupr． et． Maxim．)Seem．)的
成熟干燥果实，具有补益肝肾、祛风除湿的功效。
化学研究表明，其含有金丝桃苷、槲皮素等黄酮类
化合物和原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸等酚酸类化合
物［1 － 4］。现代药理学研究表明，短梗五加果中的
黄酮类成分具有抗油脂氧化和清除羟基自由基及
超氧自由基的能力，并具有一定的抑菌活性［5］。
酚酸类成分具有抗炎镇痛、抗焦虑、镇静安眠等药
理活性［6］。因此，黄酮类成分和酚酸类成分可作
为评价短梗五加果提取物品质优劣的化学指标。
文献中短梗五加果总黄酮的定量方法采用可见分
光光度法［7］，总酚含量测定则未见报道。为更好
地控制提取物的内在质量，本文作者对短梗五加
果提取物中总黄酮与总酚以及 3 个指标成分的测
定方法进行了研究。
1 仪器与材料
Shimadizu LC-2010AHT 高效液相色谱仪、
Class-VP 色谱工作站、UV-1700 紫外-可见分光光
度计(日本岛津公司) ，AG-245 电子分析天平(瑞
士Mettler-Toledo公司) ，DL-360 超声波清洗机(浙
江象山县石浦海天电子仪器厂) ，Hypersil ODS2
柱(150 mm × 4. 6 mm，5 μm，大连依利特分析仪
器有限公司)。
甲醇、乙腈(色谱纯，天津大茂化学试剂厂) ，
氢氧化钠(分析纯，天津大茂化学试剂厂) ，亚硝
酸钠(分析纯，北京红星化工厂) ，硝酸铝(分析
纯，沈阳试剂一厂) ，氯化铝(分析纯，上海美兴化
工有限公司) ，水为蒸馏水(沈阳双玉高纯水厂) ，
其他试剂(分析纯，市售)。
芦丁、绿原酸、金丝桃苷对照品(本研究室自
制，经波谱分析确证其结构，纯度质量分数大于
98%) ，原儿茶酸(纯度质量分数为 99%，批号
110809-200604，辽宁省药品检验所) ，3 批短梗五
加果商品提取物(辽宁本溪三药有限公司国药中
心)。芦丁、绿原酸、金丝桃苷和原儿茶酸的化学
结构式见图 1。
第 28 卷 第 10 期
2 0 1 1 年 1 0 月
沈 阳 药 科 大 学 学 报
Journal of Shenyang Pharmaceutical University
Vol. 28 No. 10
Oct． 2011 p. 801
DOI:10.14066/j.cnki.cn21-1349/r.2011.10.004
Fig． 1 Structures of rutin(1)，chlorogenic acid(2)，hyperoside(3)and protocatechuic acid(4)
2 方法
2. 1 对照溶液的制备
2. 1. 1 紫外-可见分光光度法
称取经五氧化二磷减压干燥 24 h 的芦丁对
照品约 1. 0 mg、绿原酸对照品约 4. 0 mg，精密称
定。分别置于 20 mL 量瓶中，分别加入体积分数
30%的甲醇、蒸馏水溶解并稀释至刻度，分别作为
测定总黄酮、总酚的对照储备液。
精密量取芦丁对照储备液 0、0. 5、1. 0、2. 0、
3. 0、4. 0 mL，分别置于 5 mL 量瓶中，加质量分数
0. 8%的 AlCl3 溶液 0. 5 mL，用体积分数 30%的甲
醇定容，摇匀，即为各质量浓度芦丁对照反应液。
精密量取绿原酸对照储备液 0、0. 25、0. 5、
1. 0、2. 0、3. 0 mL，分别置于 10 mL量瓶中，加入质
量分数 5%的 NaNO2 水溶液 0. 5 mL，摇匀，放置 6
min。再加入质量分数 10%的 Al(NO3)3 水溶液
0. 5 mL，摇匀，放置 6 min。加入质量分数 4%的
NaOH水溶液 4. 0 mL，放置 15 min。加入蒸馏水定
容，摇匀，即为各质量浓度绿原酸对照反应液。
2. 1. 2 高效液相色谱法
称取原儿茶酸对照品约 1. 2 mg，精密称定。
置于50 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀。精
密吸取该溶液 0. 2、1. 0、2. 0、3. 0、5. 0 mL 分别置
于5 mL量瓶中，用甲醇定容，摇匀。0. 45 μm微孔
滤膜滤过，续滤液即为各质量浓度的原儿茶酸对
照溶液。
称取绿原酸对照品约 10. 5 mg、金丝桃苷对照
品约 2. 3 mg，精密称定。置于同一 25 mL 量瓶中，
用甲醇溶解并定容，摇匀。精密吸取该溶液 0. 2、
1. 0、2. 0、3. 0、5. 0 mL 分别置于 5 mL 量瓶中，用甲
醇定容，摇匀。0. 45 μm 微孔滤膜滤过，续滤液即
为各质量浓度的绿原酸、金丝桃苷对照溶液。
2. 2 供试溶液的制备
称取各短梗五加果提取物约 7. 5 mg，精密称
定。置于 10 mL量瓶中，用体积分数 30%的甲醇
溶解并定容。量取 1 mL，分别置 5 mL量瓶中，加
质量分数 0. 8%的 AlCl3 溶液 0. 5 mL，用体积分数
30%的甲醇定容，即为测定总黄酮用供试反应液。
称取各短梗五加果提取物约 15 mg，精密称
定。置于 10 mL 量瓶中，用蒸馏水溶解并定容。
量取 2 mL，分别置 10 mL 量瓶中，加入质量分数
5%的 NaNO2 水溶液 0. 5 mL，摇匀，放置 6 min。
再加入质量分数 10% 的 Al(NO3)3 水溶液
0. 5 mL，摇匀，放置 6 min。加入质量分数 4%的
NaOH水溶液 4. 0 mL，放置 15 min。用蒸馏水定
容，摇匀，即为测定总酚用供试反应液。
称取各短梗五加果提取物约 0. 1 g，精密称
定。加入甲醇 10 mL，超声波处理 10 min，
3 000 r·min －1 离 心 10 min。吸 取 上 清 液，
0. 45 μm微孔滤膜滤过，续滤液即为 HPLC 法测
定用供试溶液。
2. 3 色谱条件
色谱 柱:Hypersil ODS2 柱 (150 mm ×
4. 6 mm，5 μm) ;流动相:A 为水-冰醋酸(体积比
99∶ 1) ，B 为甲醇-乙腈(体积比 50 ∶ 50) ，梯度洗
脱，洗脱程序见表 1;柱温:40 ℃;检测波长:
254 nm;进样量:20 μL。
Table 1 Mobile phase gradient system
t /min V［V(HOAc)∶ V(H2O)= 1∶ 99］/mL V［V(MeOH)∶ V(CH3CN)= 50∶ 50］/mL
0 98 2
45 50 50
3 结果
3. 1 检测波长的选择
芦丁对照溶液和短梗五加果提取物供试溶液
经氯化铝显色后，均在波长 273 nm 有最大吸收，
所以确定测定总黄酮的检测波长为 273 nm(图
2A)。
绿原酸对照溶液和短梗五加果提取物供试溶
208 沈 阳 药 科 大 学 学 报 第 28 卷
液经硝酸铝显色，绿原酸对照品在 520 nm有最大
吸收，短梗五加果提取物供试溶液吸光度值在波
长 480 ～ 520 nm内变化不明显(图 2B) ，所以确定
测定总酚的检测波长为 520 nm。
1—Extract-AlCl3;2—Rutin-AlCl3;3—Chlorogenic acid-Al(NO3)3;4—Extract-Al(NO3)3;A—Total flavonoids;B—Total
phenols
Fig． 2 UV-Vis spectra of standards and samples
3. 2 线性关系考察
取“2. 1. 1”条下芦丁和绿原酸对照反应液，
分别在 273 nm 和 520 nm 处测定吸光度，以对照
反应液质量浓度(ρ，mg·L －1)为横坐标，吸光度
(A)为纵坐标，进行线性回归，其回归方程如下:
芦丁为 A = 3. 59 × 10 －2 ρ + 8. 4 × 10 －3，r =
0. 999 8;绿原酸为 A = 1. 88 × 10 －2 ρ + 1. 06 ×
10 －2，r = 0. 999 9。结果表明芦丁质量浓度在
5. 00 ～ 40. 00 mg·L －1 内、绿原酸质量浓度在
4. 98 ～59. 70 mg·L －1内与吸光度呈良好的线性关
系。
精密吸取“2. 1. 2”条下 3 种指标成分对照溶
液 20 μL，按“2. 3”条色谱条件进样分析，以质量
浓度(ρ，mg·L －1)为横坐标，峰面积(A)为纵坐
标，绘制标准曲线。回归方程见表 2。
Table 2 Linearity of calibration curve of 3 marker compounds
Maker compound Calibration curve r ρ(linear range)/(mg·L －1)
Protocatechuic acid A = 3. 838 × 104ρ － 6. 300 × 103 0. 999 9 1. 0-25
Chlorogenic acid A = 1. 527 × 104ρ － 7. 159 × 104 0. 999 9 16. 8-420
Hyperoside A = 3. 375 × 104ρ + 3. 324 × 104 0. 999 9 3. 68-92
3. 3 系统适用性试验
在“2. 3”条色谱条件下分析，按 3 种对照品
计，理论塔板数均不低于 5 000，与相邻色谱峰之
间的分离度均大于 1. 5，拖尾因子均在 0. 95 ～
1. 05 之间，色谱图见图 3。
1—Protocatechuic acid;2—Chlorogenic acid;3—Hyperoside
Fig． 3 Chromatograms of standards(A)and sample(B)
3. 4 精密度试验
取芦丁和绿原酸对照反应液，分别在 273 nm
处和 520 nm 处测定吸光度，重复测定 6 次，求得
RSD值分别为 0. 16%和 0. 15%，表明仪器精密度
良好。
精密吸取原儿茶酸、绿原酸和金丝桃苷各对
照溶液 20 μL，按“2. 3”条色谱条件重复进样
6 次，计算原儿茶酸、绿原酸和金丝桃苷峰面积的
RSD分别为 1. 9%、1. 1%和 2. 6%，表明仪器精密
度良好。
308第 10 期 李春芳等:短梗五加果提取物中总黄酮、总酚及 3 种指标成分的含量测定
3. 5 重复性试验
称取短梗五加果提取物(No. 1)粉末约
7. 5 mg，精密称定，按“2. 2”条方法制备测总黄酮
用供试反应液，平行制备 6 份，分别在 273 nm 处
测定吸光度，求得 RSD值为 0. 16%。称取短梗五
加果提取物(No. 1)粉末约 15 mg，精密称定，按
“2. 2”条方法制备测总酚用供试反应液，平行制
备 6 份，分别在 520 nm 处测定吸光度，求得 RSD
值为 0. 16%。结果表明方法重复性良好。
称取短梗五加果提取物(No． 1)粉末约
0. 1 g，精密称定，按“2. 2”条方法制备供试溶液，
平行制备 6 份，按“2. 3”条色谱条件进样分析，计
算原儿茶酸、绿原酸和金丝桃苷含量的 RSD 值分
别为 2. 6%、2. 3%和 2. 6%，表明方法重复性良好。
3. 6 稳定性试验
取芦丁对照品和供试品(No. 1)AlCl3 反应
液，分别测定 0、10、20、30、40、50 min 时溶液在
273 nm处吸光度，RSD 分别为 0. 28%和 0. 29%。
取绿原酸对照品和供试品(No． 1)Al(NO3)3 反应
液，分别测定 0、5、10、15、20、25 min 时溶液在
520 nm处吸光度，RSD分别为 0. 96% 和 3. 0%。
取供试溶液(No． 1) ，室温下分别于 0、2、4、6、
8 h 按“2. 3”条色谱条件进样分析，计算原儿茶
酸、绿原酸和金丝桃苷峰面积的 RSD 分别为
2. 7%、2. 4%、2. 3%，表明供试溶液在室温下 8 h
内稳定。
3. 7 加样回收率试验
称取已知含量的短梗五加果提取物(No． 1)
粉末约 3. 8 mg，精密称定，共 5 份，分别加入芦丁
对照储备液 5 mL，按“2. 2”条方法制备测总黄酮
加样回收率供试溶液，依法测定。
称取已知含量的短梗五加果提取物(No． 1)
粉末约 7. 5 mg，精密称定，共 5 份，分别加入绿原
酸对照储备液 1. 6 mL，按“2. 2”条方法制备测总
酚加样回收率供试溶液，依法测定。
称取已知含量的短梗五加果提取物(No. 1)
粉末约 50 mg，精密称定，共 5 份，分别精密加入
适量原儿茶酸、绿原酸和金丝桃苷对照溶液，按
“2. 2”条方法制备供试溶液，按“2. 3”条色谱条件
进样分析，计算回收率，结果见表 3。
Table 3 The results of recovery of flavonoids，phenols and 3 maker compounds(n =5)
Method Compound moriginal /mg madded /mg mdetected /mg Recovery /% Average recovery /% RSD /%
Flavonoids 0. 271 0. 250 0. 525 100. 8
0. 271 0. 250 0. 527 101. 3
0. 271 0. 250 0. 529 101. 6 101. 8 1. 1
0. 271 0. 250 0. 530 101. 8
UV-Vis 0. 271 0. 250 0. 540 103. 7
Phenols 0. 373 0. 318 0. 690 99. 8
0. 373 0. 318 0. 693 100. 2
0. 373 0. 318 0. 695 100. 6 100. 7 0. 74
0. 373 0. 318 0. 698 101. 0
0. 373 0. 318 0. 703 101. 8
Protocatechuic acid 0. 047 5 0. 050 0 0. 048 4 96. 8
0. 047 5 0. 050 0 0. 049 9 99. 9
0. 047 5 0. 050 0 0. 048 5 97. 0 98. 6 1. 7
0. 047 5 0. 050 0 0. 050 2 100. 5
0. 047 5 0. 050 0 0. 049 4 98. 8
Chlorogenic acid 0. 161 1 0. 168 0 0. 165 8 98. 7
HPLC 0. 161 1 0. 168 0 0. 161 0 95. 8
0. 161 1 0. 168 0 0. 161 8 96. 3 96. 8 1. 2
0. 161 1 0. 168 0 0. 163 0 97. 0
0. 161 1 0. 168 0 0. 161 5 96. 1
Hyperoside 0. 048 7 0. 050 6 0. 051 8 102. 3
0. 048 7 0. 050 6 0. 051 1 101. 1
0. 048 7 0. 050 6 0. 050 6 99. 9 101. 2 0. 99
0. 048 7 0. 050 6 0. 051 0 100. 8
0. 048 7 0. 050 6 0. 051 7 102. 1
408 沈 阳 药 科 大 学 学 报 第 28 卷
3. 8 样品含量测定
取各短梗五加果提取物样品，按“2. 2”条方
法制备 UV-Vis用供试溶液，用紫外 －可见分光光
度法测定提取物中总黄酮和总酚含量。
取各短梗五加果提取物样品，按“2. 2”条方
法制备 HPLC 用供试溶液，按“2. 3”条色谱条件
测定 3 种指标成分的含量，结果见表 4。
Table 4 Contents of flavonoids，phenols and 3 maker compounds in the extracts of A． sessiliflorus fruit
Extract No． w(flavonoid)/% w(phenol)/% w(protocatechuic acid)/% w(chlorogenic acid)/% w(hyperoside)/%
1 8. 10 5. 93 0. 096 0. 322 0. 097
2 8. 49 6. 32 0. 106 0. 245 0. 069
3 8. 62 6. 77 0. 064 0. 453 0. 136
4 讨论与结论
a. 国内文献报道总黄酮的测定常采用芦丁
为对照品，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 为显色剂，在
510 nm处测定吸光度，该吸收波长为桂皮酰基产
生的吸收带 I(300 ～ 400 nm)红移而引起;另有文
献报道［8］，以 AlCl3 为显色剂，在 273 nm 处测定
吸光度，该吸收波长为苯甲酰基产生的吸收带Ⅱ
(220 ～ 280 nm)红移引起;郭亚建等［9］曾对亚硝
酸钠比色法的专属性进行了讨论，发现具有邻二
酚羟基的非黄酮类物质在芦丁显色的最大波长处
(510 nm左右)也有较强吸收，从而说明此方法不
能排除非黄酮类物质的干扰，专属性不强。因此，
作者采用三氯化铝比色法(273 nm)测定总黄酮
含量。
b. 实验最初选择测总酚溶剂是体积分数
30%甲醇，但测定时，发现用体积分数 30%甲醇
作溶剂，有絮状沉淀产生，影响吸光度，用水无此
现象，最后改用水作溶剂。样品经 Al(NO3)3 显
色后，放置时间延长，吸光度会降低，所以显色后
应尽快测定，同时，为了保证测定结果的准确性，
显色剂应现用现配。
c. 由二极管阵列检测器得知原儿茶酸的最
大吸收波长为 256 nm 和 290 nm，绿原酸的最大
吸收波长为 243 nm 和 325 nm，金丝桃苷的最大
吸收为 254 nm和 356 nm。兼顾 3 种成分的检测
灵敏度和干扰情况，选择在 254 nm 进行检测，均
能满足定量的要求。
d. 作者采用 UV-Vis 法测定提取物总黄酮和
总酚含量，同时还采用 HPLC法测定原儿茶酸、绿
原酸和金丝桃苷 3 种指标成分的含量。结果表
明，3 批短梗五加果提取物中总黄酮和总酚含量
差异不明显，但样品中原儿茶酸、绿原酸、金丝桃
苷 3 种指标成分的含量差别较大，可能与提取溶
剂、提取工艺等原因有关。说明短梗五加果提取
物质量仅用总黄酮、总酚的含量来评价是不全面
的，亦应对主要指标成分的含量进行控制和评价。
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508第 10 期 李春芳等:短梗五加果提取物中总黄酮、总酚及 3 种指标成分的含量测定
Determination of total flavonoids，total phenols and
three maker compounds in the extract of Acantho-
panax sessiliflorus fruits
LI Chun-fang1，LIU Wen2，QU Jia-lin1，WANG Hong1，ZHANG Lin1，YUAN Dan1
(1． School of Traditional Chinese Materia Medica，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，
China;2． Shenyang Food and Drug Inspection Institute，Shenyang 110023，China)
Abstract:Objective To establish methods for the determination of total flavonoids and total phenols and an
HPLC method for simultaneous determination of protocatechuic acid，chlorogenic acid and hyperoside in the
extract of fruits of Acanthopanax sessiliflorus．Methods UV-Vis spectrophotometry methods were used to de-
termine the contents of the total flavonoids and total phenols． The absorbance was measured at the wave-
length of 273 nm and 520 nm using rutin and chlorogenic acid as standards，AlCl3 and Al(NO3)3 as chromo-
genic agents，respectively． The HPLC analysis was carried out on a Hypersil ODS2(150 mm × 4. 6 mm，
5 μm)column，with a linearity gradient of methanol-acetonitrile-water-acetic acid at the flow rate of
1. 0 mL·min －1 ． The detective wavelength was set at 254 nm，and the column temperature was set at 40 ℃ ．
Results UV-Vis spetrophotometry was used，the linear range was 5. 00-40. 00 mg·L －1(r = 0. 999 8)for ru-
tin，the average recovery was 101. 8% with RSD of 1. 1% ． The linear range was 4. 98-59. 70 mg·L －1(r =
0. 999 9)for chlorogenic acid，the average recovery was 100. 7% with RSD of 0. 74% ． The HPLC method
was used，and the linear ranges of protocatechuic acid，chlorogenic acid and hyperoside were 0. 1-
2. 5 mg·L －1，16. 8-420 mg·L －1，3. 68-92 mg·L －1，respectively，with r of 0. 999 9． The recoveries ranged
from 96. 8% to 101. 2% with RSD of 1. 7%，1. 2% and 0. 99% ． Conclusions The methods are simple，ac-
curate and reproducible． They can be used for quality control of the extract of A． sessiliflorus fruits．
Key words:Acanthopanax sessiliflorus fruit;extract;total flavonoid;total phenol;UV-Vis spetrophotometry;
HPLC
608 沈 阳 药 科 大 学 学 报 第 28 卷