全 文 ：第 1 9卷第 1 期
2 5 0 0年 l月
株 洲 工 学 院 学 报
J o un ra l o f Zh z uh o uI s n t it ut e o f Te e h n o l og y
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南方山荷叶内生真菌与根际真菌的多样性及相关性探讨
曾松荣 , , 柯 野 , , 方白玉 ` , 张玲琪 2
(1
. 韶关学院 生物 工程 系 , 广东 韶关 51 2 0 0 5 ; 2 . 云南大学 生物系 , 云南 昆明 65 0 0 9 1)
摘 要 : 对云南产 南方 山荷叶植物的内生真菌与根际真菌进行分离 、 鉴定 ,得到 25 株 内生真菌
和 19 株根际真菌 , 其 中内生真菌分属于 5 个科 、 8 个属 ,根 际真菌分属于 5 个科 、 6 个属 。 时这两组
真菌作比较分析 , 显示 出这 两组真菌存在丰富的 多样性和一定的相关性 , 并对植物 内生真菌的起 源
作 了初步探讨 。
关键词 : 南方 山荷叶 ; 内生真菌 ; 根 际真菌 ; 多样性 ; 相关性
中图分类号 : Q 9 4 9 . 7 4 6 . 8 文献标识码 : A 文章编号 : 1 0 0 8一 2 6 1 1 ( 2 0 0 5 ) 0 1一 0 0 2 5一 0 3
S t r o b e l G
. 等 [ ,〕 1 9 9 3 年 报 道 了从 短 叶 红 豆 杉
( aT
x “ , b) ,e v 句肠l z’a )的树皮 中分离到一株 能产 生抗癌
化合物 紫杉醇 (t a x ol ) 的内生 真菌— 安德 氏紫杉霉
( aT
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: a n d er a n a ` )
, 为生物活性物质的研究开发
开辟了新途经 。 内生真菌 ( e n d o p h y t ie f u n g i )是指那些
在其生活史中的某段时期生活在植物组织内 ,对植物
组织没有明显引起病害症状的真菌阁 。 近年来 , 人们发
现在植物 (尤其是高等植物 )体内的内生真菌物种资源
的潜力非常大 。 但开展植物内生真菌等微生物的多样
性研究 ,无论是从基本理论或方法 ,还是从研究的广度
和深度均不如动 、 植物生物多样性那样系统和广泛 , 因
此 , 进行植物内生真菌等微生物多样性的研究显得更
加迫切 。其重要性不仅在于可能会发现新的分类单位 ,
而且有可 能找到一些 内生真菌 , 能产生对人类有益的
生理活性物质 (如 :抗肿瘤 、抗病毒 、 抗细菌 、 抗真菌 、抗
虫等物质 ) 。 目前 , 分离植物内生真菌及其天然产物的
研究正成为微生物学领域的一个热点 。
南方山荷叶 ( D IP勺 l l e i a s i n e n s i s )为小聚科 ( B e r -
be ir d ac ea ` ) 鬼 臼 亚 科 ( 尸od oP 勺U io de a ` ) 山 荷 叶 属
( D IP 勺 le ia )的一种具根状茎的多年生草本植物 , 也称
窝儿七 、 山荷叶等 , 是一种传统 的草药 , 其根状茎等部
位所含的鬼 臼毒素是治疗尖锐湿疵的 良好药物 , 亦是
合成多种治疗癌症药物的前体 , 因而有较大 的经济价
值 s3[ 。 对其内生真菌能够产生和其宿主相类似的活性
成分 已做过研究报道闭 , 本文就南方 山荷叶植物内生
真菌及根际土壤真菌的多样性作初步研究 , 并对这两
组真菌 的相关性作初步探讨 , 为今后进一步研究植物
一真菌生态关系 ,及植物 内生真菌的起源提供依据 。
1 材料和方法
1
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1 材料
新鲜南方山荷叶植株及其根际土壤样品 采 自云南
省中甸县 。
1
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2 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (简称 P D A ) , 马丁氏培
养基 , 查氏培养基 ,促抱培养基 。
1
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3 真菌的分离方法
1
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3
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1 内生真菌的分离
新鲜南方山荷叶样品用 自来水冲洗干净 ,将根状茎
剪成 2~ 3 o m 的小段 , 以下过程在超净工作台上按常规
无菌操作 。 样品的表面消毒按下列程序进行 : 75 %的酒
精 漂洗 ( 3~ 5 5 )一 0 . 1%的升汞漂洗 ( 4 ~ 5 m i n ) ~ 无
菌水冲洗 (4 ~ 5 次 ) 。 将上述处理过的根状茎剥开取其
韧皮部 , 并把外围剪去 , 再剪成 0 . 5 x 0 . 5 c m Z 小片 , 种
植于 P D A 平板上 ,置 28 ℃温箱中培养 3~ 7 d , 可见样
品边缘有真菌菌丝和细菌菌苔长出 。 本实验以丝状真菌
为分离 目标 , 丝状真菌经纯化后转接到 P D A 斜面上备
用 。 为检查材料表面的消毒效果 ,进行如下对照实验 : 将
上述表面消毒过的一部分材料不做剪切 , 直接种植 于
P D A 平板上作对照培养处理 ,结果对照材料周围均无
任何菌长出 , 证明表面消毒彻底 , 保证分离到的真菌是
植株上的内生真菌 , 而不是表面的附生菌 。
1
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3
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2 根际真菌的分 离
1) 土样的采集 采集山荷叶植株时 , 同时采集该
收稿 日期 : 2 0 0 4一 1 0 一 1 0
基金项 目 : 国家 自然科学 基金资助项 目 (3 9 860 0 0 5)
作者简介 : 曾松荣 ( 1 9 64 一 ) , 男 ,湖南邵阳人 , 韶关学院讲师 , 理学硕士 , 主要从事基础微生物学和应用微生物学 的教学与研究 .
株 洲 工 学 院 学 报 0 0 2 5年
植物的根际土壤 。具体方法是 :在样地以 “ 梅花点 ” 的形
式随机采挖 山荷叶植株 5株 ,每个采样点相距约 15 一
20 m
, 把山荷 叶植株从土 中挖 出根后 , 抖掉松土而附
着在根上的残留土壤则被视为该植株的根际土壤 。 每
个根际取土 5 点 ,装人无菌纸袋内混合备用 .s[ `〕 。
2) 样品分离 采用稀释涂布平板法 〔7 , 。
1
.
3
.
3 菌种鉴定
将上述分离出的内生真菌和根际真菌纯菌株按常
规方法鉴定 s[ 一 `。〕 。
2 结果与讨论
分离到 25 株内生真菌和 19 株根际真菌 。 对其作
初步鉴定 ,并对这两组真菌进行分类汇总 , 结果见表 1
和表 2 。
表 1 从山荷叶植株上分离到的 25 株内生真菌的分类总汇
亚 门 目 科 属 菌株数
半知菌亚门 丛梗抱 目 丛梗抱科 青霉属 10
半知菌亚门 无抱 目 无抱科 无抱菌群 8
子囊菌亚门 毛壳菌 目 毛壳菌科 毛壳菌属 2
半知菌亚 门 丛梗抱 目 丛梗 抱科 拟青霉属 1
半知菌亚 门 丛梗抱 目 暗色抱科 短梗霉属 1
半知菌亚 门 丛梗抱 目 丛梗抱科 丛梗抱属 1
半知菌亚 门 丛梗抱 目 瘤座抱科 镰刀 菌属 1
半知菌亚 门 丛梗抱 目 丛梗抱科 麦穗抱属 1
表 2 从山荷叶植株根际中分离到的 19 株根际真菌的分类总汇
亚 门 目 科 属 菌株数
半知菌亚门 丛梗抱 目 丛梗抱科 木霉属 7
半知菌亚 门 丛梗抱 目 丛梗抱科 青霉 属 4
半知菌亚 门 丛梗抱 目 瘤座 抱科 镰刀菌属 3
半知菌亚 门 丛梗抱 目 暗色抱科 短梗霉 属 2
接合菌亚 门 毛霉 目 毛露科 毛霉属 2
半知菌亚 门 无抱 目 无抱科 无抱菌群 1
从以上 2 个 表可 以看出 , 25 株 内生真菌分属于 2
个亚门 , 3 个 目 , 5 个科 , 8 个属 , 按菌株 由多到少的顺
序 分 别 为 青 霉 属 ( P e n i c i l l i u m ) 10 株 , 无 抱 菌 群
(M y e e l i a s t e r i l i a ) 8 株 , 毛壳菌属 ( hC a e t o m i u 切 ) 2 株 ,
拟青霉属 ( P a e e i l o , yn c e s ) l 株 ,短梗霉属 ( A u er o b a s i d -
i u , n ) 1 株 , 丛 梗 抱 属 。 了d n i l i a ) 1 株 , 镰 刀 菌 属
( F u s a r i u 。 ) 1 株 , 麦穗抱属 ( T r i t i ,二 e h i u , n ) 1 株 ; 1 9 株
根际真菌分属 于 2 个亚门 , 3 个 目 , 5 个科 , 6 个属 , 按
菌株 由多到少的顺序分别为木霉 属 ( T ir hc dn er , 7: a )7
株 ,青霉属 4 株 ,镰刀菌属 3 株 , 短梗霉属 2 株 , 毛霉属
(材“ co r) 2 株 , 无抱菌群 1 株 。 结果显示南方山荷叶植
物 内生真菌及根际真菌的种类相当丰富 , 表明该植物
的内生真菌及根际真菌存在丰富的多样性 。 同时还可
看 出 , 山荷叶植物根际真菌与该植物的内生真菌有一
些共同的类群 , 即根状茎 的内生真菌与根际真菌共有
青霉 、 无抱菌群 、 短梗霉等类群 。 这表明山荷叶内生真
菌的类群与在植物体外的根际真菌类群之间存在密切
的联系 ,这两组真菌表现出一定的相关性 。
从分离出的内生真菌看 , 有些菌的分离频率高 , 为
优势菌 , 而有些菌则相反 , 为稀有种 。 这种特异性是在
共 同进化 中形成的 ,是植物的遗传 、 生理 、 代谢产物与
微生物的营养要求和生理代谢等相互适应的结果 。 植
物在长期演化过程 中同这些微生物互相渗透 、 同步进
化 。 植物与其体内的微生物在长期进化过程中不可避
免地要组成一种相互依存 、 相互制约的关系 , 即构成一
个 自然微生态系统 。 这个微生态系统的微生物基本上
可分为两大类 , 即习居菌和暂居菌 。前者是固定的长期
生活在植物体的一些种群 , 后者是偶尔闯入或者人为
引人的类群 。 就同一株植物而言 , 其在土 中萌动的种
子 、 幼苗 、 成株各个时期体内微生物的种群组成是不断
演变的 。 微生物的这种有规律演替取决于植物种类及
其遗传特性 , 环境条件和人为因素也容易影响演替类
型 ,如气候反常 、 季节变化等 , 也会 引起可逆或不可逆
的植物体 内正常微生物群的演替 l1[ 〕 。 它们在不同的植
物微生态系统中 ,通过不同微生物种群间的相互作用 ,
建立了一种动态的生态平衡 。 此外 ,在植物体 内 ,植物
微种群正常情况下只 占植物体内总菌数的一定比例而
不会无限制地繁殖 ,这可能与其它菌的优势繁殖有关 。
在分离出的内生真菌中 ,镰刀 菌属等真菌为植物
病原菌 , 但从采到的植株外表上看 , 这些微生物并未引
起植物发病 。 从植物微生态学理论分析 , 原因可能是 ,
它们在正常植物体上 , 病原物的种类和数量被压低在
一定水平 ,不致引起发病 ,但它们潜伏在健康植物组织
内 ,一旦植物体 内的生理代谢环境及其它内外环境 因
素改变 ,病原物种类和 数量增加到一定程度时即成为
致病微生物导致发病 。另外 ,对一种植物是正常的微生
物种群 , 对另一种植物可能是致病的 ;致植物根病的微
生物种群 ,在植物叶部则有可能是正常微生物群 ,这种
现象是受遗传和进化的生态规律支配的 1[ `〕 。
根据上述两组真菌存在一定的相关性 , 我们可假
设 , 根际真菌与植物根面的直接接触 ,可能通过某种方
式进人植物根部并由此进人植物体其它组织内而成为
其内生真菌 。 植物内生真菌的来源及进人宿主途径是
多样的 , 主要有 以下几种可能方式 : 一是无伤 表皮侵
人 。抱子萌发后的芽管顶端附着在寄主体表 ,然后产生
直径 比芽管细的侵染丝 , 穿过角质层和表皮细胞外壁
而侵人宿主 , 这种方式在植物体气生部位和根际部位
均有可能发生 ; 二是 自然孔 口侵人 。 在植物体表 ,存在
着各种 自然孔 口 ,如叶子上的气孔 , 树干枝条上的皮孔
第 1期 曾松荣 , 柯 野 ,方白玉 ,等 南方山荷叶内生 真菌与根际真菌的多样性 及相关性探讨
等 。 三是伤 口侵人 。 伤 口侵人是内生真菌侵人宿主的
最常见途径 。植物受伤的机会很多 ,许多环境因素能造
成植物的伤 口 , 如冻害 、高温害 、风害 、雪压 、 及昆虫 、 动
物的食害等 :6[ 。 在植物生长发育过程 中微生物种群不
断地进人宿主植物 ,使微群落不断地演替 , 当宿主植物
的一个生长发育阶段结束时 , 部分 内生真菌形成各种
各样 的休眠体进人土壤 ;部分 内生真菌和植物残体一
起进 人土壤 ; 还有部分 内生真菌转换到其它宿主植物
上 。 这种转换主要有内生真菌借助气流 、 水等非介体传
播和借助昆虫等其它介体传播 。 这些微生物转换宿主
时 , 在非特异性宿主植物体 内要适应环境 ,耐受植物的
免疫屏障和生物拮抗作用 ,与周 围环境建立稳定的关
系才能存在和发展 ,否则将被排除于环境之外 l[ 〕 。
迄今为止 ,所见报道发现许多植物的内生真菌能
够产生与宿主相 同或相似的生物活性成分 , 也可产生
与宿主不同的生物活性成分 lz[ 〕。 可见这 已不是个别现
象 。 鉴于植物的内生真菌与土壤根际真菌之间有可能 `
相互转换 , 因此我们也可能会在根际土壤 中找到像植
物内生真菌一样 的对人类有益的生物活性物质 ,今后
对于有用的次生代谢产物的筛选范围应更广泛 。
就同种植物而言 , 不同地域 、 不 同年限和季节 、 不
同器官组织 ,所取样本的多少 、 样地周 围环境因子的差
异及采用不同的分离方法 , 其内生真菌的种类和数量
会有很大变化 。植物不同 ,其 内生真菌的种类和数量也
不会相同 。在 自然条件下 ,不少微生物至今难以人工培
养和检测 , 目前对植物内生真菌和根 际土壤真菌的数
量估计依赖于培养基 , 用哪些培养基才能反映这些真
菌的真实种群及数量 , 尚需探讨 。 对内生真菌及根际真
菌种群分析的研究有待进一步深人 , 在分析方法上有
待改进 。
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