全 文 ：茅苍术多糖的含量分析
段国峰1 ,欧阳臻2 ,余伯阳3 ,邬瑞斌1 ,陈明琪1
(1中国药科大学高等职业学院 ,江苏 镇江 212003;2江苏大学药学院 ,江苏 镇江 212013;3 中国药科大学中药学院 , 江
苏 南京 210038)
摘要:目的 对茅苍术多糖中单糖组成 , 各单糖 、中性糖 、糖醛酸 、蛋白质的含量进行分析。方法 茅苍术粗多糖分离纯
化后 ,通过气相色谱 、分光光度法等进行分析。结果 粗多糖 APW主要含 APW1 ～ APW4 4 个组分 , 各组分均含半乳糖 、
阿拉伯糖和甘露糖等单糖 , APW1 ～ APW4 的中性糖含量分别是:60.1%、22.6%、20.1%、16.9%, 糖醛酸含量分别是
7.7%、9.8%、25.5%、27.6%,蛋白质含量分别是 1.9%、1.3%、1.5%、1.7%。结论 茅苍术多糖是一种蛋白杂多糖。
关键词:茅苍术;多糖;中性糖;糖醛酸;蛋白质
中图号:R282.710.3 文献标识码:A 文章编号:1000-5005(2008)04-0251-03
茅苍术为菊科植物茅苍术 Atractylodes lancea
(Thunb.)DC.的根茎 。性温 ,味辛 、苦 ,具有燥湿
健脾 、祛风散寒 、明目的功效 ,主要用于脘腹胀满 ,
泄泻 ,水肿 ,脚气痿痹 ,风湿痹痛 ,风寒感冒 ,夜盲
等症 。主产于江苏 、湖北 、河南等地 。多糖类在自
然界生物中广泛存在 ,具有广谱化学结构和生物
功能 ,越来越受到人们的关注 ,其免疫 、降糖等活
性与其所含单糖 、糖醛酸 、蛋白等成分结构有密切
的关系。
KW Yu等[ 1-3]对湖北产茅苍术的多糖作了
研究 ,结果表明其具有肠免疫活性 、抗假丝酵母菌
感染等作用 ,且活性与多糖中阿拉伯半乳糖及糖
醛酸性部位相关 。
茅苍术原本是茅山苍术的简称 ,其质量和疗
效优异为历代医家推崇和肯定 ,江苏茅山地区被
认为是茅苍术的地道产地 。有关茅山苍术的多糖
报道文献鲜见。本文对江苏茅山地区茅苍术多糖
的进行了分离纯化 ,对主要纯化多糖 APW1 ～ 4 ,
通过气相色谱等分析确定茅苍术多糖中各种单糖
组成及比例 ,通过斜率校正系数法测定单糖的含
量 、糖醛酸含量及蛋白质含量 ,为进一步研究其化
学结构和生物活性提供了基础 。
1 材料
1.1 药品与试剂
茅苍术采集于江苏句容茅山地区 ,经江苏大
学药学院欧阳臻教授鉴定。纯化多糖的制备:药
材无水乙醇脱脂后 ,残渣水提醇沉 ,离心收集沉
淀 ,三氯乙酸法[ 4]脱蛋白 ,透析 ,冷冻干燥 ,即得粗
多糖APW 。APW经过Molish反应 、UV及 IR等验
证后 ,分别经 DEAE 纤维素由 0 ～ 0.2 mol/L浓度
NaCl洗脱 、Sephadex G-100色谱柱 0.1 mol/L NaCl
溶液洗脱 ,苯酚-硫酸法检测糖峰 ,紫外吸收法
(280 nm)检测蛋白峰 。依次得主要纯化多糖
APW1 ～ 4 ,各纯化多糖经 HPGPC 检测为单一对称
峰 ,APW 、APW1 ～ 4 得率分别为 3.85%、1.43%、
0.04%、0.20%、0.06%。鼠李糖 Rha 、阿拉伯糖
Ara 、木糖 Xyl 、甘露糖 Man 、葡萄糖 Glu 、半乳糖
Gal 、间羟基联苯 、糖醛酸标准品 , sigma公司;考马
斯亮兰试剂盒 ,南京建成生物工程研究所;其他试
剂均为国产分析纯。
1.2 仪器
GC-14B气相色谱仪 ,日本岛津公司;N2000
色谱处理工作站 ,浙江大学智能研究所;紫外可见
分光光度计 ,上海优尼科公司;电子天平 ,北京多
收稿日期:2008-03-07;修稿日期:2008-03-30
基金项目:江苏省自然科学基金(BK2004062)
作者简介:段国峰(1968-),男 ,江苏泰兴人 ,中国药科大学高等职业学院讲师。
—251—南京中医药大学学报 2008 年 7月第 24 卷第 4期JOURNALOF NANJINGTCMUNIVERSITY Vol.24 No.4 July.2008
DOI :10.14148/j.issn.1672-0482.2008.04.016
利斯天平有限公司;R-200 型旋转蒸发仪 , 瑞士
Buchi公司;Alpha1-2LD冷冻干燥机 ,德国Christ公
司;420恒温水箱 ,江苏国胜实验仪器厂等。
2 方法
2.1 单糖含量测定
2.1.1 多糖中单糖组分的气相色谱分析
各多糖完全酸水解[ 5]之后 ,水解液离心 ,上清
液冷冻干燥 ,得水解糖样 ,干燥 ,各水解糖样及标
准单糖采用糖腈乙酰法[ 6]制备成气相衍生物 ,内
标肌醇 Inositol ,注入气相色谱仪 ,分析各多糖中单
糖的种类及比例 。
色谱条件:DB-5 30000 mm×0.53 mm 弹性石
英毛细管色谱柱;载气:高纯氮气;检测器:氢火焰
离子化检测器(FID);程序升温:100℃(5℃/min)
※190℃, 190℃(4℃/min)※240℃(10 min);汽化
温度 280℃;检测器 260℃。
2.1.2 各单糖标准曲线的制备及样品的测定
结合气相分析的结果 ,采用改良的硫酸-苯
酚法[ 7]测定所含单糖的标准曲线。
将葡萄糖标准液定容成 0.0 ,30.0 ,60.0 , 90.
0 , 120.0 , 150.0 , 180.0 μg/mL , 分别取各标准液
0.6 mL ,加入 50 g/L 重蒸苯酚测试液 1.2 mL ,振
荡混匀后 ,快速加入浓硫酸 6.0 mL ,混悬振荡 ,放
置30 min后 ,于分光光度计 490 nm处测定吸光度
A。根据所测数据 ,以标准单糖浓度 C(μg/mL)为
自变量 ,吸光度 A 为因变量作线性回归 ,求得工
作曲线回归方程 。同法制得阿拉伯糖 、鼠李糖 、甘
露糖 、半乳糖 、木糖的标准曲线 。
精密配制为 200 μg/mL 样品液 ,测定吸光度
A ,按校正系数法结合标准方程计算浓度。
2.2 糖醛酸含量的测定
间羟基联苯法[ 8] 制备标准曲线:将葡萄糖醛
酸标准溶液分别配制为 0 、10 、20 、30 、40 、50 、60μg/
mL ,各取 0.5 mL 置 7只试管中 ,冰浴下分别加入
4.5 mL四硼酸钠-硫酸溶液试剂 ,振荡混匀 ,沸
水浴加热 10 min。冷却后加入 0.05 mL 0.15%间
羟基联苯试剂 ,振荡混匀 ,静置 20 min 显色 ,在波
长525 nm测定吸光度 。根据所测数据 ,以标准糖
醛酸浓度 C(μg/mL)为自变量 ,吸光度 A 为因变
量作线性回归 ,求得工作曲线回归方程 。精密配
制为 200μg/mL样品液 ,测定吸光度 A ,按标准工
作方程计算浓度 。
2.3 蛋白质含量的测定
Bradford法[ 9]将考马斯亮兰储备液按 1∶4(V/
V)用蒸馏水进行 5 倍稀释 ,冷藏备用 ,样品液精
密配制为 10 mg/mL。空白管 、标准管 、测定管分
别为蒸馏水 、0.615 g/L 蛋白标准液 、样品液各
0.05 mL ,依次加入考马斯亮兰显色剂 3.0 mL ,混
匀 ,静置 10 min ,于 595 nm处 ,测定各管的吸收度
A ,计算蛋白含量。
3 结果
3.1 单糖的含量测定
3.1.1 气相色谱分析结果
通过与标准单糖的保留时间和响应因子对比
确定样品多糖的种类和摩尔比 。结果表明:茅苍
术多糖中单糖主要为中性己糖 ,标准单糖乙酰化
物GC 图见插页 Ⅳ图 1。APW1 由 Rha 、Ara、Xyl、
Man 、Glu 、Gal组成 ,摩尔比为 0.16∶0.17∶0.24∶0.
55∶0.89∶1.00;APW2由 Ara 、Man 、Gal组成 ,摩尔
比为 0.82∶1.00∶0.32;APW3 、APW4 均由 Rha、
Ara 、Man 、Gal组成 ,摩尔比分别为 0.24∶1.00∶0.48
∶0.53及 0.22∶0.34∶1.00∶0.58。通过计算 ,样品
的摩尔百分数见插页Ⅳ图 2。
3.1.2 单糖的测定及数据处理
(1)各单糖的标准曲线在 0 ～ 180 μg/mL范围
内 ,吸光度和糖含量成良好的线性关系 。各单糖
线性方程如下:
葡萄糖 Y =0.005 4X -0.002 3 , r=0.999 4;
甘露糖 Y =0.006 8X +0.035 1 , r=0.997 8;半乳
糖 Y =0.004 1X +0.0263 , r =0.998 1;木糖 Y =
0.005 1X +0.011 9 , r =0.999 3;阿拉伯糖 Y =
0.004 9X +0.0277 , r =0.997 6;鼠李糖 Y =
0.004 4X +0.012 9 , r=0.997 1。
(2)通过各标准方程计算得出各标准单糖的
矫正系数 K见表 1 ,样品的吸收度A见表 2。
表 1 标准单糖的矫正系数
葡萄糖 鼠李糖 阿拉伯糖 甘露糖 木糖 半乳糖
K 1.00 0.81 0.91 1.26 0.94 0.76
计算多糖斜率系数 K =∑K＊aw(a:摩尔百
分数)APW1 ～ 4 则分别为 0.950 、1.050 、0.937 、
1.024 ,由于茅苍术中主要含己糖 ,转化系数 f 取
0.90。参照葡萄糖计算方程 Y =0.005 4X -
0.002 3得:C=(A+0.002 3)＊f /0.005 4＊k ,
计算出各多糖的单糖的含量见表 3。
—252— 南京中医药大学学报 2008年 7 月第 24卷第 4 期
表 2 样品吸收度
样品 吸收度A中性己糖 糖醛酸 蛋白质
APW1 0.683 0.175 0.357
APW2 0.279 0.220 0.334
APW3 0.224 0.552 0.348
APW4 0.205 0.597 0.353
3.2 糖醛酸含量的测定
糖醛酸标准曲线:Y =0.0106X +0.0117 , r=
0.999 2 ,样品的吸收度见表 2 ,样品中糖醛酸的含
量见表3 。
3.3 蛋白质含量的测定
空白管吸收度 0.320 ,标准管吸收度 0.438 ,
样品吸收度见表2 ,样品中蛋白质的含量见表 3。
4 讨论
茅苍术粗多糖APW经分离纯化 ,得 4种主要
纯化多糖 APW1 ～ 4 , 其中 APW1 得率最高为
1.43%,是主要组分;由于 DEAE为弱阴离子交换
表 3 茅苍术多糖含量分析(μg/ mL)
样品 单糖含量质量浓度 百分比浓度(%)
糖醛酸含量
质量浓度 百分比浓度(%)
蛋白质含量
质量浓度 百分比浓度(%)
APW1 120.2 60.1 15.4 7.7 192.8 1.9
APW2 44.6 22.6 19.7 9.8 125.1 1.3
APW3 40.2 20.1 51.0 25.5 145.9 1.5
APW4 33.7 16.9 55.2 27.6 172.0 1.7
树脂 ,从洗脱顺序可以发现 ,APW1 ～ 4 中的糖醛
酸等酸性基团依次增多 ,4 种纯化多糖在分子筛
原理的 Sephadex 凝胶出峰时间趋向变短 ,可以推
断APW1 ～ 4的分子量依次增大 。
各纯化多糖经GC分析 ,表明是杂多糖 ,所含
单糖的种类主要为中性己糖 ,APW1 的单糖种类
至少 6种 ,最为复杂;4种纯化多糖APW1 ～ 4中含
量最多单糖分别是半乳糖 、甘露糖 、阿拉伯糖和甘
露糖 ,且均含与文献报道[ 1-3]肠免疫活性 、抗假丝
酵母菌感染的活性部位相关的阿拉伯糖 、半乳糖
及另外一种单糖甘露糖。
从含量测定可以推测 APW1 ～ 4 中性己糖的
相对含量依次降低 ,而糖醛酸的相对含量增加 ,蛋
白质含量不一;结合得率 , APW1的中性糖 、糖醛
酸 、蛋白质的绝对含量最高;各种多糖由于经过脱
蛋白 、DEAE 、Sephadex的分离纯化 ,并且糖峰与蛋
白峰基本吻合 ,提示 APW1 ～ 4可能是蛋白杂多
糖。有关APW及 APW1的活性正在研究中。
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(编辑:李伟东)
—253—段国峰 , 等:茅苍术多糖的含量分析 第 4期