全 文 ：三叶青对小鼠 Ⅱ型胶原关节炎的影响
吴安安 ,倪荷芳＊　(安徽省黄山市药品检验所 ,安徽 黄山　245011;南京中医药大学科技处 ,江苏 南京　210046)
摘要:目的　观察三叶青对Ⅱ型胶原所致关节炎小鼠的影响;方法　通过皮内注射Ⅱ型胶原造成小鼠关节炎模型 ,观察
三叶青对模型动物关节肿胀度 、关节评分 、关节病理组织学变化等指标的影响。结果　三叶青可抑制造模小鼠关节肿
胀 、降低关节肿胀度评分 , 改善关节病理组织学。结论　三叶青对实验性关节炎小鼠有一定的治疗作用。
关键词:三叶青;胶原关节炎;Ⅱ型鸡胶原
中图号:R282.710.5　文献标识码:A　　　文章编号:1000-5005(2007)05-0307-03
　　三叶青的基源为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖
爬藤 Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg ,以块根
或全草入药 , 具有清热解毒 、祛风化痰 、活血止痛
的功能 ,本研究通过实验方法观察三叶青治疗类
风湿性关节炎(CIA)作用 。
1　实验材料
1.1　药品与试剂
三叶青(Radix Tetrastigmae)为葡萄科植物三
叶崖爬藤(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)的
干燥块根 。雷公藤多苷片 ,批号:20050612 ,浙江
得恩德制药有限公司;Ⅱ型鸡胶原(Collagen Type
Ⅱ ,C Ⅱ), 批号:205106 , 美国 ADL 公司;卡介苗
(BCG)上海生物制品研究所)。
1.2　实验动物
昆明种小鼠 ,雄性 ,体质量 18 ～ 22 g ,由上海
斯莱克实验动物责任有限公司提供 ,生产许可证:
SCXK(沪)2003-0003;实验动物使用许可证:SCXK
(苏)2002-0123。
1.3　实验仪器
0.001 mm 螺旋测微器 , mitutoyo , Tokyo ,
Japan。
2　实验方法
2.1　CⅡ乳剂制备
BCG于 80℃水浴灭活 1 h ,用灭菌液体石蜡
制成 2 mg/mL 的乳剂 , 得完全弗氏 2 型胶原
(FCA),2 mg/mL C Ⅱ(溶于0.2%醋酸 , 4℃放置过
夜)与等体积的 FCA等体积混合 ,即得 CⅡ乳剂 。
2.2　CIA诱发[ 1]
取体质量为 18 ～ 22 g 左右的健康昆明雄性
小鼠 60只 ,用微量注射器于尾跟部皮内注射 FCA
0.1 mL ,把第 1次免疫当天作为 0 d ,20 d ,小鼠用
同样剂量免疫原在同样部位再次免疫小鼠 ,第 2
次免疫后约10 d左右出现多发性关节炎。
2.3　CIA评价
致炎前及后每隔两天用螺旋测微器测量小鼠
左右足跖厚度 ,致炎前后足跖厚度差(肿胀度)表
示反应强度。同时称量小鼠体质量 , 观察鼠耳红
斑 、尾结节出现情况 ,将其得分化 ,关节炎得分计
算[ 1] :0分为正常;1分为仅限于部分关节或脚趾
的轻度发红或肿胀;2 分为趾关节和足跖或踝关
节出现中度肿胀;3 分为踝关节严重肿胀或踝关
节以下全部肿胀;4 分为整个脚爪全部肿胀或关
节严重变形 。4个脚爪的评分之和作为每个小鼠
的关节炎评分 。四肢关节炎得分每只合计最高可
得 16分 。
2.4　分组及处理
动物随机分为 6 组 ,每组 10 只 ,即:①正常
组:给予等容量蒸馏水;②模型组 ,给予等容量蒸
收稿日期:2007-06-08;修稿日期:2007-07-03
基金项目:江苏省中医药局资助项目(H05067)
作者简介:吴安安(1955-),女 ,安徽黄山人 ,安徽省黄山市药品检验所主管药师。 ＊通讯作者:025-85811065
—307—南京中医药大学学报 2007 年 9月第 23 卷第 5期JOURNALOF NANJINGTCMUNIVERSITY Vol.23 No.5 Sep.2007
DOI :10.14148/j.issn.1672-0482.2007.05.016
馏水;③三叶青高剂量组 ,给予三叶青 10 mg/kg;
④三叶青中剂量组 ,给予三叶青 5 mg/kg;⑤三叶
青高剂量组 ,给予三叶青 2.5 mg/kg;⑥阳性对照
组:给予雷公藤多苷片 15 mg/kg 。各组均于造模
后d 20开始灌胃给药 ,给药体积为 20 mL/kg ,连
续给药22 d。
2.5　病理组织学检查方法
实验结束后处死动物 , 取其踝关节固定于
10%福尔马林内 ,脱钙后常规石蜡包埋 ,切片厚 4
～ 5μm ,HE染色 ,由病理专业人员阅片 ,观察关节
滑膜被覆上皮有无细胞变性 ,增生 ,间质有无炎细
胞浸润及肉芽组织形成;关节腔有无减小或闭塞 ,
关节软骨有无破坏或纤维化 ,关节周围皮下组织
有无炎细胞浸润或纤维化 ,根据关节各部位病变
轻重程度 ,依次定量为“1分(轻度或少量)” ,“2分
(中度或多量)” ,“3分(重度或大量)” , “4分(极重
度)” ,无病变组织定为“0 分” 。关节周围皮下组
织病变以半量计算。累加所有分数 ,得出总分 ,计
算出每组每只动物的均分( x ±s),分值越高提示
损伤越严重 ,反之则说明经药物处理后损伤减轻 ,
治疗有效 。
2.6　统计学处理
所有数据均用 x ±s 表示 ,统计采用方差分
析 ,对方差分析有显著差异者进一步用 Bonferroni
test 或Student s t检验比较组间差异。
3　实验结果
3.1　对关节炎发生率及评分的影响
于第 2次免疫当天给小鼠灌胃给药连续 22
d。给小鼠第2次注射 C Ⅱ(d 20)后 ,大约 4 d后
即有小鼠开始出现部分关节红肿并且于 d 13大
部分小鼠左后足跖及前足爪出现肿胀 ,包括踝关
节 、脚趾 、部分小鼠耳朵出现红肿 ,尾部有炎性小
结节 ,关节疼痛 ,活动障碍 。与对照组相比较 ,三
叶青高 、中剂量组明显地减少关节炎和延迟关节
炎起始发生 ,显著地抑制足爪肿胀和肿胀评分。
表 1　三叶青对Ⅱ型胶原所致关节炎小鼠关节
评分的影响( x±s)
组别 剂量/mg·kg-1 发生率(%) 关节评分
正常组 - 0/10 0
模型组 - 9/10 5.96±1.22
低剂量组 2.5 7/10 3.41±0.92
中剂量组 5 5/10 2.45±0.96＊
高剂量组 10 4/10 1.67±0.65＊＊
雷公藤多苷片组 15 3/10 1.62±0.85＊＊
　　注:与模型组比 , ＊P<0.05 , ＊＊P<0.01。
3.2　三叶青对 Ⅱ型胶原所致关节炎小鼠左足关
节厚度的影响
第2次免疫后第 4天(d 26)开始 ,小鼠左足
关节出现明显肿胀 ,左足厚度和肿胀度均大于正
常组 ,免疫后 d 26至 d 28 ,模型组小鼠左足厚度
和肿胀度与正常组相比 ,均具有显著性差异(P<
0.05 , P <0.01)。三叶青高 、中剂量组相小鼠左
足厚度和肿胀度均小于模型组 , 免疫后 d 26 、d
30 、d 38 ,左足厚度和肿胀度与模型组相比 ,均具
有显著性差异(P <0.05 , P<0.01)。表明三叶青
具有抑制关节炎小鼠足肿胀的作用。结果见表 2
-1 、2-2 、3。
表 2-1　三叶青对 II型胶原所致关节炎小鼠左足体积的影响( x±s)
组别 n 小鼠左足厚度/mm
22 d 26 d 30 d
正常组 10 1.586±0.082 1.571±0.055 1.569±0.061
模型组 10 1.609±0.076 1.671±0.092■■ 1.769±0.188■■
高剂量组 10 1.566±0.057＊＊ 1.564±0.038＊ 1.582±0.040＊＊
中剂量组 10 1.547±0.053＊＊ 1.548±0.043＊＊ 1.569±0.058＊＊
低剂量组 10 1.613±0.068 1.639±0.106 1.681±0.140
雷公藤多苷组 10 1.549±0.052 1.536±0.056＊＊ 1.537±0.062＊＊
　　　　　　　注:与模型组相比 , ■■P<0.01;与模型组相比 , ＊P<0.05 , ＊＊P<0.01。
—308— 南京中医药大学学报 2007年 9 月第 23卷第 5 期
表 2-2　三叶青对 II型胶原所致关节炎小鼠左足体积的影响( x±s)
组别 n 小鼠左足厚度/mm
34 d 38 d 42 d
正常组 10 1.563±0.064 1.544±0.053 1.541±0.045
模型组 10 1.837±0.014■ 1.838±0.328■ 1.754±0.355
高剂量组 10 1.593±0.058 1.611±0.089＊ 1.616±0.148
中剂量组 10 1.585±0.042 1.604±0.062＊ 1.648±0.149
低剂量组 10 1.692±0.137 1.742±0.298 1.729±0.200
雷公藤多苷组 10 1.577±0.065 1.568±0.071＊ 1.532±0.078
　　　　　注:与模型组相比 , ■P<0.05;与模型组相比 , ＊P<0.05。
表 3　三叶青对 II型胶原所致关节炎小鼠左足肿胀度的影响( x±s , n =10)
组别 小鼠左足厚度/μm
22 d 26 d 30 d 34 d 38 d 42 d
正常组 160±24.71 145±19.07 143±19.79 137±19.06 118±19.00 115±17.61
模型组 169±14.31 231±43.42■ 329±63.11■ 397±114.08■ 380±102.39■ 304±124.53
高剂量组 118±14.74 116±14.78＊＊ 134±13.48＊＊ 145±15.40 162±22.29＊ 168±45.15
中剂量组 125±21.72 126±15.84＊ 148±13.82＊＊ 160±16.99＊ 179±18.68＊ 223±40.07
低剂量组 174±20.03 206±30.79 249±42.17 259±40.22 306±96.54 293±65.44
雷公藤多苷组 107±14.51 94±14.63＊＊ 96±18.89＊＊ 141±22.27 139±29.48 100±29.92
　　　　　注:与模型组相比 , ■P<0.05 , ■■P<0.01;与模型组相比＊P<0.05 , ＊＊P<0.01。
3.3　三叶青对小鼠足关节组织病理学的影响
结果见表 4。
表 4　三叶青对Ⅱ型胶原所致关节炎小鼠关节病
变轻重程度评分结果( x±s)
组别 n 病变评分
正常组 10 -
模型组 10 12.80±1.71
高剂量组 10 5.38±2.86＊＊
中剂量组 10 8.00±2.68＊
低剂量组 10 11.00±5.43
雷公藤多甙片组 10 7.13±2.29＊＊
　　　　注:与模型组比较 , ＊＊P<0.01 , ＊P<0.05。
4　讨论
类风湿关节炎患者的滑膜中有明显 T淋巴细
胞浸润 , T 细胞在这个炎性过程的起始和维持中
起重要的作用 ,胶原诱导的关节炎是类似于人类
风湿关节炎的动物模型 ,已有大量文献报道 T 淋
巴细胞在其中起的重要作用。尽管缺乏成熟淋巴
细胞的小鼠用 Ⅱ型胶原免疫后仍能形成关节损
伤 ,但显著地疾病起始时间延迟以及疾病严重性
地减轻证明了淋巴细胞在关节炎中的重要作用。
作为关节炎的一个主要参数 ,关节炎小鼠的
足肿胀首先被评价 ,结果表明 ,与对照组比较 ,三
叶青口服给药后 ,能剂量依赖型的抑制 CIA小鼠
的足爪肿胀 ,同时 ,也明显地延缓了疾病起始时
间 ,关节炎发生率和关节评分 ,从病理切片上也可
以明显看到三叶青给药后有效的小鼠改善了关节
炎症 ,表现为炎性细胞浸润减少 ,滑膜增生减轻 ,
正常的关节结构的维持 ,尤其是在有效的同时并
不影响小鼠体质量以及对免疫器官的无毒性 ,三
叶青的这种作用对长期服用治疗慢性炎症性特别
是类风湿关节炎的是非常有益的。
参考文献:
[ 1] Rosoniec EF , Cremer M , Kang A , et al.Collagen-induced
arthritis.In:Coligan JE , Kruisbeek AM , Margulies DH , She-
vach EM , Strober W , editors[ J] .Current Protocols in Immunolo-
gy.New York , 1996.15.5.1.
(编辑:李伟东)
—309—吴安安 , 等:三叶青对小鼠Ⅱ型胶原关节炎的影响　第 5期