全 文 ：新中医 2015年 11月第 47卷第 11期
JOURNAL OF NEW CHINESE MEDICINE November 2015 Vol.47 No.11
［收稿日期］ 2015-06-20
［作者简介］蒋维尔（1984-），女，主管药师，主要从事中药学研究工作。
肿瘤细胞的增殖和凋亡是肿瘤细胞发展的重要因素，当机
体正常调控机制发生紊乱时，肿瘤细胞的增殖能力将快速增
强，而肿瘤细胞的转移作为恶性肿瘤的特征之一，其中细胞的
迁移是促进肿瘤细胞浸润和转移的重要因素。化疗药物在临床
中广泛应用，但不良反应严重，中药在肿瘤的治疗中正发挥其
独特的优势。三叶青，又名蛇附子，属葡萄科植物，《中药大
辞典》 [1]记载其具有清热解毒、祛风止痛等功效，临床常用来
治疗高热惊厥、肺炎、支气管炎、咽喉炎等疾病。有学者研究
指出，三叶青提取物对人黑色素瘤细胞、人宫颈癌细胞、胃癌
细胞和膀胱癌细胞具有抑制作用[2]。本研究提取分离三叶青的
有效部位，研究其对人乳腺癌细胞MCF-7增殖和迁移的抑制
作用，并进一步探讨其作用机理，为其成药性提供理论基础。
1 材料
1.1 受试药物 三叶青块根饮片购自杭州市三叶青科技有限
公司，经鉴定为 Tetrastigma hemsleyanumDielset.Gilg。取三叶
青块根4kg，粉碎后经70%乙醇加热回流2次，每次2.5h，
减压回收乙醇旋干后，用少量去离子水复溶，再经乙醚萃取3
次，经冷冻干燥，等到冻干粉后备用，约为18.6g。注射用环
磷酰胺(CTX，江苏恒瑞医药股份有限公司)。
1.2 细胞株 人乳腺癌细胞MCF-7，购自上海中国科学院生
物化学与细胞所。
1.3 实验仪器与试药 RPMI1640培养基和胎牛血清，美国
GIBCO公司；磺酰罗丹明B(SRB)，Sigma公司；乳酸脱氢酶
(LDH)试剂盒，南京建成科技有限公司；细胞周期检测试剂
盒，凯基生物。CO2培养箱：上海喆图科学仪器有限公司；流
式细胞仪FM500，美国贝克曼库尔特有限公司。
2 方法
2.1 细胞培养 人乳腺癌细胞MCF-7在RPMI1640培养基
(含有10%胎牛血清)，37℃，5%CO2的恒温细胞培养箱内进
行培养。
2.2 体外检测细胞增殖实验 取对数生长期的MCF-7细胞，
按每孔200μL(10000个细胞)加入96孔细胞板中，培养24h
后，分别加入不同浓度的三叶青有效部位200μL，阴性对照
组只加入200μL培养基，阳性对照组加入等体积CTX。培养
48h后，除去上清，每孔加入200μL三氯乙酸(TCA)，于4℃
冰箱固定40min后，弃去固定液，并用去离子水轻轻冲洗3
遍后每孔加入 100μL SRB，于 37℃恒温培养箱 30 min 后，
弃去SRB，冲洗后每孔加入150μL三羟甲基氨基甲烷(Tris)，
选择酶标仪540nm波长测得每孔光吸收值。肿瘤细胞生长抑
制率(%)=(对照组OD值-给药组OD值)/(对照组OD值-空
白组OD值)×100%。
2.3 细胞迁移实验 用划线灼伤法研究三叶青有效部位对
三叶青有效部位抑制肿瘤增殖和迁移的作用研究
蒋维尔，徐军烈
浙江中医药大学附属广兴医院，浙江 杭州 310000
［摘要］目的：观察三叶青有效部位对人乳腺癌细胞 MCF-7增殖和迁移的抑制作用及相关机制研究。方法：制备三叶青有效
部位，将接种于培养板的 MCF-7细胞分为阴性对照组，三叶青有效部位给药组和阳性对照组，观察细胞增殖抑制率、IC50值、乳
酸脱氢酶（LDH） 活力、迁移距离、细胞周期分布和凋亡率。结果：与阴性对照组相比，三叶青有效部位 5～160 g/L各剂量组和阳
性对照组对 MCF-7细胞增殖有显著抑制作用（P ＜ 0.01），且随着浓度的增大，三叶青有效部位对 MCF-7细胞的抑制率呈剂量依
赖性关系。三叶青对 MCF-7细胞增殖的 IC50值为（22.35±1.02） g/L。与阴性对照组相比，当给药浓度为 160 g/L时，LDH活力明
显增加（P ＜ 0.05）。与阴性对照组相比，经药物处理 48 h后，随着剂量的增大，MCF-7细胞的迁移能力被明显抑制（P ＜ 0.05，
P ＜ 0.01），呈明显的剂量依赖性。与阴性对照组相比，三叶青有效部位作用后，随着给药浓度的增大，G0/G1期细胞比例降低，S
期和 G2/M期细胞比例增大，凋亡率升高（P ＜ 0.01）。结论：三叶青有效部位可有效地抑制 MCF-7细胞的增殖和迁移，其作用机
制可能与阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡有关。
［关键词］肿瘤；三叶青；乳腺癌细胞；MCF-7
［中图分类号］R285.5 ［文献标志码］A ［文章编号］0256-7415（2015） 11-0204-03
DOI：10.13457/j.cnki.jncm.2015.11.090
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新中医 2015年 11月第 47卷第 11期
JOURNAL OF NEW CHINESE MEDICINE November 2015 Vol.47 No.11
MCF-7细胞的迁移作用。将已消化悬浮的MCF-7细胞按每
孔10×104个接种到24孔板中，培养24h，用移液枪头在每
孔的中央划一条灼伤带，宽约 0.5 mm，用磷酸盐缓冲液
(PBS)洗去脱落细胞，加入含不同浓度的三叶青有效部位和阳
性对照组的细胞培养基。在显微镜下(100×)进行拍照，用IPP
图像软件进行分析，计算灼伤带距离。
2.4 LDH活力检测 取给药组和对照组的上清液，根据LDH
测定试剂盒进行酶活力的检测。
2.5 细胞周期的检测 将MCF-7细胞培养于6孔板中，加
入三叶青有效部位处理48h后，消化悬浮细胞，离心收集后，
严格按细胞周期检测试剂进行操作。
2.6 统计学方法 计量资料以(x±s)表示。多组间均数的比较
采用单因素方差分析，组间均数两两比较，方差齐时采用
SNK法，方差不齐时采用Dunnett’sT3法。由SPSS22.0软
件完成。
3 实验结果
3.1各组对 MCF-7细胞增殖的抑制作用 见表1。与阴性对
照组相比，三叶青有效部位5～160g/L各剂量组和阳性对照
组对MCF-7细胞增殖有显著抑制作用(P<0.01)，且随着浓度
的增大，三叶青有效部位对MCF-7细胞的抑制率呈剂量依赖
性关系。三叶青对MCF-7细胞增殖的IC50值为(22.35±1.02)
g/L。
表 1 各组对MCF-7细胞增殖的抑制作用(x±s，n=3)
与阴性对照组比较，①P < 0.01
3.2各组 LDH活力检测结果 见表2。与阴性对照组相比，
当给药浓度为160g/L时，LDH活力明显增加(P＜0.05)。
表 2 各组 LDH活力检测结果(x±s，n=3)
与阴性对照组比较，①P ＜ 0.05
3.3各组对 MCF-7细胞迁移距离的作用 见表3。与阴性对
照组相比，经药物处理 48 h后，随着剂量的增大，MCF-7
细胞的迁移能力被明显抑制(P＜0.05，P＜0.01)，呈明显的剂
量依赖性。
表 3 各组对 MCF-7细胞迁移距离的作用(x±s，n=3) μm
与阴性对照组比较，①P ＜ 0.05，②P ＜ 0.01
3.4各组对 MCF-7细胞周期和凋亡的影响 见表4。与阴性
对照组相比，三叶青有效部位作用后，随着给药浓度的增大，
G0/G1期细胞比例降低，S期和G2/M期细胞比例增大，凋亡
率升高(P＜0.01)。
表 4 各组对 MCF-7细胞周期和凋亡的影响(x±s，n=3) %
与阴性对照组比较，①P ＜ 0.01
4 讨论
我国的肿瘤发病率一直处于高发水平，目前对于肿瘤的临
床治疗以化学药品为主要手段，但其日益凸显的负作用不断增
加，例如有费用昂贵、不良反应严重、静脉损伤等一系列问
题。随着天然中药的不断开发，从中提取和分离得到的有效部
位不仅可以有效地抑制肿瘤细胞的生长，且价格实惠，大大减
轻了患者的经济负担。同时，中药还具有调节人体免疫力、减
少药物耐受性等优点。
三叶青是我国独有的珍贵植物，以块根或全叶入药，含有
黄酮、花青素类等成分，具有抗肿瘤、抗炎，治疗哮喘、风湿
和免疫调节等多种功效。有学者指出，三叶青对多种肿瘤细胞
的生长具有抑制作用[3～4]。程伟等[5]发现三叶青提取物对肺癌
A549细胞有良好的抑制作用，可诱导细胞凋亡。丁丽等[6]发
现三叶青水提物对人宫颈癌细胞Hela229和人恶性黑色素瘤
细胞A375体外抑制作用确切。有医者在乳腺癌患者治疗过程
中辅以三叶青，其可清热解毒、消肿散瘀，结果发现三叶青治
疗乳腺癌有一定的疗效[7]。但关于三叶青对乳腺癌细胞的实验
室研究少见报道。
本研究提取和分离三叶青有效部位，对其抑制乳腺癌
MCF-7细胞的增殖和迁移作用进行研究，结果发现，三叶青
有效部位对MCF-7细胞增殖的抑制作用随浓度的增大而逐渐
组 别
阴性对照组
三叶青有效部位组
阳性对照组
剂量(g/L)
-
5
10
20
40
80
160
0.1
抑制率(%)
0
28.68±3.14①
39.92±4.61①
49.13±5.01①
56.58±6.89①
65.36±7.01①
78.54±9.01①
80.82±6.05①
IC50(g/L)
22.35±1.02
组 别
阴性对照组
三叶青有效部位组
剂量(g/L)
-
80
160
LDH(U/L)
548.18±61.68
588.15±82.12
812.24±123.42①
组 别
阴性对照组
三叶青有效部位组
阳性对照组
剂量(g/L)
-
5
10
20
0.15
0h
492.6±24.2
482.5±20.8
485.2±19.2
490.6±23.8
489.6±21.2
48h
171.5±22.7
194.5±21.7
124.6±20.3①
94.2± 3.2②
83.1± 9.5②
组别
阴性对照组
三叶青有效部位组
阳性对照组
给药浓度(g/L)
-
5
10
20
0.15
凋亡率
1.34±0.12
9.24±0.51①
16.86±1.34①
20.12±1.84①
14.85±1.21①
G0/G1
45.09±3.75
31.20±3.45①
18.10±1.94①
8.09±2.08①
5.24±1.73①
S
39.35±2.98
52.06±2.81①
60.31±3.82①
63.18±4.36①
59.49±0.79①
G2/M
15.56±1.06
16.74±1.55
21.59±1.65①
28.73±1.70①
25.27±2.06①
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新中医 2015年 11月第 47卷第 11期
JOURNAL OF NEW CHINESE MEDICINE November 2015 Vol.47 No.11
灯盏生脉胶囊是由灯盏细辛、人参、五味子和麦冬制成的
复方制剂[1]，具有益气养阴、活血健脑之功效。主要用于气血
两虚，瘀阻脑络引起的胸痹心痛、中风后遗症、冠心病心绞
痛、缺血性心脑血管疾病以及高脂血症的治疗[2]。灯盏花乙
素为灯盏生脉胶囊的主要活性成分之一，具有清热解毒、扩
张血管、降低血管阻力、抗血小板聚集、改善体内微循环等作
用[3～4]。本实验运用高效液相色谱法(HPLC)建立了灯盏生脉胶
囊中灯盏花乙素的含量测定方法，该方法可靠，简单可行，专
属性强，重复性好，结果报道如下。
1 实验材料与仪器
1.1 药品与试剂 灯盏花乙素对照品(中国药品生物制品鉴定
所提供，批号11084，纯度≥92.1%)；灯盏生脉胶囊由云南
增大，MCF-7细胞的 IC50值为(22.35±1.02) g/L，当给药浓
度为160g/L时，LDH活力增大，提示出现细胞毒作用，且远
远高于IC50值，提示该有效部位给药浓度有较大的安全范围。
迁移实验结果显示，MCF-7细胞的迁移距离随给药浓度的升
高而减少，提示三叶青有效部位可明显抑制MCF-7细胞的迁
移能力。细胞周期可反映细胞的增殖状态，分析流式细胞仪结
果可知，三叶青有效部位可将MCF-7细胞阻滞于S和G2/M
期，并诱导细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤生长的作用。
综上所述，三叶青有效部位对MCF-7细胞的增殖和迁移
有抑制作用，且用药安全范围广，其作用机理可能与阻滞细胞
周期、诱导细胞凋亡有关，但其详尽的作用机制有待进一步深
入研究。
［参考文献］
[1] 江苏新医学院．中药大辞典[M]．上海：上海人民出版
社，1977：2123.
[2] 丁丽，纪其雄．三叶青抗肿瘤活性部位的筛选研究[J]．
海峡药学，2011，23(12)：46-48.
[3] 汪珍，冯健，王晓华，等．三叶青提取物对人结肠癌细
胞系 RKO 细胞调亡的影响[J]．浙江中医药大学学报，
2008，32(3)：321-324.
[4] 倪克锋，丁志山，黄挺，等．三叶青黄酮对H-22荷瘤
小鼠瘤体的抑制作用及其机理研究[J]．浙江中医药大学
学报，2008，32(6)：732-734.
[5] 程伟，陆曙梅．三叶青提取物对肺癌A549细胞的体外抑
制作用[J]．中国实验方剂学杂志，2007，13(1)：53-56.
[6] 丁丽，纪其雄，吕雯婷，等．三叶青水提物体内、体外
抗肿瘤作用的研究[J]．中成药，2013，35(5)：1076-
1078.
[7] 石镇东，张尊祥．中医辨证论治乳腺癌经验总结[J]．中
医学报，2013，28(11)：1610-1611.
（责任编辑：吴凌）
［收稿日期］ 2015-06-05
［作者简介］孙银芳（1984-），女，主管中药师，研究方向：中药学。
HPLC 法测定灯盏生脉胶囊中灯盏花乙素含量的研究
孙银芳
余姚市中医院，浙江 余姚 315400
［摘要］目的：建立灯盏生脉胶囊中灯盏花乙素含量测定的高效液相色谱法（HPLC）。方法：选用Water XTerra RP C18色谱柱
（5 μm，4.6 × 150 mm），以乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钾（含 0.1%三乙胺）（15 ∶ 85，v/v） 为流动相；流速：1.0 mL/min。检测波长
为 334 nm。柱温及进样器温度：室温。结果：灯盏花乙素在 6-100 μg/mL的浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系，r=0.9991。
灯盏花乙素的平均加样回收率为 100.14，RSD=1.14。结论：HPLC法测定灯盏生脉胶囊中灯盏花乙素含量操作简便，结果准确，
重现性好，可用于控制灯盏生脉胶囊的质量。
［关键词］灯盏生脉胶囊；灯盏花乙素；高效液相色谱法（HPLC）；含量测定
［中图分类号］R284.1 ［文献标志码］A ［文章编号］0256-7415（2015） 11-0206-03
DOI：10.13457/j.cnki.jncm.2015.11.091
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