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(收稿日期:2008-06-27)
正交设计法优选三叶青中总黄酮的
提取工艺
毛一亮1 ,张佳佳2 ,丁萍月2 ,陈莉莉2 ,巫　军2＊
(1.奉化市第二医院 , 浙江 宁波 315002;2.浙江医药高等专
科学校 ,浙江 宁波 315000)
摘要:目的　研究三叶青中总黄酮的提取工艺。 方法　采用
正交试验法 ,以总黄酮含量为考察指标 , 优化三叶青中总黄酮
的提取工艺。结果　最佳提取工艺为 1∶15 倍煎药液得量 ,
回流提取 2 次 ,每次 3 h。结论　该试验工艺稳定 ,重现性好。
关键词:三叶青;总黄酮;正交设计
中图分类号:R284.2　　　文献标识码:A　　　
文章编号:1004-2407(2008)06-0369-02
基金项目:宁波市自然科学基金(2007A610038)
作者简介:毛一亮 ,男 , 本科 ,主管中药师
＊通讯作者:巫军 , 男, 博士(后), 副研究员, Tel:0574-86300968 ,
E-mail:w u919067@126.com
　　三叶青为葡萄科三叶崖爬藤 Tetrastigmatis hems-
leyanum Diels &Gilg 的干燥块根 ,性寒味苦 ,具有清
热解毒 、祛风化痰 、活血止痛的功效 。黄酮是三叶青
中的主要有效成分 , 具有抗肿瘤 、抑制真菌等作
用[ 1 , 2] ,常被用来代替三叶青用于制剂生产 , 关于三
叶青黄酮提取制备工艺的研究 ,多以水为溶剂进行提
取 ,但未见综合考察煎煮条件即加水量 、煎煮时间 、煎
煮次数及其两两间的交互作用对三叶青总黄酮煎出
率影响的报道。为寻找三叶青煎煮的最佳条件 ,使三
叶青的煎煮工艺科学化 ,笔者全面考察了煎煮次数 、
煎煮时间 、煎煮液得量三因素及其交互作用对三叶青
黄酮煎出效率的影响 ,用 L 27(313)正交表安排试验 ,
以紫外分光光度法测定煎液中三叶青黄酮的含量 ,确
定了本实验条件下的最佳煎煮条件 ,现报道如下。
1　仪器与试药
751G 型紫外分光光度计(上海精科实业有限公
司);调温电热套;芦丁(中国药品生物制品检定所);
三叶青饮片(外购 ,宁波市药检所鉴定);所用试剂均
为分析纯 。
2　方法与结果[ 3-5]
2.1　正交表的设计
2.1.1　选表　选择煎煮次数(A)、煎药液得量(B)和煎
煮时间(C)3个因素 ,每个因素各取 3个水平 ,并考虑到
各因素间可能产生交互作用 ,故选择 L27(313)正交表。
2.1.2　表头设计　因素各占 1列 ,交互作用占 2列 ,
D ,E ,F 和 G 为误差列 , A×B ,A ×C , B×C 分别为 A
与 B ,A 与 C和 B 与 C的交互作用 ,见表 1 。
2.1.3　因素水平表　见表 2。其中 B为总煎药液得
量 ,C为总时间。当煎煮次数为2次时 ,则每次的煎药液
得量和煎煮时间分别为总煎药液得量和总时间除以 2。
表 1　三叶青煎出率工艺筛选表头设计
因素 A B A×B C A×C B×C D E B×C F G
列号 1 2 3　4 5 6　7 8 9 10 11 12 13
表 2　三叶青煎出率工艺筛选因素水平表
水平 因　　　　素
A/次 B/倍 C/ h
1 1 9 1
2 2 12 2
3 3 15 3
2.2　标准曲线制备 　精密称取芦丁对照品 11.90
mg ,加体积分数 70%乙醇配成 23.8 g ·L-1的标准溶
液 。分别精密吸取2.0 ,3.0 ,4.0和 5.0 mL置 100 mL
量瓶中定量 ,摇匀 ,在751 G 紫外分光光度计上于波长
276 nm处测定吸收度 ,计算回归方程为 C=0.00 19+
0.018 08A , r =0.999 9 ,C为质量浓度(g ·L-1), A为
光密度值 ,线性范围为 11.90 ～ 47.60 g ·L-1 。
2.3　三叶青中总黄酮的含量测定　考虑到经济简
便 ,采用文献方法 ,测定煎药液中三叶青黄酮的含量 ,
计算各实验条件下煎药液中三叶青总黄酮的煎出率 ,
称取 3份三叶青饮片 ,每份 100 g ,加水煎煮 ,用电热
套模拟硬气加热 ,使煎液保持微沸状态 ,共煎 9次 ,每
次 2 h ,第 1次加水 750 mL(三叶青吸水率为 2.51
mL· g-1),其余各次均为 500 mL ,测得第 9次煎液的
透光率 T 为 101.1%,100.8%和 100.5%,说明已将三
叶青黄酮提取完全 ,分别合并前 8次煎液 ,各得 3.340
mL。分别取少量药液离心 15 min ,精密吸取 1.0 mL ,
加 6 mol· L-1盐酸 6 滴 ,离心 ,倾出上清液 ,沉淀用
70%乙醇热溶 ,转入50 mL量瓶中 ,加0.2 mol·L-1盐
酸定容。另精取 2.0 mL 70%乙醇于 25 mL 量瓶中 ,
加 0.2 mol·L-1盐酸定容作为空白溶液 ,在波长 276
nm处测定吸收度 ,计算得三叶青中总黄酮含量为每
100 g三叶青中含三叶青总黄酮 13.16 g 。
2.4　不同条件下三叶青煎液中三叶青总黄酮煎出率
的测定　称取三叶青 100 g ,按 L27(313)正交表 ,随机
抽取实验号进行试验 ,用调温电热套模拟硬气加热 ,
从沸腾开始计时 ,使药液保持微沸 ,药液得量控制在
理论得量的 5%以内。将所得煎液摇匀 ,取少量药液
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离心 ,按上述方法测定 ,计算各样品煎液中三叶青黄
酮的含量 ,并计算煎出率 ,结果见表 3 。
2.5　数据的统计分析　将煎出率数据填入正交表及
方差分析表中进行方差分析 ,结果见表 4。由数据处
理结果可得以下结论:
(1)A , B和 C三因素都很显著(P <0.01),即 3
个因素对三叶青黄酮的煎出率都有显著影响 。
(2)各因素中各水平的影响 ,A 3 >A 2 >A 1 , B3 >
B2 >B1 , C3 >C2 >C1 。因此 , 本实验最佳条件是
A 3B3C3 ,即煎煮 3次 ,煎药液得量为 15倍 ,煎煮 3 h 。
(3)比较 F 值 , FA >FB >F C ,可知各因素对煎出
率的影响次序是 A>B>C 。
(4)A×B , A×C ,B×C 对煎出率影响很小 ,可忽
略不计 ,即可以认为 A ,B ,C之间没有两两交互作用。
表 3　三叶青煎液总黄酮含量及煎出率
试验号 三叶青黄酮含量/g ·kg-1 煎出率/ %
1 103.995 57.26
2 104.881 57.75
3 107.314 59.09
4 120.912 66.58
5 120.682 66.45
6 125.995 69.38
7 134.287 73.94
8 126.454 69.63
9 127.840 70.39
10 126.686 69.76
11 128.774 70.91
12 139.543 76.84
13 134.502 74.06
14 136.692 75.27
15 149.055 82.07
16 138.668 76.35
17 144.752 79.70
18 156.774 86.32
19 128.432 70.72
20 143.712 79.13
21 141.417 77.87
22 145.256 79.98
23 138.165 76.08
24 155.259 85.39
25 151.456 83.39
26 151.455 83.39
27 160.282 88.25
表 4　三叶青煎出率方差分析
方差来源 方差 自由度 F值 P 值
A 540.06 2 107.69 <0.01
B 238.98 2 47.65 <0.01
C 61.92 2 12.35 <0.01
A×B 7.52 4 1.51 >0.05
A ×C 12.75 4 2.54 >0.05
B×C 5.53 4 1.10 >0.05
误差(E) 　 5.015 8 -
2.6　最佳条件的进一步验证和选择　考虑到煎出率
达到 80%以上即达到设计要求 ,实际生产中每多煎 1
次 ,在人力和能源上消耗较大 ,又从表 3 中看出 ,第
18号实验即条件为 A 2B3C3 时 ,煎出率接近条件为
A 3B3C3 的煎出率 ,故将最佳条件确定为 A 2B3C3 即
煎 2次 ,3 h ,煎药液得量 15倍 。
根据实验确定的最佳工艺 ,按 A2B3C3 参数制备 3
批样品 ,按 2.3项下方法检测 ,测得其三叶青总黄酮含
量分别为 158.384 , 153.211 和 161.159 g ·kg-1 ,煎出
率分别为 87.22%,84.37%和 88.74%,结果证明工艺
路线A 2B3C3 可行。
3　讨论
三叶青主要活性成分为黄酮类化合物 ,煎煮次
数 、煎药液得量和煎煮时间是影响其总黄酮煎出率的
主要因素。本文以正交试验对各因素水平进行考察 ,
以选择最佳工艺 。煎药液得量和煎煮时间试验中 ,溶
剂量超过 15 倍 ,煎煮时间超过 3 h ,对其总黄酮含量
和煎出率无显著性影响 ,考虑产业化时降低生产成
本 ,选择 15倍量溶剂进行提取 ,提取时间 3 h 。
在因素水平相同的条件下 ,通过正交试验可以提
高试验的精确度 ,同时又避免使用更大的正交表 ,较
好地消除方法误差和操作误差对试验结果的影响 ,分
析结果更准确。
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(收稿日期:2008-05-29)
RP-HPLC法测定黄花蒿中青蒿素
含量
张小燕 ,王小宾 ,李美娜 ,郭 　琪(西安皓天生物工程技
术有限责任公司 ,陕西 西安 710075)
摘要:目的　建立青蒿素的含量测定方法。方法　采用 HPLC
外标法。色谱柱为 C18柱(250 mm×4.6 mm , 5μm);流动相为
乙腈-水(45∶55);流速为 1.0 mL·min-1 ;检测波长为203 nm;
柱温为 30 ℃。结果　青蒿素对照品溶液在 13.08 ～ 52.32 μg
的质量范围内与峰面积线性关系良好 , r =0.998 8 , 平均回收
率为 100.4%, RSD为 0.9%(n =5)。结论　该方法可用于青
蒿素的含量测定。
关键词:青蒿素;反相高效液相色谱;含量测定
中图分类号:R927.2　　　文献标识码:A　　　
文章编号:1004-2407(2008)06-0370-02
青蒿为菊科植物黄花蒿 Artemisia annum L .的
干燥地上部分 , 从青蒿中提取的青蒿素(Artean-
nium)是抗疟疾的有效成分[ 1] 。目前 ,青蒿素的检测
370 西北药学杂志　2008 年 12 月　第 23 卷　第 6 期