全 文 ：中华山荷叶内生真菌的分离
及其发酵产生药用成分的初步研究
云南大学生命科学学院生物系(650091)
刘仕平　曾松荣　郭仕平　杨春艳　张玲琪
　　【摘　要】　目的　从采自云南省中甸县的中华山荷叶(Diphylleia sinensis Li)的根状茎中分离出可产生鬼臼毒
素或其类似物的内生真菌。方法　按常规无菌方法分离内生真菌 , 纯化后接种于 PDA 斜面备用 ,液体培养基为改
良的 MM 培养基。用 T LC 和 HPLC 方法对发酵产物进行检测。结果　经 TLC 检测 , 发现 99SJ21 的 Rf值与标样
的 Rf值相同。经 HPLC 分析 , 发现 99SJ21的发酵产物在相同的设定条件下与标样在 tR4.34 min 的波峰一致。经
鉴定 , 99SJ21为纠缠青霉(Penicillium implicatum Biourage)。结论　99SJ21 的确产鬼臼毒素类化合物。
　　【关键词】　内生真菌;中华山荷叶;鬼臼毒素;纠缠青霉
Preliminary study on the isolation of endophytic fungus from Diphylleia sinensis and its fermentation to produce active
therapeutic principle　　LIU Shi-ping , ZENG Song-rong , GUO Shi-ping , Y ANG Chun-yan , ZHANG Ling-qi.Biolo-
gy Department , School of Li fe Science , Y unnan University.Kunming 650091 , China
【Abstract】　Objective　To isolate the fungi w hich could produce podophyllotoxin o r its analo gues from Diphylleia
sinensis in Zhongdian County , Yunnan Province.Methods　The endophy tic fungus was isolated by means of aseptic ma-
nipulation , cultiva ted w ith PDA medium , then fermented in modified liquid MM medium , and its fermentation products
w ere analyzed by TLC and HPLC.Results　The Rf value of 99SJ21 is the same as tha t of the standard sample by TLC ,
so is the wave crest at tR4.34 min by HPLC under same given conditions.99SJ21 w as identified to be Penicillium implica-
tum Biourage.Conclusion　99SJ21 can produce podophy llotoxin o r its analogues which have anticancer activity.
【Key words】　Fungi;Diphylleia sinensis Li;Podophy llotox in;Penicillium implica tum Biourage
　　中华山荷叶(Diphylleia sinensis Li)为小檗科
(Berberidaceaeg)鬼臼亚科(Podophylloideae)山荷叶
属(Diphylleia)的多年生草本植物 ,也叫窝儿七或山
荷叶[ 1] 。它是我国特产的一种传统草药 ,其根状茎
入药具有清热解毒 、活血散瘀 、消炎止痛的功
效[ 1 ,2] 。其 根 状 茎 等部 位 含 有 的 鬼 臼 毒 素
(podophy llotoxin ,C22H22O6)含有独特的反式内酯环
结构 ,主要阻止细胞分裂前期(G2 期)或从 G2 期进
入分裂期的过程 ,属于细胞周期特异性药物[ 1 , 2] ;它
是治疗尖锐湿疣的良好药物 ,亦是合成多种治疗癌
症药物的前体 ,因而具有较大的经济价值[ 3 ,4] 。鬼
臼毒素一直是从小檗科鬼臼亚科植物中提取 ,含量
低 ,远不能满足要求 ,加之于对植物原料需求的增
多 ,已使这类植物资源遭到严重破坏。化学合成及
植物组培虽然取得不同程度进展 ,但仍然无法实现
大规模工业化生产。故希望从中华山荷叶中分离出
能产鬼臼毒素类化合物的菌株 ,为抗癌药物生产开
基金项目:国家自然科学基金资助项目(39860005);云南省农业
生物技术重点实验室资助项目(2002B-01)
辟新途径。
1　材料与方法
1.1　材料:中华山荷叶(Diphy lleia sinensis)采自云
南省中甸县 ,鬼臼毒素(podophy llotoxin)标准样品购
自 SIGMA 公司 。
1.2　培养基[ 5] :马铃薯葡萄糖培养基(PDA),查氏
培养基 ,改良 MM 培养基。
1.3　内生真菌的分离:按常规无菌操作。将山荷叶
根状茎用自来水洗净后 ,剪切成 2 ～ 3 cm 长的小段 ,
然后按下列程序进行表面消毒:75%酒精漂洗 3 ～ 5
min※无菌水冲洗 3 ～ 4次※0.1%的升汞漂洗 4 ～ 5
min※无菌水冲洗4 ～ 5次。将上述处理的根状茎在
超净台上取其韧皮部 ,切割成约 0.5 cm ×0.5 cm 的
小片 ,将小片种植于 PDA平板上 ,置于 28 ℃温箱培
养 3 ～ 7 d ,即可见样品边缘有真菌菌丝长出 ,经纯化
后转到 PDA斜面上备用 。
为了检查表面消毒的效果 ,进行对照实验:把空
白平板打开 ,摆在超净台上 10 min;将上述同样表
面消毒过的材料不做任何切割 ,直接种植于 PDA平
皿上 。在相同条件下培养。结果 ,两种对照处理均
·227·中国药物与临床 2003年 6月第 3卷第 3期Chinese Remedies &Clinics , June 2003 , Vol 3 , No.3
未有菌丝长出 ,多次重复都是同样结果。证明表面
消毒是彻底的 ,从而保证了所分离到的真菌是植物
的内生真菌而不是空气中的和材料表面的附生菌 。
1.4　内生真菌的液体培养:液体培养基为改良MM
培养基 。将 100 ml液体培养基装入 500 ml的三角
瓶中 ,每个菌号装 5瓶 ,灭菌。挑取适量的菌丝或孢
子接种于三角瓶中 , 28 ℃,110 r/min摇床培养 6 d ,
待菌丝长好后进行提取。
1.5　发酵产物提取:取发酵液※三层无菌纱布过滤
※分别收集菌丝和滤液※冷冻菌丝体数十分钟后 ,
充分捣碎并加入到滤液中※等体积 CHCl3 萃取 ※
取有机相※蒸馏浓缩至 10 ml备用。
1.6　产物的检测:①薄层层析(TLC)初步检测:鬼
臼毒素标准样品购自 SIGMA 公司;硅胶 G 板购自
青岛海洋化工厂;展开剂:氯仿-甲醇(95∶5 V/ V),
氯仿-乙酸乙酯(8∶2 V/ V);显色剂采用浓硫酸-乙
醇(1∶1 V/ V);烘烤温度和时间:120 ℃, 5 min。 ②
高效液相色谱(HPLC)进一步分析:仪器与色谱条
件:Waters 201型高效液相色谱仪 ,Model 510型泵 ,
UV 481型检测器 , U6K型进样器 ,Bondapak C18型
分析柱(300 mm×3.9 mm ,填料粒径 10μm );流动
相 MeOH∶H2O (50∶50 V/ V),流速 1.0 ml/min ,检
测波长 UV 254 nm ,进样量 10μl ,室温操作 。
2　结果与讨论
2.1　中华山荷叶内生真菌 99SJ21的形态特征及生
长特性:本次从中华山荷叶根状茎中共分离到了 25
株内生真菌 ,其中有一株(99SJ21)产鬼臼毒素类抗
癌物质 ,经鉴定为纠缠青霉(Penicillium implicatum
Biourage),菌株 99SJ21的迟缓期较短 ,为 1 d左右 ,
之后便迅速生长 ,到第 4天时 ,生物量达到最高值 ,
第 5天后开始下降。
2.2　中华山荷叶内生真菌 99SJ21发酵产物的检
测:通过不同的展开剂进行 TLC 检测 ,发现 99SJ21
的 Rf值与标样的 Rf值相同 。将初提物进一步纯化
作HPLC分析 ,发现 99SJ21的发酵产物在相同的设
定条件下与标样在保留时间 tR4.34 min 的波峰一
致 ,重复 3次均如此 。说明 99SJ21的确产鬼臼毒素
类化合物 。
3　讨　　　论
生物在次生代谢过程中 ,其生化途径的连续演
化会导致有益物质进入共生体中 ,其基本的生物过
程信息有时还会传递到其他生物[ 6] 。张玲琪等[ 7]
研究发现 ,植物内生真菌也能产生与宿主所产不同
的活性成分 。具有相同次生代谢产物的生物合成途
径可能是由于相关基因的直接传递 ,这种传递可以
发生在寄生生物与寄主或共生生物与宿主之间相互
作用过程中;或者更直接地在共同生活环境中 ,经长
期相处直接接触而传递吸收遗传物质 ,如 Li等[ 8]从
美国南卡罗纳州一沼泽园里与红豆(Taxus brevifoli-
a)杉具有相同生态环境的一棵落羽松 bald cypress
(Taxodium distichum)的几个小枝中分离出 9株产
紫杉醇的内生真菌 ,这可能是红豆杉中能产生紫杉
醇的内生真菌 ,在一定条件下通过宿主转换进入与
红豆杉植物具有相同生态环境的非红豆杉植物。
“内共生理论”认为 ,在共生体内 ,一旦次生代谢中有
用生化途径出现 ,该途径就能被其他生物所利用 ,表
现出相互作用和 “协同进化(co-evolution)”[ 9] 。如
Roth等[ 10]认为哺乳动物的某些细胞调节机制即是
从微生物协同进化而来的。中华山荷叶植物能产鬼
臼毒素类物质 ,我们现在从其根状茎中分离出一株
能产此类物质的内生真菌 ,它们基因组中应都有相
关的遗传信息。
参 考 文 献
1　杨仓良 ,主编.毒药本草.北京:中国中医药出版社 , 1993.132-
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5　范秀容 ,李广武 ,沈萍 ,编.微生物学实验.北京:高等教育出版
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酵工程学科的进展———第三次全国发酵工程学术讨论会论文
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9　王伯荪 ,李鸣光 ,彭少麟,著.植物种群学.北京:高等教育出版
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(收稿日期:2002-12-02)
·228· 中国药物与临床 2003年 6月第 3卷第 3期C hinese Remedies &Clinics , June 2003 , Vol 3 , No.3