全 文 ：515※营养卫生 食品科学 2005, Vol. 26, No. 9
收稿日期：2005-06-18
作者简介：包怡红(1970-)，女，副教授，博士，研究方向为食品微生物和畜产品加工。
山核桃蛋白多肽的制备及对
羟自由基的清除作用
包怡红，盛和静
(东北林业大学食品科学与工程系，黑龙江 哈尔滨 150040)
摘 要： 实验确定山核桃蛋白水解最适宜的酶制剂为风味蛋白酶。蛋白酶最适作用条件为：底物浓度为10%，水
解时间为2h，温度为55，pH值 为6.5，酶用量为1.5%。不同水解度的蛋白多肽清除羟自由基能力不同，结果
表明水解度5%时，自由基清除率最高可达50.90%。
关键词：山核桃；蛋白多肽；自由基；清除
Research on the Technology of Peptides Derived from Walnut Protein and
Its Effects on Scavenging of Hydroxyl radicals
BAO Yi-hong，SHENG He-jing
(College of Food Science and Engineering,Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)
Abstract ：The enzyme in this experiment is flavor-enzyme. The best hydrolysis condition was get from the orthogonal
experiment. Temperature is 40℃， H is 6.5, dose of enzyme is 1.5%, hydrolysis time is 2 h, DH is 18.14%. The different DH
of walnuts peptides has different ability to scavenge hydroxyl radicals. The results showed that when DH is 5% the scavenging
activity is 50.90%.
Key words：walnuts；peptides；hydroxyl radicals； scavenging
中图分类号：TS201.21 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2005)09-0515-04
山核桃(Juglans nwndshurica Maxim)，既是速生的
珍贵的三大硬阔树种之一，又是重要的木本粮油树种之
一，分布较广我省山核桃主要分布于完达山、小兴安
岭南坡和张广才岭森林生态区.目前有自然林近8万多公
顶，人工林0.12万公顷，按初步估算可年产果核近1.6
万吨，合果仁0.32万吨，占世界产量的10%。作为林
业副产品，很有开发利用价值。但目前理想的山核桃
保健食品在市场上并不多见，在产地人们除传统的炒
吃、制罐头、做月饼馅、核桃粉，核桃乳核桃油外，
其他用途的开发尚属空白。特别是深加工产品较少。为
充分利用我国的核桃资源并提高它的经济价值，对其进
行深加工研究显得尤为重要[1]。
本实验即以核桃仁为原料，经蛋白质提取、酶
解、分离等过程制备有生物活性的核桃蛋白多肽，并
对其羟自由基的能力进行了初步研究，为进一步的工业
化生产奠定了理论和实践基础。
1 材料与方法
1.1实验材料
山核桃仁 市售；风味蛋白酶 诺和诺德；胰蛋白
酶 江苏无锡酶制剂厂；碱性蛋白酶 上海生物研究所；
木瓜蛋白酶 上海生物研究所；盐酸、茚三酮、脱氧
核糖等。
1.2主要仪器
恒温水浴锅、增力电动搅拌器、恒温磁力搅拌
器、高速离心机、可见分光光度仪、半微量凯氏定氮
仪 。
1.3实验方法
1.3.1工艺流程
山核桃仁精选→脱脂→粉碎过筛→溶解→酶解→灭
酶→成品。
1.3.2最适作用酶的选择
2005, Vol. 26, No. 9 食品科学 ※营养卫生516
1.3.6清除羟自由基的方法[5][7]
采用脱氧核糖法，取0.2m1的FeSO2一EDTA混合
液(l0mmol/L)于试管中，加入0.5m1的脱氧核糖溶液，然
后加适量山核桃蛋白水解物，用磷酸缓冲液(pH7.4)定容
至1.8m1，再加入0.2m1H2O2 (l0mmol/L)，混合后置于37℃
恒温水浴中反应1h，然后加入2.8% (W/W)三氯乙酸
(TCA)溶液1.0m1，1.0 % (W/W)硫代巴比妥酸(TBA)溶液
1.00ml混匀，置沸水浴反应15min，冷却后用721一分
光光度计在波长 532nm处测吸光度，清除能力为：
SA%=[1—(As - Ao)/(Ac - A0)]*100
Ac：不加清除剂时吸光度
As：加入样品测得的吸光度
Ao：试剂空白吸光度
2 结果与讨论
2.1最适酶的确定
各种蛋白酶水解山核桃蛋白的能力都各不相同，根
据文献记载及各种酶的酶学特性，在各种酶的最适作用
条件下，水解山核桃蛋白，水解时间为2h。各种酶作
用于山核桃蛋白的水解度如图1。
从图1中我们可以看出风味蛋白酶的水解度最高，
即风味蛋白酶水解山核桃蛋白能力最强。因此，确定
风味蛋白酶为山核桃蛋白最适水解酶。
蛋白酶的种类很多，不同的酶对底物的专一性、
键的专一性，立体结构的专一性都有所不同。因此，
通过试验比较研究，确定山核桃蛋白肽的最适作用蛋白
水解酶。
酶种类 碱 性 木 瓜 胰蛋 风 味
蛋白酶 蛋白酶 白酶 蛋白酶
pH 10.5 8.0 6.5 7.0
温度℃ 55 40 50 50
表 1 各种酶的最适作用条件[2,3]
Table 1 The optimum hydrolysis condition of enzymes
1.3.3水解度的测定方法[4][8,9] 采用茚三酮方法。
1.3.4蛋白质含量的测定方法 凯氏定氮法。
1.3.5酶解条件优化因素水平表
蛋白酶水解正交实验三因素三水平表L9(33)，各因
素和水平的选取见表2。
水平 温度℃ pH [E/S]
1 45 6.5 0.5
2 50 7.0 1.0
3 55 8.0 1.5
表 2 正交试验因素水平表
Table 2 Orthogonal experiment factor lever table
2.2酶解工艺的确定
2.2.1酶解底物浓度的确定
pH值7.0～7.2，温度50℃，酶用量为1%的条件
下，反应60min，底物浓度分别为5%、10%、15%和
20%，测定不同底物浓度下的山核桃蛋白的水解度，绘
制酶解反应曲线，结果见图2。
图2 不同底物浓度的水解度
Fig. 2 The DH of different [s]
D
H
%
7
6
5
4
3
2
1
0
5 10 15 20
底物浓度(%)
如图2所示，当底物浓度在5%～10%之间时，水
解度增长较快，水解度与底物浓度呈线性关系；在
10%～15%之间，水解度不再随底物浓度的增加按比例
升高；当底物浓度15%～20%时，水解度变化趋于平
缓；因此确定最适底物浓度为10%。
2.2.2 风味蛋白酶水解山核桃蛋白最适条件的确定
在定性实验的基础上，以10%的山核桃为底物，水
解2h。以温度、pH值、酶与底物浓度比为因素，以
水解度为指标，进行三因素三水平L9(33)正交试验，结
果见表3。
由表3和图3可知，风味蛋白酶最适作用条件为
A3、B1、C3。即温度为55℃，pH值为6.5，酶与底
物浓度比[E/S]为1.5%。R值的大小反映各因素对水解度
影响的程度，数值分析表明各因素对水解度的影响顺序
为：pH值→酶与底物浓度→温度。
2.2.3酶解反应时间的确定
以风味蛋白酶最佳作用条件为反应条件，即：pH
值6.5，温度55℃，底物浓度10%，[E/S]1.5%进行反
应，测定在不同的水解时间下核桃蛋白的水解度，绘
制不同时间的酶解反应曲线，结果见图4。
图1 四种蛋白酶水解效果的比较
Fig. 1 The DH of four enzymes
A:胰蛋白酶
B:木瓜蛋白酶
C:碱性蛋白酶
D:风味蛋白酶
D
H
%
10
8
6
4
2
0
1 2 3 4 5 6 7 8
A B C D
517※营养卫生 食品科学 2005, Vol. 26, No. 9
试验号 因素与水平 水解度(%)
温度 pH [E/S]
1 1 1 1 8.37
2 1 2 2 2.74
3 1 3 3 5.02
4 2 1 3 11.26
5 2 2 1 4.19
6 2 3 2 2.70
7 3 1 2 10.29
8 3 2 3 3.68
9 3 3 1 4.80
K1 16.1329.9214.75
K2 18.1510.6118.80
K3 18.7712.5219.50
k1 5.38 9.97 4.92
k2 6.05 3.54 6.27
k3 6.26 4.17 6.50
R 2.6419.314.75
表 3 蛋白质水解正交实验方案及结果
Table 3 Orthogonal experiment scheme and result of proteolysis
由图4可知，当反应时间小于60min时，水解度
增长较快，呈线性关系；反应时间在60～120min之间，
水解度增长趋于缓慢，120min以后，水解度基本保持
不变，因此水解时间定为120min。
2.3山核桃肽体外抗氧化效果的测定
2.3.1清除·OH的机理 [6]
Fe2+一EDTA+H2O2-→Fe3+一EDTA+OH- +·OH
·OH十脱氧核糖→氧化产物(如丙二醛等)
氧化产物十TBA→有色化合物
H2O2与Fe2+混合发生Fenton反应，生成具有很高
反应活性的·OH。其能与脱氧核糖，TBA发生反应，
并生成有色物质。但若加入具有清除作用的物质。便
会与脱氧核糖竞争，从而使有色物质生成量减少[5]。
2.3.2测定清除率的结果
水解度 (%)2.7 4.8 5.028.3710.29
清除率 (%)20.3848.650.9040.7019.48
表4 水解度与清除率关系表
Table 4 The relation DH and scavenging
图5 水解度与清除率的关系
Fig. 5 The relation DH and scavenging
清
除
率
(
%）
60
50
40
30
20
10
0
2.7 4.8 5.02 8.37 10.29
水解度(%)
从图中可以看出，山核桃肽在试验水解度范围内
对·O H均有清除作用，并且随着水解度的变化，其
清除·OH的作用有所变化。当山核桃肽的水解度在3%
左右时，随着浓度的增加，清除率随水解度的增加明
显增大，当水解度超过4.8%时，清除率增加缓慢，但
水解度达到5%后，清除率随水解度的增加却呈现下降
趋势。
由于山核桃肽富含供氢体，具有提供氢质子的能
力，可使具有高度氧化性的自由基还原，从而能终止
自由基连锁反应，起到清除或抑制自由基的目的；随着
水解度的增加，游离氨基酸增加，因此可能对自由基
的清除作用不明显，其具体机理还有待研究。
3 结 论
3.1四种蛋白酶水解试验表明，风味蛋白酶作用山核
桃蛋白的水解度最大，水解效果最好。
3.2在pH值、温度、酶与底物浓度比等因素不变的
情况下，随着底物浓度的变化，水解度也不同。结果
表明：底物浓度为1 0 %时，水解度最大。
3.3以pH值、温度、酶与底物浓度比三个因素为主
要因素，以水解度为指标，进行三因素三水平的正交
实验。研究结果表明，水解山核桃蛋白质的最佳水解
条件为pH6.5，温度55℃，酶与底物浓度比1.5%。各
因素对水解度的影响顺序为pH→[E/S]→温度。
3.4在最佳酶解条件下，进行水解反应时间的实验，
实验结果表明水解时间为2h时，水解度最高，可达
18.41%。
图4 水解度与水解时间的关系
Fig. 4 The relation of DH and time
D
H
(
%
)
时间(min)
20
15
10
5
0
0 60 90 120 150
图3 因素与指标的关系
Fig. 3 The relation of factor and index
A1 A2 A3 B1 2 B3 C1 C2 3
D
H
(
%
)
12
10
8
6
4
2
0
2005, Vol. 26, No. 9 食品科学 ※营养卫生518
脂, 1997, (6).
[4]赵新淮, 冯志彪. 蛋白质水解物水解度的测定[J]. 食品科
学, 1994, (11).
[5]荣建华, 李小定, 谢笔钧. 大豆肽体外抗氧化效果的研究
[J]. 食品科学,2002, (11).
[6]王海宽, 赵新淮, 姜岩. 甘草有效成分分离及其对自由基
的清除能力[J]. 食品与机械, 2000, (4).
[7]Adler-Nissen J Agric.food Chem. 1979, (27).
[8]Enzymic hydrolysis of food proteins Adler-Nissen[J]. J
Elsevier Applied Science London, 1986.
[9]Hydrolysis of Soy protein[P]. Adler-Nissen J U S Patent 4,
100,024.
3.5不同水解度的水解液对自由基的清除率不同，水
解度为5.0%时，对自由基的清除率最大，可达50.9%；
水解度5%以上时，随着水解度的增加，清除率呈下降
趋势。
参考文献：
[1]孙向军, 晓敏, 黄奕怡. 山核桃营养乳加工工艺研究[J].上
海交通大学学报, 2002,(2).
[2]白虹, 刘德富, 张宝华. 蛋白酶水解法在蚕蛹蛋白食品加
工中的应用[J].食品科学, 1994.
[3]刘大川, 钟方旭. 酶水解法制备大豆肽的研究[J]. 中国油
收稿日期：2005-07-28
作者简介：王晓(1971-)，男，副研究员，博士，研究方向为天然产物的分离与纯化。
腊梅花提取物抗氧化作用研究
王 晓，李福伟，耿岩玲，孙庆雷，时新刚
(山东省科学院分析测试中心，山东 济南 250014)
摘 要： 利用比色法、化学发光法，研究了腊梅花提取物体在体外对Ｏ2·, ·OH，DPPH·活性氧自由基的
清除作用。实验结果表明腊梅花提取物对Ｏ2·, ·OH, DPPH·自由基均有明显的清除作用, 其50 %抑制浓度
(IC50 )分别为 147.25，47.71，25.90μg/ml。
关键词：腊梅花；黄酮；活性氧；抗氧化作用　
Antioxidant Effects of Chimonanthus praecox Flower Extract
WANG Xiao，LI Fu-wei，GENG Yan-ling，SUN Qing-lei，SHI Xin-gang
(Analysis and Test Center, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China)
Abstract ：The effects of the extract of Chimonanthus praecox flower on removal of active oxygen species in some modified
chemical systems were investigated by chemiluminescence and spectrophotometry. The results showed that the extract could
efficiently remove O2·OH, DPPH· and the 50% inhibition concentration (IC50) were 147.25, 47. 1, 25.90μg/ml,
respectively.
Key words： Chimonanthus praecox；flavonoid； ctive oxygen；antioxidant effect
中图分类号：S685.99 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2005)09-0518-03
腊梅花系腊梅科植物腊梅(Chimonanthus praecox)的
花蕾,为苏南民间用来治疗感冒咳嗽的有效良方，民间
《花疗歌》中曾有“腊梅止咳又化痰”的记载。《贵
阳民间药草》中称腊梅花作茶饮治久咳[1]。其性温味
甘，微苦，无毒。具解暑生津，开胃散郁止咳之功
效[2]。刘丽等报道腊梅花具有改善机体免疫功能的作
用。Tsukasa的研究表明，腊梅花中含有矢车菊-3-O-
葡萄糖苷等花色苷以及芦丁、槲皮素等黄酮类化合物
[4]。但对腊梅花提取物的抗氧化性的研究尚未见报道，
本研究采用比色法和化学发光法研究腊梅花提取物清除
活性氧(Ｏ2·，·OH，DPPH·)的作用，旨在为腊梅
花的深入研究与开发应用提供科学依据。