全 文 ：三叉苦叶提取物的抑菌活性研究
廖建良， 揭育霞
（惠州学院生命科学系/生物技术研究所，广东 惠州 516007）
摘 要：以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、青霉、黑曲霉为供试菌种，采用滤纸扩散法、平板稀释法，对三叉苦叶提
取液的抑菌活性进行研究。结果表明，三叉苦叶提取液对细菌具有较强抑制作用，对两种真菌无抑菌作用；对细菌的最低抑制浓度
（MIC）范围在 0.125~0.5 g/mL 之间；三叉苦叶提取液的抗菌活性具有热稳定性，并且在 pH 值 3.5~9 范围内均有抗菌活性，碱性条
件下抑菌作用相对较强。
关键词：三叉苦叶提取液；抑菌活性；最低抑菌浓度
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1004-874X（2012）19-0090-03
Study on antimicrobial activities of the extract
from Evodia lepta leaves
LIAO Jian-liang, JIE Yu-xia
（Department of Life Science, Huizhou University/Institute of Biotechnology, Huizhou 516015, China)
Abstract：This paper was aimed to study antimicrobial activities of the extract from Evodia lepta leaves. Using filter paper diffusion
process, dull dilution method to test antimicrobial activities of extracts from leave of Evodia lepta against Staphylococcus aureus, Bacillus
subtilis (Ehrenberg) Cohn, Pseudomonas aeruginosa, Penicillium sp., Aspergillus niger. The results showed that the extract of Evodia lepta
leaves had antimicrobial effects on bacteria,and no antimicrobial effects on two fungi. The minimal inhibitory concentrations (MIC) were
0.5 g/mL against bacteria. The antimicrobial activities of extracts from Evodia lepta leaves was characterized by its heat stability. The
antimicrobial activities pH tolerance ranged from 3.5 to 9, in the basic condition antimicrobial effects were better than in the acid or
neutral condition.
Key words：extract of Evodia lepta leaves；antimicrobial activities；minimum inhibitory concentration
我国的中草药资源十分丰富， 具有抗菌性的中草药
品种繁多，抑菌性能各异 [1]。 近年来，随着人们对环保、健
康认识的不断深入， 人们开始关注天然中草药提取物在
水果保鲜和防腐方面的应用 [2-5]。 过去人们采用的化学防
腐保鲜剂主要是各种有机酸及其盐类， 如国内肉类保鲜
中研究和使用最多的是乳酸钠、 山梨酸钾、 双乙酸钠等，
国外关于化学防腐保鲜剂的应用研究也主要集中在山梨
酸钾、 乳酸钠、 丙酸钙及磷酸盐等方面，但人们在使用过
程中发现不少化学防腐剂对人体健康有一定的影响[6]。 我
国野生植物资源丰富、分布广泛，从植物中提取天然防腐
剂有很好的基础条件及广阔的应用前景。
三叉苦〔Evodia lepta（Spreng.）Merr.〕是芸香科吴茱萸
属植物，是岭南常用中草药，始载于《岭南采药录》，又名
三桠苦、小黄散、鸡骨树、三丫苦、三支枪、三叉虎等，药用
根、茎或叶，分布于我国海南、广东、广西、福建、台湾、云
南等省区，《中国药典》1977 年版曾收载 [7-8]。 三叉苦性味
苦、寒，具有清热解毒、祛风除湿的功效，三叉苦叶主治咽
喉肿痛、疟疾、黄疸型肝炎、风湿骨痛、湿疹、皮炎、疮疡
等[8]。 但对于三叉苦叶提取物抗菌作用的研究迄今鲜见报
道。 因为细菌、霉菌、酵母菌等微生物的侵袭是造成食品
腐败变质的重要因素 [9]，为此我们研究三叉苦叶的乙醇提
取物对常见菌种金黄葡萄球菌、 绿脓杆菌、 枯草芽孢杆
菌、青霉菌、黑曲霉等 5种供试菌的抑制作用，旨在阐明其
抗菌特性。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 三叉苦叶 三叉苦叶在广东惠州学院校园内采摘。
洗净，晾干，粉碎成粉末，备用。
1.1.2 供 试 菌 种 金 黄 色 葡 萄 球 菌 Staphylococcus
aureus、绿脓杆菌 Pseudomonas aeruginosa、枯草芽孢杆菌
Bacillus subtilis （Ehrenberg）Cohn、青霉菌 Penicillium sp.、
黑曲霉 Aspergillus niger 均由惠州学院微生物实验室提
供。
1.1.3 主要仪器 Fz102 微型植物粉碎机（天津市泰斯特
仪器有限公司）；RE-52AA 旋转蒸发器水浴槽 （上海青浦
泸西仪器）；DRP-9052 型电热恒温培养箱（上海森信实验
仪器有限公司）；YX280A（S）手提式高压蒸汽灭菌锅（北京
维欣仪奥科技发展有限公司）；PC-1000 数显式电热恒温
水浴锅 （上海跃进医疗器械厂）；HD-650-U 超净工作台
（苏州安泰空气技术有限公司）；PHS-3C 精密级数字式酸
度计（上海弘毅仪器仪表有限公司）
1.1.4 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基（细菌培养基）：牛肉
膏 3 g、 蛋白胨 10 g、NaCl 5 g、 琼脂 15 g， 加水至 1 000
mL，搅拌煮沸，调节 pH 值至 7.3（±0.2），于 121℃灭菌 15
min。
马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）：马铃薯 300 g、葡萄糖 20 g、琼
收稿日期：2012-06-25
作者简介：廖建良（1965-），男，硕士，教授，E-mail：liaojl@hzu.
edu.cn
广东农业科学 2012 年第 19 期90
C M Y K
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2012.19.037
无菌蒸馏水
6.0
6.0
6.0
6.0
6.0
三叉苦叶提取液
8.0
8.7
8.2
6.0
6.0
供试菌种
金黄色葡萄杆菌
绿脓杆菌
枯草芽孢杆菌
青霉菌
黑曲霉
表 1 三叉苦叶提取液的抑菌效果（24 h）
抑菌圈直径（mm）
无菌蒸馏水
+++
+++
+++
+++
+++
0.125
+++
+++
+++
+++
+++
0.25
+++
++
++
+++
+++
0.5
++
+
+
+++
+++
1
-
-
-
+++
+++
供试菌种
金黄色葡萄杆菌
绿脓杆菌
枯草芽孢杆菌
青霉菌
黑曲霉
表 2 三叉苦叶提取液的 MIC
提取物浓度（g/mL）
注：“-”表示无菌生长；“+”表示少数菌落生长；“++”表示稍多
菌落生长；“+++”表示菌落生长良好。
80℃
8.5
8.6
8.4
6.0
6.0
60℃
8.2
8.0
8.0
6.0
6.0
40℃
8.0
8.7
8.2
6.0
6.0
供试菌种
金黄色葡萄球菌
绿脓杆菌
枯草芽孢杆菌
青霉菌
黑曲霉
表 3 不同热处理对三叉苦叶提取液抑菌效果的影响
抑菌圈直径（mm）
脂 15 g、氯霉素 0.1 g，取样本 40.1 g，加水至 1 000 mL，调
节 pH值至 6.0 （±0.2），121℃灭菌 20 min。 用于真菌的培
养。
1.2 试验方法
1.2.1 三叉苦叶乙醇提取物的制备 称取干燥粉碎的新
鲜野生三叉苦叶 50 g，倒入适量的 95%乙醇，在 40℃下浸
泡提取 24 h，过滤，定容至 100 mL。将以上浸取液抽滤，滤
液用旋转蒸发器在 70℃以下减压浓缩至无乙醇馏出为
止，再保持 0.5 h。 放置冰箱 4℃以下保存备用。
1.2.2 菌悬液的制备 从实验室中获取菌种接种到斜面
培养基中，细菌置 37℃恒温培养箱培养 24 h，霉菌置 28℃
培养 48 h，备用。 在无菌操作台用接种环挑取少许已活化
的菌种菌体于装有 9 mL 无菌生理盐水的试管中，充分摇
匀，制成菌悬液，备用。
1.2.3 三叉苦叶提取液抑菌效果的测定 采用滤纸片扩
散法[10]。 滤纸用打孔器打成 6.00 mm 圆片，放入洁净的试
管内，经 0.1 MPa、121℃灭菌 20 min。用无菌镊子取灭菌后
的滤纸片，浸泡在足够量的提取液中 15 min，备用。 选用
直径为 7 cm 的培养皿，每皿加 10 mL 培养基，凝固后，移
取各菌种悬液 50 μL 分别加入各平板表面， 并用三角涂
菌棒均匀涂开菌种，等待平板干燥后，用无菌镊子取浸泡
于提取液中的滤纸片，轻轻平放于平板表面，每皿 3片，每
菌做 3次重复。 以无菌蒸馏水作为对照，将细菌置 37℃培
养 24 h，霉菌置 28℃培养 48 h。 取出后测量抑菌圈大小，
比较其抑菌效果。抑菌圈直径大于 8 mm为有明显抑菌效
果，小于 6 mm 为没有抑菌效果，抑菌圈在 6～8 mm 之间
为有一定的抑菌作用。
1.2.4 三叉苦叶提取液抑菌效力的测定 采用平板稀释
法 [10]。 将各提取液用无菌蒸馏水进行稀释（V/V），制成 1、
0.5、0.25、0.125 g/mL的系列浓度。 用微量可调移液器吸取
各稀释液 1 mL，分别加入到无菌培养皿中，与倾入的 10
mL 培养基充分混匀，静置凝固后支撑含样品平板，做好
记号。以无菌蒸馏水作为对照。每系列接种 1种菌种，细菌
置 37℃培养 24 h，霉菌置 28℃培养 48 h，观察各菌生长情
况 ， 以完全没有菌生长的最低浓度为最低抑制浓度
（MIC）。 提取液的 MIC越低，其抑菌效力就强。
1.2.5 三叉苦叶提取液热稳定性测定 采用滤纸片扩散
法 [10]。用无菌镊子取灭菌后的滤纸片，浸泡在足够量提取
液中，分别在 40、60、80℃中水浴处理 15 min。 选用直径
为 7 cm 的培养皿，每皿加 10 mL 培养基，凝固后，移取
菌悬液 50 μL 分别加入各平板， 用三角涂菌棒均匀干燥
后，用无菌镊子夹取滤纸片，沥干，贴在含菌平板上，每皿
3 片，每种提取液做 3 次重复，将细菌置 37℃培养 24 h，
霉菌置 28℃培养 48 h，取出后测量抑菌圈大小，比较其
抑菌效果。
1.2.6 pH 值对三叉苦叶提取液抑菌效果的影响 用
HCl 或 NaOH 溶液调节提取液的 pH 值， 考察提取液原
液，pH 值为 5、7、9 时的抑菌效果，按照 1.2.3 方法进行抑
菌试验。 每种提取液的不同 pH值重复 3次，比较抑菌效
果。
2 结果与分析
2.1 三叉苦叶提取液的抑菌效果
由表 1 可知，24 h 后，三叉苦叶提取液对金黄色葡萄
球菌、 绿脓杆菌和枯草芽孢菌的抑菌圈平均直径分别为
8.0、8.7、8.2 mm，对照组均无抑菌圈出现；三叉苦叶提取液
作用于青霉菌和黑曲霉均无抑菌圈出现。 由此可知，三叉
苦叶提取液对金黄色葡萄球菌、 绿脓杆菌和枯草芽孢菌
有一定的抑菌作用，对青霉菌和黑曲霉无抑制效果。
2.2 三叉苦叶提取液的MIC
由表 2可知，三叉苦叶提取液对几种细菌有很好的抑
菌作用， 其中对绿脓杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌作用很
强，其 MIC 均为 1 g/mL，对金黄色葡萄杆菌的抑菌作用稍
弱。 三叉苦叶提取物对两种真菌（青霉菌及黑曲霉）均无
抑菌作用，对这种差异的原因有待进一步研究。
2.3 三叉苦叶提取液的热稳定性
由表 3可知，不同热处理条件对三叉苦叶提取物的抗
菌活性有不同程度的影响，随着温度的升高，三叉苦叶提
取物的抑菌活性随之增加， 说明提高温度有助于抑菌活
性物质的溶出。 高温处理后，抑菌直径仍大于 8 mm，说明
三叉苦叶提取物的抑菌能力具有良好的热稳定性。 三叉
苦叶提取液不同热处理条件对青霉菌和黑曲霉没有抑菌
效果。
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降仍有待进一步试验验证； 复配剂 20%烯肟·戊唑醇悬浮剂
的预防及治疗效果均较差，与兰杰等[13]报道的在 100 g/hm2剂
量下的防效相当于对照药剂 75%三环唑可湿性粉剂在 200
g/hm2剂量下的防效不一致，有待下一步继续试验验证。
20%稻瘟酰胺悬浮剂对稻瘟病的预防效果较好，但其
治疗效果较差，生产上使用时注意在病前施药为宜。
新型药剂吡唑醚菌酯和咪鲜胺锰盐对稻瘟病菌作用
机制有别于常用药剂三环唑和稻瘟灵， 这类新药可作为
三环唑和稻瘟灵的轮换药剂， 这些药剂在稻瘟病防治上
可交替使用。 另外，由于一些药剂在生产上长期使用，部
分地区的稻瘟病菌对部分药剂已产生抗药性 [3-12]，建议各
地因地制宜， 制订合理轮换用药规则， 指导农民科学用
药，这对延缓新型药剂抗药性产生具有非常重要的意义。
本药效试验采用苗期人工接种试验方法， 一方面一
次试验可测试较多药剂， 另一方面可比较准确地评价药
剂的预防作用和治疗作用效果， 这对药剂的合理应用具
有重要的参考价值。
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病田间试验[J].农药，2010，49（11）：842-843.
pH9
10.8
11.1
11.0
6.0
6.0
pH7
9.3
10.4
9.9
6.0
6.0
pH5
8.9
10.1
8.9
6.0
6.0
原液（pH3.5）
8.3
9.8
8.8
6.0
6.0
供试菌种
金黄色葡萄球菌
绿脓杆菌
枯草芽孢杆菌
青霉菌
黑曲霉
表 4 pH 值对三叉苦叶提取液的抑菌效果
抑菌圈直径（mm）
2.4 pH值对三叉苦叶提取液抑菌作用的影响
由表 4 可知，pH 值对三叉苦叶提取液的抑菌效果有
一定的影响。 酸性或中性条件对细菌的抑菌效果良好，碱
性条件下抑菌效果最好。 不同 pH 值三叉苦叶提取液对青
霉菌和黑曲霉没有抑菌效果。
3 结论与讨论
本试验结果表明，三叉苦叶乙醇提取物对食品中常见
的污染菌具有广谱、高效的抗菌活性，且随着其浓度的增
加而增强。 不同的菌种对三叉苦叶提取液的敏感性不同，
其中枯草杆菌和绿脓杆菌菌对其最为敏感， 而青霉菌和
黑曲霉对其最不敏感。 三叉苦叶乙醇提取物的抗菌活性
不受高温热处理的影响，使它可以与食品热处理并用，提
高加工食品的保存性。 三叉苦叶乙醇提取物可在较大的
pH 值范围内使用，在偏碱性条件下抗菌效果更好。这作为
食品防腐剂是一个很大的优点，目前应用的防腐剂（如苯
甲酸）只有在酸性条件下有效，而在中性乃至偏碱性的食
品中使用效果明显下降。 三叉苦叶提取物的开发利用，可
拓宽防腐剂使用的食品 pH 值范围。
三叉苦叶乙醇提取物广谱、高效的抗菌活性可有效地
防止微生物引起的食物中毒，同时可起到防止食品腐败、
延长食品保质期等作用。 因此，三叉苦叶乙醇提取物可用
作食品天然防腐剂， 从而使三叉苦的开发利用具有更广
阔的前景。 本试验也表明，三叉苦叶提取液对 5种供试菌
种都有着不同程度的抑制作用，但对真菌无抑菌作用，这
可能与提取液所含的活性成分的含量及种类有关。 因此，
有必要对三叉苦叶提取物化学成分、 抗菌机理和抑菌活
性成分等方面作进一步的研究。
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