全 文 ：果树种质福州龙眼圃 3年来的鉴定评价结果表明 ,
在目前国内外有商品价值的晚熟龙眼品种中 , 晚`
香 是果实成熟期表现最晚的龙眼新品种 。
图 1　晚香与立冬本龙眼果实成熟过程中可溶
性固形物含量的变化 (2007-2008, 福州)
2.3 　投产早 , 较丰产 、 稳产
高接树接后 1 ～ 2年就能开花结果 , 接后 3年
株产可达 10 kg以上。丰产性能较好 。如在 2008
年福州地区龙眼 “小年 ”、绝大多数龙眼品种不结
果或结果很少的情况下 , 晚香龙眼新品种高接幼
树均开花结果 , 且表现出较好的结果性能 。抽穗
期不易发生 “冲梢” , 抽穗率高 , 大小年和隔年结
果现象不明显 。
2.4 　抗逆性强
8年来 , 该品种在福州尚未发现鬼帚病的病梢
和病穗;果蝇 、 霜疫霉病的为害程度比其他品种
轻 , 可能和它的成熟期较晚和果皮较粗糙有关。
收稿日期:2008-09-28
基金项目:国家自然科学基金 (30771484)、 广东省自然科学基金 (07010103)和广东省科技攻关计划 (2007A020200006)
作者简介:王耀辉 (1982-), 男 , 在读硕士生, 从事园艺作物遗传育种研究
＊为通讯作者
木菠萝 ISSR反应体系的建立和优化
王耀辉 　叶春海＊　李映志 　丰　锋
(广东海洋大学农学院 , 广东湛江　 524008)
摘　要　以木菠萝为材料 , 研究了模板 DNA、 TaqDNA聚合酶 、 引物 、 Mg2+及 dNTPs浓度对 ISSR-PCR扩增
结果的影响 , 得出木菠萝 ISSR的较佳反应体系为:在 20μl反应体系中 DNA模板 1.6 ng· μl-1 , TaqDNA聚
合酶 1.25 U· (20μl)-1 , 引物 0.24μmol· L-1 , dNTPs0.2mmol· L-1 , Mg2+ 2 mmol· L-1 , 10×PCR缓冲液
2.0μl。
关键词　木菠萝;ISSR;优化
EstablishmentandOptimizationofanISSRReactionSysteminJackfruit
WANGYao-hui　 YEChun-hai＊　LIYing-zhi　FENGFeng
(ColegeofAgriculture, GuangdongOceanUniversity, Zhanjiang524088, GuangdongChina)
Abstract　JackfruitwasusedtostudytheeffectsofsomeinfluencingfactorsonISSR-PCRanalysis, suchastemplate
DNA, Taqpolymerase, primer, dNTPsandMg2+.TheoptimalISSR-PCRreactionsystemforJackfruitwasdetermined
asfolows:1.6ng· μl-1 templateDNA, 1.25 U· (20μl)-1 Taqpolymerase, 0.24μmol· L-1 primer, 0.2 mmol
· L-1 dNTPs, 2 mmol· L-1 Mg2+and2.0 μl10×buferin20 μlPCRreactionsystem.
Keywords　Jackfruit;ISSR;Optimization
　　木菠萝 (ArtocarpusheterophylusLam.)为桑 科木菠萝属 , 英文名 Jackfruit, 又称菠萝蜜 、 树菠
3
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萝等 , 是世界著名的热带水果 , 原产于印度和东
南亚[ 1] 。木菠萝果大 , 果肉肥厚柔软 、 清甜可口 、
香气浓郁 , 被誉为热带水果皇后 [ 2] 。木菠萝引入
我国已有近千年的历史 , 现主要栽培在华南的海
南 、云南 、 台湾 、广东等地[ 3-4] 。但由于品种间树
体形态差异较小 , 用常规方法难以鉴别 , 特别是在
苗期对不同品种的鉴定尤为困难 。现主要根据其
果实性状进行分类 , 我国将木菠萝分为干苞和湿
苞 2种类型 。国外的分类方法与我国类似 , 基本
上也分为 2类:软肉型 (Softflesh, softjackfruits)
和脆肉型 (Firmflesh, hardjackfruits)[ 5] 。叶春海
等根据果肉水分含量的不同 , 将中国湛江地区的
木菠萝优株类型分为湿脆型 、 少胶型 、 高糖型 、
平滑型 [ 6] 。分子标记技术具有遗传稳定 、 多态性
高 、不受环境条件影响等优点 , 已成为植物分类
与鉴定的重要手段 。利用分子标记对木菠萝种质
资源进行分析 , 国内外已有相关报道[ 7-11] , 但主
要是运用 AFLP和 RAPD标记 , 而利用 ISSR标记
的研究尚未见报道。
ISSR(简单重复序列区间扩增多态 DNA)是
建立在 PCR反应基础上的一种分子标记技术 , 由
Zietkiewicz[ 12]等于 1994年发明 。它结合了 SSR和
RAPD的优点 , 具有 RAPD的操作简单 、 所需
DNA量少 、 无需预知研究对象的基因组序列等优
点 , 并具有 SSR的稳定性 。但 ISSR-PCR扩增反
应的最适条件需经摸索才能达到较好效果 [ 13] 。本
试验对木菠萝 ISSR-PCR反应体系进行优化 , 希
望为今后利用 ISSR分子标记技术开展木菠萝遗传
多样性分析和构建遗传图谱等研究奠定基础。
1　材料与方法
1.1　材料
试材为分布于雷州半岛的 22份木菠萝单株 ,
编号为 1 ～ 22, 取其叶片低温保存。试剂 Mg2+、
dNTPs、 TaqDNA聚合酶等购自北京鼎国生物技术
有限责任公司 。ISSR引物序列来自加拿大的 Uni-
versityofBritishColumbia[ 13] , 由上海生工生物工程
技术服务有限公司合成。
1.2　基因组 DNA的提取和质量检测
参照叶春海等 [ 14]的改良 CTAB法提取木菠萝
基因组 DNA。DNA质量的检测:①取 15 μlDNA
提取液稀释至 3ml, 在紫外可见分光光度计 (UV
-2802, 上海美达仪器有限公司 )上测定 A260 、
A280和 A230值;②取 DNA提取液 4 μl在 1×TBE、
质量分数 1.0%的琼脂糖凝胶上以电压 2 V· cm-1
进行电泳检测。根据 A260值把 DNA提取液稀释为
25ng· μl-1 , 然后用稀释好的基因组 DNA进行优
化试验。
1.3 　引物筛选
参照其他果树 ISSR反应的条件 [ 15-19] , 以 22
号材料的 DNA为模板 , 利用下面的体系和程序进
行引物的初选:ISSR-PCR反应体积为 20μl, 10
×PCR缓冲液 2.0μl, 模板 DNA15ng, Mg2+ 2.5
mmol· L-1 , TaqDNA聚合酶 1.0U· (20μl)-1 ,
引物 0.2 μmol· L-1 , dNTPs0.2 mmol· L-1 , 不
足体积用无菌超纯水补足。 PCR扩增反应程序是:
94℃预变性 4 min;94℃变性 1 min, 52℃退火
50s, 72℃延伸 1 min, 35个循环;72℃延伸 10
min。 PCR扩增产物用 5%非变性聚丙烯酰胺凝胶
电泳检测 , 2%硝酸银染色[ 20]拍照分析。
1.4 　 ISSR反应体系的优化
利用初步筛选出的引物 (AC)8 YG, 逐一变化
ISSR反应体系中的主要组分浓度进行 PCR扩增。
试验采用单因素设计 , 分 5步进行 , 组分浓度先
确定前面再确定下一组分。每步确定一个组分的
浓度 , 先后顺序如下。
DNA模板浓度的确定　模板 DNA浓度的变化
值见表 1, Mg2 + 2.5mmol·L-1 , TaqDNA聚合酶
1.0 U· (20μl)-1 , 引物 0.2 μmol· L-1 , dNTPs
0.2 mmol·L-1 , 10×PCR缓冲液 2.0μl。
TaqDNA聚合酶浓度的确定 　 TaqDNA聚合
酶的变化值见表 1 , 模板 DNA浓度为前面确定的
值 , Mg2+ 2.5 mmol· L-1 , 引物 0.2 μmol· L-1 ,
dNTPs0.2mmol·L-1 , 10×PCR缓冲液 2.0 μl。
引物浓度的确定　引物浓度的变化值见表 1 ,
模板 DNA和 TaqDNA聚合酶浓度为前面确定的
值 , Mg2+ 2.5 mmol· L-1 , dNTPs0.2 mmol· L-1 ,
10×PCR缓冲液 2.0 μl。
dNTPs浓度的确定 　dNTPs浓度的变化值见
表 1 , 模板 DNA、 TaqDNA聚合酶和引物浓度为
前面确定的值 , Mg2+ 2.5mmol·L-1 , 10×PCR缓
冲液 2.0μl。
Mg2+浓度的确定 　 Mg2 +浓度的变化值见表 1
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, 模板 DNA、 TaqDNA聚合酶 、 引物和 dNTPs浓
度为前面确定的值 , 10×PCR缓冲液 2.0 μl。
各处理体系体积均为 20 μl。各优化处理重复
扩增 2次。扩增程序和检测分析方法同引物筛选。
表 1　 优化木菠萝 ISSR反应体系时各组分的浓度
组分 浓度
DNA模板 (ng· μL-1) 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.4 2.8
TaqDNA聚合酶 (U· (20 μl)-1) 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75
引物 (μmol· L-1) 0.12 0.16 0.20 0.24 0.28
dNTPs(mmol· L-1) 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30
Mg2+ (mmol· L-1) 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50
1.5　最适反应体系的稳定性检测
以初选出的引物 (AC)8 YG进行体系的稳定
性检测 。首先在确定的最优反应体系中 , 以 22号
木菠萝单株的 DNA模板确定引物的退火温度 , 根
据引物的 Tm值设计 6个退火温度:50℃、 52℃、
54℃、 56℃、 58℃、 60℃;再在合适的退火温度下
以所收集的 22份木菠萝 DNA模板检测最适反应
体系的稳定性。
2　结果与分析
2.1　 DNA模板浓度对 ISSR反应的影响
DNA模板浓度对 ISSR反应的影响见图 1 。在
0.4 ～ 2.8 ng· μl-1范围内均可扩增出条带 , 但各
浓度下的扩增条带数和亮度不一样 。从图 1可见 ,
DNA模板浓度为 1.6 ng· μl-1时扩增效果较好 ,
条带较多 , 扩增稳定 , 可分辨条带数为 15条 , 且
比较清晰。
图 1　模板 DNA浓度对扩增结果的影响
注:M为 Marker; 1～ 7为模板 DNA浓度 (ng· μl-1), 分别
是 0.4、 0.8、 1.2、 1.6、 2.0、 2.4、 2.8。图中两个相同数字表示
两次重复 (以下同)。
2.2 　TaqDNA聚合酶浓度对 ISSR反应的影响
TaqDNA聚合酶浓度对 ISSR反应的影响见图
2 。在 0.75 ～ 1.25 U· (20 μl)-1范围内 , 随着
TaqDNA聚合酶浓度的增加 , 扩增条带数明显增
加 , 且更清晰 , 而 TaqDNA聚合酶浓度为 1.25 ～
1.75 U· (20 μl)-1时 , 扩增的结果变化不大。
考虑到经济上的原因 , 认为 TaqDNA聚合酶 1.25
U· (20μl)-1效果较好。
图 2　TaqDNA聚合酶浓度对扩增结果的影响
注:M为 Marker;1～ 5为TaqDNA聚合酶浓度 , 分别是 0.75、
1、 1.25、 1.5、 1.75U· (20μl)-1。
2.3 　引物浓度对 ISSR反应的影响
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引物浓度对 ISSR反应的影响见图 3 。在 0.12 ～
0.24μmol· L-1范围内 , 随着引物浓度的增加 , 扩
增条带数明显增加 , 且更清晰 , 当引物浓度达到
0.28μmol· L-1时 , 扩增的效果变差 。因此认为引
物 0.24μmol· L-1效果较好。
图 3 　引物浓度对扩增结果的影响
　　注:M为 Marker;1 ～ 5为引物浓度 (μmol· L-1), 分别是
0.12、 0.16、 0.20、 0.24、 0.28。
2.4　dNTPs浓度对 ISSR反应的影响
图 4　 dNTPs浓度对扩增结果的影响
注:M为 Marker;1 ～ 5为 dNTPs浓度 (mmol· L-1), 分别是
0.10、 0.15、 0.20、 0.25、 0.30。
dNTPs浓度对 ISSR反应的影响见图 4 。在
0.10 ～ 0.30 mmol· L-1范围内 , 随着 dNTPs浓度
的增加 , 扩增条带数量和亮度出现明显差异 , 在
400 ～ 600bp范围内 , 条带数随着 dNTPs浓度的增
加而减少 , 且在前面和后面的条带逐渐变得不清
晰 , 在 300 ～ 400bp范围内 , 前面 3个浓度的效果
变化不大 , 而浓度为 0.25 mmol· L-1时中间的条
带较弱 , 0.30 mmol· L-1时中间的条带扩增不出
来。在 200 ～ 300 bp范围内 , 0.20 mmol· L-1和
0.25 mmol· L-1的扩增效果最好 。综合考虑认为
dNTPs0.20 mmol·L-1效果较好。
2.5 　Mg2+浓度对 ISSR反应的影响
Mg2+浓度对 ISSR反应的影响见图 5 。在 2.0
～ 2.5 mmol· L-1范围内 , 随着 Mg2+浓度的增加 ,
扩增条带数出现从少到多再到少的变化 , 部分条
带亮度表现出从暗到亮再到暗的变化。因此认为
Mg2+ 2.0 mmol· L-1效果较好 。
图 5 　Mg2+浓度对扩增结果的影响
注:M为 Marker;1～ 7为 Mg2+浓度 (mmol· L-1), 分别是
1.00、 1.25、 1.50、 1.75、 2.00、 2.25、 2.50
2.6　最适反应体系的稳定性
2.6.1　引物 (AC)8YG退火温度的确定
在 DNA模板 1.6ng· μL-1 , TaqDNA聚合酶
1.25 U· (20 μl)-1、 引物 0.24 μmol· L-1 ,
dNTPs0.2mmol· L-1 , Mg2 + 2.0 mmol· L-1 , 10
×PCR缓冲液 2.0μl, 总体积为 20μl的反应体系
中 , 引物 (AC)8YG退火温度确定的结果见图 6。
6
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从图 6可见 , 在退火温度为 58℃时的扩增较果较
好 。
图 6 　退火温度对扩增结果的影响
注:1 ～ 6为退火温度 (℃), 分别是 50、 52、 54、 56、 58、 60
2.6.2　最适反应体系的稳定性检测
以引物 (AC)8YG在 58℃退火温度下 , 在较
优反应体系 (DNA模板 1.6 ng· μL-1 , TaqDNA
聚合酶 1.25U· (20 μl)-1 , 引物浓度 0.24 μmol
· L-1 , dNTPs浓度 0.2 mmol· L-1 , Mg2 + 2 mmol
· L-1 , 10×PCR缓冲液 2.0μl, 总体积 20μl)中
对 22份木菠萝种质进行 ISSR扩增 , 结果见图 7 。
从图 7可见 , 引物在 22份木菠萝种质上均能扩增
出清晰和多态性高的片段 , 表明优化确定的反应
体系适于木菠萝 ISSR反应 , 可应用于木菠萝亲缘
关系分析等研究 。
图 7 　引物 (AC)8YG对 22份木菠萝种质进行 ISSR扩增
的结果
3　小结与讨论
PCR扩增易受诸多因素的影响。模板 DNA浓
度是制约扩增产物得率及特异性的一个重要因子 ,
浓度过低 , 分子碰撞的几率低 , 偶然性大 , 扩增
产物无或不稳定;浓度过高 , 又会相应增加非特
异性产物的扩增 , 导致电泳背景加深 , 不利于读
带[ 15] 。酶的浓度过高不仅增加试验成本 , 而且容
易产生非特异性扩增产物;浓度过低则会使酶过
早消耗完 , 产物合成效率低[ 16] 。引物浓度过高会
导致引物二聚体的形成 , 且易引起碱基错配和产
生非特异性扩增;引物浓度过低 , 其与 DNA模板
结合位点少 , 扩增产量下降 , 并有可能出现弥散
现象 [ 2, 13] 。dNTPs是 PCR合成 DNA的底物 , 常用
浓度为 0.1 ～ 0.2 mmol· L-1 , 浓度过低会导致扩
增带产率低 , 而过高又会产生错误掺入 [ 17] 。Mg2+
浓度是制约 PCR结果的重要因素之一 , TaqDNA
聚合酶需 Mg2+激活 , 对其浓度非常敏感;而引物
与模板的双链杂交体的解链与退火温度受二价阳
离子的影响[ 21] 。
通过对各因子的研究 , 本试验最终确定的较
优反应体系为:20μl反应体系中 DNA模板 1.6ng
·μl-1 , TaqDNA聚合酶 1.25 U· (20μl)-1 , 引
物 0.24 μmol·L-1 , dNTPs0.2 mmol· L-1 , Mg2+
2mmol·L-1 , 10×PCR缓冲液 2.0 μl。利用本反
应体系对 22份木菠萝种质进行 ISSR分析 , 可检
测到较大的遗传多样性 , 因此将是木菠萝种质资
源评价的一个重要手段。
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冬枣维 C含量丰富 , 能防治心血管病
　　冬枣不仅味道可口 、 皮脆 、 肉质细嫩 、 汁多
无渣 、 甘甜清香 , 而且营养极丰富。冬枣含糖
20% ～ 36%;含有天门冬氨酸 、 苏氨酸 、 丝氨酸
等 19种人体所需的氨基酸 , 总含量为 0.985mg/
100g。冬枣含蛋白质 1.65%, 膳食纤维 2.3%, 总
黄酮 0.26%, 烟 酸 0.87mg/100g, 胡 萝 卜 素
1.1mg/kg, 维 生 素 B10.1mg/kg, 维 生 素 B
22.2mg/kg。
冬枣的最大特点是维生素 C含量极高 , 每 100
克果肉维生素 C含量高达 380 ～ 600毫克 (维生素
C补充剂所能提供的维生素 C一般为 60毫克),
是苹果的 70倍 , 柑橘的 16倍 , 连以往被认为富含
维生素 C的山楂也甘拜下风。
冬枣是目前 261个鲜食枣品中被公认品质最
佳的 , 它还具有良好的药用 、 保健价值。
解毒保肝　冬枣中含有丰富的糖类和维生素 C
以及环磷酸腺苷等 , 能减轻各种化学药物对肝脏
的损害 , 并能促进肝脏合成蛋白 , 增加血清白蛋
白含量 , 调整白蛋白与球蛋白比例 , 降低血清谷
丙转氨酶水平等作用。在临床上 , 大枣可用于慢
性肝炎和早期肝硬化的辅助治疗。
防治心血管病 　冬枣中含有丰富的维生素 C
和维生素 P, 含有较多的维生素 A、 维生素 E以及
钾 、 钠 、 铁 、 铜等多种微量元素 , 对于健全毛细
血管 , 维持血管壁弹性 , 抗动脉粥样硬化很有益。
冬枣中还含有芦丁成分 , 芦丁是治疗高血压病的
有效药物 。故冬枣对冠心病 、 高血压 、 动脉粥样
硬化病等的防治有很大帮助。
调节免疫　冬枣中富含的环磷酸腺苷是一种
重要的生理活性物质 , 参与人体内多种生理活动 ,
可以调节免疫系统 , 具有增强心肌收缩力 、 保护
冠状动脉 、降低胆固醇 、 抑制癌细胞增殖的作用 。
(信息来源:第一食品网)
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