全 文 ：三叶青乙酸乙酯提取物对裸鼠人肝癌细胞
HepG － 2 皮下移植瘤生长抑制作用的研究*
王明仪1 陈伟芳1 陈 宇2 魏克民2△
(1 浙江中医药大学·杭州 310053 2 浙江中医药研究院·杭州 310007)
摘 要 目的:观察三叶青乙酸乙酯提取物对裸鼠人肝癌细胞 HepG － 2 皮下移植瘤的抑制作用，并探讨
其相关作用机制。方法:采用腋下接种 HepG － 2 细胞制备小鼠荷瘤模型，观察三叶青乙酸乙酯提取物
低、中、高剂量对裸鼠肿瘤体积、瘤重、抑瘤率、脾指数的影响，生化分析仪检测生化指标 ALT、AST、BUN、
CＲE，ELISA法检测血清中细胞因子 TNF － α 、IFN － γ的含量。结果:三叶青低、中、高剂量组的抑瘤率分
别是 38. 66%、23. 53%、31. 09%;与模型组相比，三叶青各剂量组 TNF － α、IFN － γ水平升高，其中高剂量
组 IFN － γ明显高于模型组，具有统计学差异。结论:三叶青乙酸乙酯提取物具有抑制 HepG － 2 皮下移
植瘤的作用，作用机制可能与提高 IFN － γ和 TNF － α水平相关。
关键词 三叶青 乙酸乙酯 人肝癌细胞 HepG － 2 裸鼠
Study on Inhibition Effece of Ethylacocate Extract of Tetrastigma Hemsleyanum Diels et． Gilg on
Transplantation Tumor by Human Hepatocarcinoma Cell HepG － 2 in Athymic Mouse
WANG Ming － yi1，CHEN Wei － fang1，CHEN Yu2，et al
(1Zhejiang Traditional Chinese Medical University，Hangzhou 310053
2Zhejiang Academy of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou 310007)
ABSTＲACT Objective:To explore the antitumor effect and the mechanism of ethylacetate extract of tetrastig-
matis hemsleyani in athymic mouse transplantation tumor by human hepatocarcinoma cell HepG － 2． Methods:
HepG － 2 cell cultured in vitro was transplanted into subaxillas of mice to establish animal models with transplan-
ted tumor． The tumor weight，volume，rates of tumor inhibition，spleen index were recorded，Diochemical analyzer
analyzed ALT，AST，BUN，CＲE，ELISA analyzed the levels of serum TNF － α and IFN － γ. Ｒesults:Low，mod-
erate and high dose treatment groups showed the rates of tumor inhibition were 38. 66% ，23. 53% and 31. 09%
. After treating with tetrastigmatis hemsleyani，all dose groups can up － regulated the levels of TNF － α and IFN －
γ，and high dose treatment groups was significant difference to compared with model group. Conclusion:Ethyla-
cetate extract of tetrastigmatis hemsleyani can inhibited athymic mouse transplantation tumor by human hepatocar-
cinoma cell HepG － 2，its mechanism may be associated with the levels of TNF － α and IFN － γ．
Key words:tetrastigma hemsleyanum diels et． gilg ethylacetate Human hepato carcinoma cell HepG － 2 at-
lymit mouse
* 浙江省中药新药研究发重点实验室 No． 2008F3036
△通讯作者
中药三叶青为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤(Tet-
rastigma hemsleyanum Dielset) ，分布于长江以南广大地区山
谷林中或沟边坡地，块根或全草入药，可清热解毒、祛风化
痰、活血止痛，用于高热惊厥、肺炎、哮喘、咽痛、瘰疬、肝炎、
风湿、月经不调等症［1］。近年来因其具有抗肿瘤的生物活性
而被广泛研究［2］，其乙酸乙酯提取物具有抗肿瘤及免疫调
节功能［3 － 4］。原发性肝癌是临床常见恶性肿瘤之一，手术切
除虽被公认为肝癌根治的首选方法，但至今手术切除率仍不
足 30%［5］。中医中药作为恶性肿瘤综合治疗措施中的一个
重要组成部分，在预防肝癌发生、减少复发转移、提高生存质
量、延长生存期等方面有着独特的优势。本实验研究了三叶
青乙酸乙酯提取物对 HepG － 2 皮下移植瘤的抑制作用，并
探讨其相关作用机制。
1 材料和方法
1. 1 药物与试剂 三叶青乙酸乙酯提取物制备:将 600g三
叶青用 3L乙酸乙酯提取 3 次，萃取液回收乙酸乙酯后，置于
冰箱中保存备用;5 － 氯尿嘧啶:湖北康源化工有限公司。
TNF － α、IFN － γ ELISA试剂盒:南京建成。
1. 2 细胞株及实验动物 人肝癌 HepG － 2 细胞株:购自浙
江中医药大学实验动物中心。BALB /C(nu /nu)裸鼠 25 只，4
～ 5 周龄，SPF级，体重(18 ± 2)g，购自浙江中医药大学实验
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动物中心，实验动物质量合格证号:SCXK(沪)2012 － 0002。
1. 3 动物造模 取接种人肝癌细胞 HepG － 2 后 10 ～ 14 天
荷瘤小鼠 3 只，脱颈椎处死，酒精消毒，在无菌条件下剥取瘤
组织，在无菌平皿中剪碎，置组织研磨器中，加生理盐水研磨
过滤，制成瘤细胞悬液，用 0. 4%台盼蓝计数，细胞活力大于
95% ，调整细胞浓度为 1 × 107·mL －1，取 0. 2mL 细胞悬液
接种于小鼠右前肢腋窝皮下建立模型。
1. 4 分组及给药 小鼠接种后随机分为 5 组，每组 5 只。
模型组(生理盐水)、三叶青低剂量组(5g /kg，生药)、三叶青
中剂量组(15g /kg，生药)、三叶青高剂量(25g /kg，生药) ，
0. 2mL灌胃，每天 1 次，共 21 天;对照组:25mg /kg 5 －氟尿
嘧啶 0. 2mL腹腔注射，1 周 2 次，共 6 次。
1. 5 观察指标检测 定期观察小鼠精神、饮食及排便等情
况。自接种后隔日测量裸鼠体重。每周用游标卡尺测量裸
鼠肿瘤的长(a)短(b)径，并按以下公式计算相对体积:V =
0. 5ab2。末次给药后 24 小时，摘眼球取血 0. 4 ～ 0. 6mL，测肝
功能、肾功能生化指标［谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶
(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CＲE) ］。血液离心取上清液，
ELISA法检测血清中细胞因子 TNF － α 、IFN － γ的含量。脱
颈椎处死动物，剥离肿瘤和脾脏，电子天平称重，计算各组抑
瘤率及脾脏指数:抑瘤率 =(模型组平均瘤重 －治疗组平均
瘤重)/模型组平均瘤重 × 100%，脾脏指数 = 脾脏重量
(mg)/体重(g)× 10。各组瘤组织经 10%甲醛固定后石蜡
包埋切片，HE染色，光镜下观察细胞和组织结构的变化。
1. 6 统计学分析 采用 SPSS 16. 0 软件分析，分析结果以
均数 ±标准差(x ± s)表示，组间差异的比较采用单因素方差
分析(LSD法) ，以 P ＜ 0. 05 判定有统计学意义。
2 结果
2. 1 三叶青乙酸乙酯提取物对 HepG － 2 细胞裸鼠皮下移
植瘤生长的影响 见表 1
表 1 各组小鼠体重、瘤体积、瘤重、抑瘤率、脾指数的比较(x ± s，n = 5)
组别 体重(g) 瘤体积(mm3) 瘤重(g) 抑瘤率(%) 脾指数
模型组 21. 7 ± 1. 4 1511. 91 ± 265. 02 1. 19 ± 0. 23 98. 37 ± 12. 86
5 － FU 18. 3 ± 1. 9* 488. 85 ± 112. 49＊＊0. 44 ± 0. 12＊＊ 63. 03 63. 49 ± 10. 55＊＊
低剂量 20. 5 ± 0. 6 898. 19 ± 296. 05＊＊0. 73 ± 0. 19＊＊ 38. 66 85. 11 ± 14. 16*
中剂量 20. 0 ± 1. 7 1175. 94 ± 240. 85* 0. 91 ± 0. 12* 23. 53 76. 85 ± 15. 75*
高剂量 20. 4 ± 1. 1 1031. 40 ± 199. 69* 0. 82 ± 0. 10* 31. 09 67. 31 ± 6. 20*
与模型组比较* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01
2. 2 三叶青乙酸乙酯提取物对小鼠肝、肾功能及细胞因子
的影响 见表 2。
表 2 各组小鼠 ALT、AST、BUN、CＲEA、TNF － α、
IFN － γ的变化(x ± s，n = 5)
组别
ALT
(IU /L)
AST
(IU /L)
BUN
(mmol /L)
CＲEA
(μmol /L)
TNF － α
(pg /mL)
IFN － γ
(pg /mL)
模型组 43. 22 ±3. 82 117. 09 ±10. 51 5. 61 ±1. 44 35. 40 ±1. 52 474. 98 ±14. 04 588. 23 ±21. 90
5 －FU 46. 56 ±26. 89 144. 06 ±26. 42 8. 54 ±2. 42＊＊ 36. 00 ±2. 92 463. 45 ±38. 96 583. 82 ±65. 60
低剂量 43. 56 ±7. 95 117. 30 ±21. 13 6. 27 ±0. 97 36. 60 ±2. 41 532. 39 ±37. 98 630. 82 ±24. 91
中剂量 44. 19 ±7. 42 125. 40 ±6. 50 8. 10 ±1. 64＊＊ 37. 40 ±2. 07 481. 28 ±184. 1 666. 01 ±238. 8
高剂量 30. 98 ±8. 07 109. 81 ±27. 99 7. 28 ±0. 79 35. 80 ±2. 68 555. 02 ±37. 20 789. 48 ±64. 2＊＊
与模型组比较* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01
2. 3 三叶青乙酸乙酯提取物对瘤组织病理学变化的影响
模型组瘤组织呈巢状或片状生长，肿瘤细胞形态不规
则，排列密集，大小不一，细胞核大染色较深，核仁明显，核分
裂相多见，片状坏死区少。三叶青低剂量、中、高剂量组细胞
呈不同程度地坏死，5 － FU 组呈大面积片状坏死，较三叶青
治疗组严重。见图 1。
图 1 各组瘤组织光镜观察
3 讨论
人肝癌细胞株 HepG2 所构建的裸鼠移植瘤模型
［6］，瘤
组织保持原有细胞组织学特点，病理与人体肝癌病理状态接
近，是探讨药物抗肝癌作用的一种理想模型。本实验的裸鼠
在接种后的 4 ～ 6 天全部出现肿瘤，实验结束后全部存活。
三叶青低剂量组抑瘤率最高(38. 66)%，高剂量组次之
(31. 09)%，中剂量组最低(23. 53)%。病理切片 HE染色结
果显示三叶青治疗组瘤组织形态不规则，细胞大小不一，细
胞核染色较深，细胞呈不同程度的坏死，说明三叶青具有一
定的抑制肿瘤作用。
三叶青各治疗组裸鼠体重低于模型组，实验过程中精神
状态好，未出现食欲减退、消瘦、腹泻等症状，而 5 － FU 组裸
鼠均出现不同程度地食欲减退、消瘦、精神萎靡等现象。生
化检查结果显示:三叶青各剂量组对肝功能无毒副作用，三
叶青中剂量组 BUN 偏高，可能对肾功能有所损伤。三叶青
各剂量组脾指数均低于模型组，且随着剂量升高，脾指数有
下降趋势，说明三叶青对免疫功能有所影响。
细胞因子 IFN － γ和 TNF － α在调节免疫和抗肿瘤作用
中发挥重要作用。肿瘤坏死因子是一种多功能细胞因子，可
以直接杀伤或抑制肿瘤细胞，在促进肿瘤发生、发展的过程
中起到重要作用［7］。干扰素具有抗肿瘤血管生成、直接杀伤
肿瘤细胞、免疫调节及阻断原癌基因等功能，干扰素与肿瘤
细胞表面受体结合后，可通过调节干扰素刺激基因的表达，
从而发挥抗肿瘤的效应。本实验结果显示，三叶青低、中、高
剂量组 IFN － γ和 TNF － α 水平均高于模型组，三叶青高剂
量组 IFN － γ升高明显(P ＜ 0. 05) ，说明三 (下转第 163 页)
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(6 － H，s，2OCH3) ;13 C － NMＲ(CDCl3)δ:176. 53(C = O) ，
165. 24(C － 7) ，162. 12(C － 5) ，159. 71(C － 9) ，159. 27(C －
4) ，146. 25(C － 2) ，135. 40(C － 3) ，129. 61(C － 2，6) ，
122. 36(C － 1) ，114. 09(C － 3，5) ，103. 92(C － 10) ，99. 38
(C － 8) ，98. 07(C － 6) ，55. 82(7 － OCH3) ，55. 84(4 －
OCH3)。以上数据与文献报道一致
［9］。鉴定化合物 4 为 7，
4 －二甲氧基山柰酚。
化合物 5:淡黄色针晶。IＲ(KBr)v:3369，3312，170l，
l616，15l6，l462，143l，l337，1238，11l8，993，758cm －1。EI －
MSm/z2l2，l97，181，l53，141. 1H － NMＲ400MHz，CDCl3)δ:
7. 32(2H，s，H －2，6) ，6. 03(1H，s，4 － OH) ，3. 92(6H，s，3，5
－ OCH3) ，3. 89(3H，s，－ COOCH3) ;13 C － NMＲ(100MHz，
CDCl3)δ:166. 83(＞ C = 0) ，l46. 67(C － 3，5) ，139. 3(C － 4) ，
121. 04(C － 1) ，l06. 7l(C － 2，6) ，56. 39(3，5 － OCH3) ，52. 03
(一 OCH). 数据与文献［10］对照一致，确定化合物 5 为丁香
酸甲酯。
化合物 6:黄色液体，有芳香气味。EI － MS(m/z) :164
［M +］，2，UVλMeOHmax nm:236，280;IＲν(液膜)cm
－1:3400(OH) ，
2900，2850，2760(CH3，CH2，CH) ，1620(C = C) ，1590(苯
环)。以上数据经比较与文献［11］一致，因此鉴定化合物 6 为
丁香酚。
化合物 7:无色针状结晶。mp:81 ～ 83℃。ESI － MSm/
z:151［M － H］－，1H － NMＲ(500Hz，CDCl3)δ:9. 83(1H，s，
CHO) ，7. 44(1H，dd，J = 8. 5，1. 7Hz，H － 6) ，7. 42(1H，d，J =
1. 7Hz，H － 2) ，7. 04(1H，s，J = 8. 5Hz，H － 5) ，6. 38(1H，
br. s，OH) ，3. 94(3H，s，OCH3)。13 C － NMＲ(125Hz)δ:190. 9
(CO) ，151. 8(C － 4) ，147. 2(C － 3) ，129. 8(C － 1) ，127. 5(C
－ 6) ，114. 4(C － 5) ，108. 9(C － 2)。以上数据与文献［12］报
道的数据基本一致，鉴定化合物 7 为香草醛。
化合物 8:白色针晶。mp170 － 172℃。EI － MSm/z:193
［M － H］－，1H － NMＲ(DMSO － d6，500MHz)δ:3. 81(3H，s) ，
6. 36(1H，d，J = 15. 8Hz，H － 8) ，6. 78(d，J = 8. 0Hz，H － 5) ，
7. 06(dd，J = 8. 0，2. 0Hz，H － 6) ，7·. 27(d，J = 2. 0Hz，H －
2) ，7. 48(d，J = 15. 8Hz，H － 7) ;13 C － NMＲ(DMSO － d6，
125MHz)δ:55. 7(－ OCH3) ，112. 2(C － 2) ，115. 5(C － 5) ，
115. 6(C － 6) ，122. 7(C － 8) ，125. 7(C － 1) ，144. 3(C － 7) ，
147. 9(C － 4) ，149. 0(C － 3) ，167. 8(C － 9)。以上数据经比
较与文献［13］一致，因此鉴定化合物 8 为阿魏酸。
4 结论
从乙酸乙酯萃取部位分离得到了 8 个化合物，结构鉴定
分别为邻苯二甲酸二(2 － 乙基己)酯(bis(2 － ethylhexyl)
phthalat，1)、香草酸甲酯(methylvanillate，2)、对羟基苯甲酸
甲酯(methylparaben，3)、7，4 －二甲氧基山柰酚(7，4 － di-
methoxykaemferol，4)、丁香酸甲酯(4 － hydroxy － 3，5 － dime-
thoxybenzoic acid methyl ester，5)、丁香酚(eugenic acid，6)、香
草醛(vanillin，7)、阿魏酸(ferulic acid，8)。化合物 1 ～ 7 为
首次从柽柳属植物中分离得到。
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(上接第 158 页)
叶青有可能通过提高 IFN － γ和 TNF － α水平来发挥抗肿瘤
及调节机体免疫功能的作用。
综上所述，三叶青乙酸乙酯提取物具有抑制 HepG － 2
皮下移植瘤的作用，但不呈剂量依赖性，作用机制可能与提
高 IFN － γ和 TNF － α水平有关。
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