全 文 ：收稿日期:2006-08-18;　修订日期:2006-12-18
基金项目:江苏省自然科学基金项目(No. BK2004062)
作者简介:段国峰(1968-),男(汉族),江苏泰兴人 ,现任中国药科大学高
职院讲师 ,硕士学位 ,主要从事中药有效成分研究工作.
茅苍术多糖的分离纯化及组成分析
段国峰 1 , 欧阳臻2 , 余伯阳 3
(1.中国药科大学高等职业技术学院 ,江苏 镇江　212003;
　2.江苏大学药学院 ,江苏 镇江　212013;　3. 中国药科大学中药学院 ,江苏 南京　210038)
摘要:目的 对茅苍术多糖的提取 、分离纯化和单糖的组成进行了分析。方法 茅苍术经热水提取乙醇沉淀得多糖粗品
(APW), APW经脱蛋白 、透析 、DEAE -纤维素柱和 Sephadex G - 100柱层析进行纯化 , 纯化多糖通过色谱等方法进行分
析。结果 粗多糖主要含 APW1, APW 2, APW3, APW 4四个组分。结论 纯化多糖经高效凝胶色谱 、薄层层析 、气相色谱等
分析得知:APW 1分子量约为 5. 3 ×103 , 由 Rha, A ra, Xy l, M an, G lu, Ga l组成 , 其摩尔比为 0. 16:0. 17:0. 24:0. 55:0. 89:
1. 00;APW 2分子量约为 5. 4×104 , 由 A ra, M an, G al组成 , 其摩尔比为 0. 82:1. 00:0. 32;APW3、APW 4分子量约为 7. 0×
105 , 2. 0×106 ,均由 Rha , A ra,M an, Ga l组成 ,其摩尔比分别为 0. 24:1. 00:0. 48:0. 53及 0. 22:0. 34:1. 00:0. 58;为茅苍术
多糖的进一步研究提供了基础。
关键词:茅苍术;　多糖;　分子量;　组分
中图分类号:R284. 2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2007)04-0826-03
Separation, Purification and Composition Analysis of Polysaccharides From Rh izom es of
A tractylodes lancea (Thunb. )DC
DUAN Guo-feng1 , OUYANG Zhen2 , YU Bo-yang3
(1. Altitude Voca tional School , China Pharamaceu ticalUn iversity, Zhenjiang , J iangsu 212003, China ;2. B iol-
ogy and Environment School, J iangsuUniversity, Zhenjiang , J iangsu 212013, Ch ina ;3. School of ChineseMa te-
riaMed ica , China Pharamaceu tica lUniversity, Nanjing , 210038, China )
Abstract:Objective To purify and analyse the po lysaccha rides from rhizomes o fAtracty lodes lancea DC. M ethods The c rude
po lysaccha rides(APW) we re obtained by ex trac ting w ith hot wa ter and prec ipitating w ith a lcoho .l The c lea red APW w ere purified
by DEAE - cellu lose, Sephadex G - 100 co lum n, and it w as ana ly zed by chrom atog raphy. R esu lts The pu rified fou r pro teins
(APW 1 ～ 4) w ere removed from crude po ly saccharides. Conclusion Analsed by H PGC, TLC and GC, the m o lecular w eight o f
APW 1～ 4 5. 3×103 , 5. 4 ×104 , 7. 0 ×105 and 2. 0×106 , re spec tively. The chem ica l com ponen ts and the m o la r ra tio showed
a s fo llow s:APW1:Rha∶Ara∶Xy l∶M an∶G lu∶G al=0. 16:0. 17:0. 24:0. 55:0. 89:1. 00;APW 2:A ra:M an:Ga l =0. 82:1.
00:0. 32. The com ponen tAPW 3 and APW4 w ere Rha, A ra, M an and G al, the mo lar ratio s showed 0. 24:1. 00:0. 48:0. 53 and
0. 22:0. 34:1. 00:0. 58. A ll these w ork can establish foundation fo r the fu rther study o f A trac ty lodes Po ly saccharide s.
Key words:Rh izom es ofAtracty lodes lancea(Thunb. ) DC;　Po ly saccha rides;　Molecu la rw eight;　C om ponen t
　　中药茅苍术为菊科植物茅苍术 Atracty lodes lancea (Thunb. )
DC. 的根茎。始载于《神农本草经》, 列为上品 , 性温 ,味辛 、苦 ,
归脾 、胃 、肝经 , 具有燥湿健脾 、祛风散寒 、明目的功效 , 主要用于
脘腹胀满 、泄泻 、水肿 、脚气痿躄 、风湿痹痛 、风寒感冒 、夜盲等症。
主产于江苏句容 、镇江 、湖北襄阳 、河南桐柏等地 ,江苏茅山地区
是茅苍术地道药材的中心产区 。关于茅苍术的研究 ,近年来主要
集中在其挥发油等挥发性成分的化学及药理的研究 [ 1 ～ 3];对于茅
苍术水溶性成分多糖的研究 , 仅见 K. -W. YU等 [ 4 ～ 6]对湖北产
的茅苍术作了研究 , 研究表明茅苍术多糖具有肠免疫活性 、抗假
丝酵母菌感染等药理作用 ,活性与多糖中阿拉伯半乳糖及半乳糖
醛酸性部位有关;而对传统地道药材江苏茅山地区茅苍术多糖的
研究 , 国内外未见报道。
本文报道了江苏茅山地区茅苍术多糖的提取纯化及组成研
究 , 药材脱脂后经水提 、醇沉 ,经 DEAE -纤维素和 Sephadex G -
100柱层析得到 APW1 ～ 4四个多糖组分 , 并经高效凝胶色谱 、薄
层色谱和气相色谱等分析确定茅苍术多糖的分子量及单糖组成 ,
为进一步研究其化学结构和生物活性提供了依据。
1　材料与仪器
1. 1　材料与试剂 茅苍术采集于江苏句容茅山地区 , 经江苏大学
药学院欧阳臻教授鉴定为菊科植物茅苍术 Atracty lodes lancea
(Thunb. ) DC. 的根茎。干燥后 , 粉碎 , 过 50目筛 ,备用。 DEAE
纤维素 (Wha tm an公司)、Sephadex G - 100、分子量标准品葡聚糖
Dex tran系列 、单糖标准品(S igm a公司 ), 其他化学试剂均为国产
分析纯 。
1. 2　仪器 JASCO LC1500高效液相色谱系统 , 日本分光公司;
TSK -G4000PW , 日本 TOSOH公司;Ava tar360傅立叶红外光谱
仪 , 美国尼高力公司;GC - 14B 气相色谱仪 , 日本岛津公司;
N2000色谱处理工作站 , 浙江大学智能研究所;紫外可见分光光
度计 , 上海优尼科公司;恒流泵 、自动分部收集器 (上海沪西仪器
厂);冷冻干燥机 , 德国 Ch rist公司。
2　方法
2. 1　茅苍术粗多糖的提取 取粉碎后的茅苍术(500 g), 用无水
乙醇回流脱脂 ,残渣通风晾干后加 5 000 m l蒸馏水 , 90℃提取 4
次 , 合并提取液 , 减压浓缩至一定体积。冰浴条件下加三氯乙酸
脱蛋白 ,离心除去变性蛋白 , 上清液迅速用 NaOH 中和至 pH =
7. 0,浓缩至适量 , 透析除去小分子杂质 ,再减压浓缩 , 加 4倍体积
的 95%乙醇 , 4℃放置过夜 , 离心收集沉淀 , 沉淀依次用无水乙
醇 、丙酮 、乙醚洗涤 ,挥干乙醚后 , 复溶于水 ,冷冻干燥。即得水提
粗多糖 APW。
2. 2　APW 分离纯化 取 APW 加水溶解 , 以 DEAE - 52纤维素柱
(50 cm ×2. 6 cm)析层析 , 依次用 0. 00 ～ 2. 00 m ol /L的 NaC l溶液
洗脱 , 分别收集洗脱液(每管 10 m l),以改良的苯酚-硫酸法 [ 7]跟
踪检测 ,根据洗脱曲线收集。 取 0. 02 ～ 0. 20 m o l /L的 NaC l溶液
洗脱部分 ,蒸馏水透析 3 d,冷冻干燥 , 再经 SephadexG - 100柱层
析 (60 cm ×1. 0 cm)层析 , 0. 1 m ol /L NaC l洗脱 ,以改良的苯酚-硫
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酸法跟踪测定 , 根据洗脱曲线收集 , 并经 HPLC凝胶柱检测 ,得到
较为纯化的茅苍术多糖 APW 1, APW 2, APW 3和 APW4。
2. 3　茅苍术多糖的分子量测定 色谱条件:JASCO RI - 1530示
差检测器 , JASCO PU - 1580泵 , TSK -G4000PW 色谱柱 , 柱温
30℃, 流动相 0. 003 m o l /L醋酸钠 , 流速为 0. 5 m l /m in 。
2. 3. 1　标准曲线的制作 分别称取平均分子量为 2 000, 500,
70, 40, 10 kDal的 Dex tran系列标准葡聚糖 5. 0 mg,用 1 m l流动
相溶解 , 0. 45μm滤膜过滤后 , 吸取 20 μl注入高效液相色谱中 ,
以分子量的对数为纵坐标 ,以各糖的保留时间为横坐标 , 绘制标
准曲线。
2. 3. 2　样品分子量测定 取纯化后的样品各 5 mg与 1 m l流动
相溶解 , 按与 Dextran标准品相同的色谱条件操作 ,求得各自相应
的保留时间 , 按标准曲线计算分子量。
2. 4　茅苍术多糖组成单糖的组分分析
2. 4. 1　红外色谱分析 分别称多糖各 1 m g干燥样品 , 与 KBr研
磨混合后压片 , 采用 Ava ta r360红外光谱仪扫描分析 ,波长范围为
4000 ～ 400 cm - 1 , 尤其观察 800 ～ 900 cm - 1的吸收峰。
2. 4. 2　多糖的水解 取 APW1, APW 2, APW3和 APW 4各 5 m g干
燥样品 , 加入 2. 0 m ol /L的 H2 SO 4溶液 0. 5 m l, 封管 , 100℃水解
12 h,取出 ,加入 BaCO3中和 , 3 000 r /m in离心除去 BaSO 4沉淀 ,上清液冷冻干燥 , 供分析用。
2. 4. 3　薄层色谱分析 分别称取 L-鼠李糖 、D-阿拉伯糖 、D-甘露
糖 、D-葡萄糖 、D-半乳糖和 D-木糖各 15 mg,分别定容于 10 m l容
量瓶中 , 得各单糖标准品溶液。另取各单糖标准品溶液 1 m l等
量混合 , 得单糖标准品混合溶液。
取单糖标准品溶液和混合单糖标准品溶液 ,分别点于含 0. 3
m ol /L的磷酸二氢钠的硅胶 G板上 , 以丙酮∶水 =24∶1及正丁
醇∶醋酸乙酯∶异丙醇∶醋酸∶水∶吡啶 =7∶20∶12∶7∶6∶
7进行二次展开 , 取出 , 晾干后 , 喷苯胺 -邻苯二甲酸显色 , 计算
Rf值。
样品 APW 1、APW2、APW 3和 APW4水解液和混合单糖标准
品溶液 , 按相同的方法展开 、显色 ,计算各 Rf值并进行样品与标
准品可见光与荧光下的对比。
2. 4. 4　气相色谱分析 采用糖腈乙酰法 [ 8]制备衍生物:分别称
取标准单糖和多糖水解后的糖样各 10 m g,加入盐酸羟胺 10 m g,
内标肌醇 7 mg和吡啶 0. 5 m l,于 90℃水浴加热 30 m in并振荡 ,
取出冷却至室温 , 加入醋酸酐 0. 5 m l, 在 90℃继续加热 30 m in进
行乙酰化 , 产物浓缩至干 , 加入 0. 5 m l氯仿溶解 ,溶液经 0. 45μm
滤膜过滤后 , 注入气相色谱仪进行分析。
色谱条件:DB - 5 30000 mm ×0. 53 mm 弹性石英毛细管色
谱柱;载气:高纯氮气;检测器:氢火焰离子化检测器(F ID);程序
升温:100℃ ( 5℃ /m in)→ 190℃, 190℃ (4℃ /m in)→ 240℃
(5m in);汽化温度 280℃;检测器 260℃。
3　结果
3. 1　茅苍术多糖的提取纯化 茅苍术粉末经脱脂 、水提 、脱蛋白 、
醇沉 , 冷冻干燥后得到 APW多糖组分为 14. 25 g, 收率为 2. 85%。
APW经 DEAE - 52纤维素柱层析 , 以改良的苯酚-硫酸法跟踪检
测 , 得 4个主要组分 APW 1 ～ 4。这 4个组分再过 Sephadex G -
100凝胶柱 ,以改良的苯酚 -硫酸法跟踪测定 , 收集液经 HPLC
凝胶柱检测为单一对称峰。
3. 2　茅苍术多糖的分子量测定 由保留时间 t对标准分子量的
对数做图 , 得标准曲线 Y =34. 785 - 3. 436 7X , r=0. 995, 其中 X
为分子量的对数( lgMw), Y为保留时间。结果见图 1。
APW 1 ～ 4 的保留时间分别为 21. 982, 18. 511, 14. 698,
13. 075 m in,代入回归方程得平均分子量分别约为:5. 3×103 , 5. 4
×104 , 7. 0×105 , 2. 0×106。
3. 3　茅苍术多糖 APW 1, APW 2, APW 3和 APW4单糖的组成分
析
3. 3. 1　甘露糖分析 多糖中如有甘露糖组分 , 其红外光谱均呈现
810 cm - 1及 870 cm - 1左右的特征吸收峰 [ 9] 。红外扫描显示 , 4种
茅苍术多糖均有该特征吸收峰 ,说明均含有甘露峰组分。
3. 3. 2　薄层色谱分析结果 各标准单糖在薄层板上获得了良好
的分离 ,各标准单糖的 R f值见表 1。
图 1　多糖的标准曲线
表 1　各标准单糖的 R f值
单糖 R f值
鼠李糖　 0. 83
木糖　　 0. 50
阿拉伯糖 0. 33
甘露糖　 0. 28
葡萄糖　 0. 23
半乳糖　 0. 12
通过各单糖标样斑点与茅苍术多糖水解所得单糖斑点的颜
色和 Rf值比对 , 确定茅苍术多糖样品中的单糖组成。 结果表明 ,
茅苍术多糖纯化得 APW 1由 Rha, A ra, Xy l, M an, G lu, Ga l组成 ,
APW 2由 Ara, M an, Gal组成;APW3, APW4均由 Rha , A ra, M an,
Ga l组成。
3. 3. 3　气相色谱分析结果 标准单糖及茅苍术多糖 APW1,
APW 2, APW3, APW 4的气相色谱见图 2 ～ 6。由色谱图可以看出
各单糖在此色谱条件下获得了良好的分离。
1.鼠李糖(Rha)　 2.阿拉伯糖(A ra)　　3.木糖(Xyl)
4.甘露糖(M an)　5.葡萄糖(G lu)　 6.半乳糖(Gal)　7.肌醇(Inositol)
图 2　标准单糖乙酰化物的 GC图
1.鼠李糖(Rha)　2.阿拉伯糖(A ra)　 3.木糖(Xyl)　 4.甘露糖(M an)
　 5.葡萄糖(G lu)　6.半乳糖(Ga l)　7.肌醇(Inos itol)
图 3　茅苍术多糖 APW1乙酰化物的 GC图
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2.阿拉伯糖(A ra)　 4.甘露糖(M an)
　6.半乳糖(G al)　 7. 肌醇( Inosi tol)
图 4　茅苍术多糖 APW2乙酰化物的 GC图
1.鼠李糖(Rha)　2.阿拉伯糖(A ra)
　4.甘露糖(M an)　 6.半乳糖(Gal)　 7. 肌醇(Inosito l)
图 5　茅苍术多糖 APW3乙酰化物的 GC图
1.鼠李糖(Rha)　2.阿拉伯糖(A ra)　 4.甘露糖(M an)
　6.半乳糖(G al)　 7. 肌醇( Inosi tol)
图 6茅苍术多糖 APW4乙酰化物的 GC图
根据各标准单糖的气相色谱图确定各单糖的保留时间和响
应因子。结果见表 2。
多糖的气相色谱通过与标准单糖的保留时间和响应因子对
比确定糖的种类和摩尔比。结果表明 ,茅苍术多糖纯化得 APW 1
由 Rha, A ra, Xy l, M an, G lu, G al组成 , 其摩尔比为 0. 16∶0. 17∶
0. 24∶0. 55∶0. 89∶1. 00;APW2由 A ra, M an, Ga l组成 ,其摩尔比
为
0. 82∶1. 00∶0. 32;APW 3, APW4均由 Rha , A ra, M an, Ga l组成 ,
但其摩尔比不同 , 分别为 0. 24∶1. 00∶ 0. 48∶ 0. 53及 0. 22∶
0. 34∶1. 00∶0. 58。
表 2　标准单糖 、内标糖腈乙酰化物结果分析
项目 保留时间 t /m in 响应因子
Rha 15. 86 1. 15
A ra 16. 19 0. 78
Xy l 16. 46 0. 98
M an 20. 71 0. 83
G lu 20. 98 1. 27
G al 21. 43 1. 33
Inosito l 23. 68 1
4　讨论
4. 1　 多糖的脱蛋白 , 常有 Sevag法 、三氟三氯乙烷法 、三氯乙酸
法等 , 对于植物多糖的脱蛋白 , 本实验中的三氯乙酸法 ,控制在冰
浴条件下 ,具有操作简便 、效果良好 ,且能避免氯仿等有毒溶剂的
使用。
4. 2　 在多糖类高分子的分子量测定中 , 由于分子的组成及空间
结构不同 , 以葡聚糖为对照所得的分子量并非是分子量的绝对
值;而且温度对示差器检测有一定的影响。
4. 3　 多糖的红外光谱 , 730 ～ 960 cm - 1数据特别有意义 ,不仅可
以区别 α及 β 型吡喃环 , 而且多糖中有甘露糖组分的 , 均呈现
810 cm - 1及 870 cm - 1特征吸收峰。气相衍生物采用糖腈乙酸酯
法 , 具有制备简单 、试剂易得的优点 ,且每种糖能得到单一的色谱
峰;另外将反应物浓缩至干 , 加入适量氯仿可有效减少溶剂峰的
拖尾。
4. 3　 本实验初步弄清了茅苍术多糖的分子量及各自单糖组成 ,
所得各多糖的纯化物均含有阿拉伯糖及半乳糖 ,与有关文献的活
性部位一致 [ 6] , 为茅苍术多糖的进一步结构分析和活性研究奠
定了基础。
参考文献:
[ 1 ] 　朱晓琴 ,贺善安.不同产地苍术药材化学成分的比较 [ J] .植物资源
与环境 , 1994, 3(4):18.
[ 2 ] 　黄　驰 ,徐友贵 ,王旭敏.气相色谱-质谱联用法比较野生及栽培茅
苍术挥发油成分 [ J] .中国药科大学学报 , 1989, 20(5):289.
[ 3 ] 　Nakai Y, Kido T, H ashim oto K , Kase Y, Sakak ib ara I, H iguch iM ,
Sasak iH. E ffect of the rh izom es ofA tractylodes lancea and its con stitu-
en ts on the delay of gastric em p tying[ J] . J E thnopharm aco.l 2003 Jan;
84(1):51.
[ 4 ] 　K. -W. Yu, H. K iyohara, T. M atsum oto, H. - C. Yang, H. Yam ada In-
testinal imm une systemm odu lating polysaccarides from Rh izom es of A t-
racty lodes lancea[ J] . P lan taM ed. 1998 , 64:715
[ 5 ] 　 Inagak iN , Komatsu Y, Sasak iH , Kiyoh ara H , Yam ada H , Ish ibash i
H , Tansho S, Yam agu chiH , Abe S. Acid ic polysacch arid es from rh i-
zom es ofA tracty lod es lancea as p rotective p rincip le in C and ida - ln fect-
ed m ice[ J] . Plan ta Med. 2001 Ju l, 67(5):428.
[ 6 ] 　Taguch i I, K iyoh ara H , M atsumoto T, Yam ada H. S tructu re of oligo-
saccharide s ide ch ains of an in testinal immun e system m odu lating arab i-
nogalactan isolated from rh izom es ofA tractylodes lancea DC[ J] . Carbo-
hyd r Res. 2004 , 339(4):763.
[ 7 ] 　董　群 ,郑丽伊 ,方积年.改良的苯酚-硫酸法测定多糖和寡糖含量
的研究 [ J] .中国药学杂志 , 1996, 31(9) :550.
[ 8 ] 　Varm a R, Varm a RS,W ardi AH. Separation of a ldonon itrile acetates of
neu tral sugars by gas - liqu id ch rom atography and its app lication to pol-
ysaccharides[ J] . J. ch rom atogr. , 1973, 77:222.
[ 9 ] 　吴寿金 ,赵　泰 ,秦永琪.现代中草药成分化学 [ J] .北京 中国医药
出版社 , 2002:27.
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时珍国医国药 2007年第 18卷第 4期 LISH IZHEN MEDIC INE AND MATERIA M ED ICA RESEARCH 2007VOL. 18 NO. 4