全 文 ：一株楸树内生真菌的鉴定及其发酵产物抗肿瘤特性研究
收稿日期：2009-11-09
基金项目：国家自然基金项目（30700061）；科技部 863重点项目（2007AA021501）
作者简介：吴运帷（1984-），男，硕士研究生，研究方向为天然活性产物的药理学。E-mail: wyw. sjtu@gmail. com
*通讯作者：苗志奇，副教授，研究方向为天然产物化学。E-mail: zqmiao@sjtu. edu. cn
吴运帷1, 2，李美芽1，张 田1，于湘莉1，杨旭林1，周之蔚1，苗志奇1*
（1. 上海交通大学农业与生物学院, 上海 200240；2. 上海交通大学生命科学技术学院，上海 200240）
摘 要：利用传统分类学方法、ITS序列测定和系统发育分析方法对一株分离自楸树抗肿瘤活性内生真菌
FSNQ0023进行分类鉴定，并对其产物抗肿瘤活性及其细胞毒性进行了初步研究。结果表明，各种指标鉴定其为
木霉属真菌（Trichoderma sp.）中的一种，该菌株经发酵培养 120 h，抗肿瘤活性最强；其对肝癌细胞 HepG2的 IC50
约为正常肝细胞 HL-7702的 1/2；60 ℃处理 2 h后活性稳定。这些特性为活性产物的分离纯化提供了重要数据，
也为抗肿瘤新药开发提供了依据。
关键词：楸树；内生真菌；抗肿瘤活性
中图分类号：Q503 文献标志码：A 文章编号：1005-9369（2010）06－0090－04
Study on the identification of one endophytic fungus isolated from
Catalpa bungei and the anti-cancer activity of metabolites produced by
the fungus/WU Yunwei1, 2, LI Meiya1, ZHANG Tian1, YU Xiangli1, YANG Xulin1, ZHOU Zhiwei1,
MIAO Zhiqi1(1. School of Agriculture and Biology, Shanghai J iao Tong Univers ity, Shanghai 200240,
China ; 2. School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai J iao Tong Univers ity, Shanghai
200240, China )
Abstract: By using the traditional taxonomic methods, ITS sequences and phylogenetic analysis, an
endophytic fungus FSNQ0023 isolated from the Catalpa bungei was identified as one species of Tricho- derma sp.
The results showed that its anti-tumor activities were studied as well. The culture for at least 120 h showed strong
anti-tumor activity. The IC50 of the fermentation broth against the hepatoma cell line HepG2 was approximately half
of normal liver line HL-7702. The anti-tumor activity remained stable at 60 ℃ for 2 h treatment. These data
suggested proper methods for the purification of the active elements, which also provided new candidate for the
anti-tumor drug.
Key words: Catalpa bungei ; endophytic fungus; anti-cancer activity
植物内生真菌是指整个生活史都在植物体内或
生活史的一定阶段生活于健康植物的各种组织和器官
内部的真菌，宿主植物一般不表现出外在病症[1]。近
年来，植物内生真菌作为一种新的微生物资源引起了
广泛的关注，从内生真菌中寻找和发现新的活性化合
物是植物内生真菌研究的一个热点[2]。
1993年，Strobel等从短叶红豆杉韧皮部分离
到一株产紫杉醇的内生真菌-安德烈紫杉菌 [3]（Ta－
xomyces andreanae）；从此，从植物内生真菌中寻找
抗肿瘤药物引起了人们的重视。人们陆续从植物中
分离到产喜树碱[4]、鬼臼毒素[5]等抗癌活性物质的内
生真菌。本研究在分离楸树（Catalpa bungei）内生真
菌后进行了大规模的抗肿瘤活性菌种的筛选，选取
其中一株分离自楸树韧皮部并且表现出较强抗肿瘤
第 41卷 第 6期 东 北 农 业 大 学 学 报 41(6): 90~93
2010年 6月 Journal of Northeast Agricultural University June 2010
活性的内生真菌，进而对其进行了研究。
1 材料与方法
1.1 菌种来源
菌株 FSNQ0023分离自楸树树皮。
1.2 培养基
马铃薯葡萄糖培养基（PDA），121 ℃ 灭菌 25
min后冷却至 45 ℃时加入羧苄青霉素和链霉素分
别至 100 mg·L-1，倒平板。
1.3 菌种 FSNQ0023的分类鉴定
1.3.1 菌株形态学观察
形态特征观察采用插片法，PDA培养基 28 ℃
培养，第 4、9天取片，光学显微镜下镜检、拍照，
记录形态、培养特征（基内菌丝、气生菌丝和孢子丝
的特征及颜色）。内生真菌的鉴定依照《真菌鉴定手
册》[6]。根据丝状真菌的鉴定方法，采用菌落观察和
显微镜装片观察，根据产孢结构、分生孢子梗着生
情况、孢子形态与颜色，对照确定菌株的种属地位。
1.3.2 真菌基因组 DNA提取和 ITS序列扩增、序
列测定
采用氯化苄法从菌丝体中提取总 DNA[7]。DNA
用适当体积的双蒸水溶解。紫外分光光度计（Beck-
man Coulter, USA）对 DNA进行定量。
采用通用引物 ITS1和 ITS4对真菌 5.8S rDNA
ITS区域进行扩增[8]。引物由上海生物工程有限公司
合成。序列如下：
ITS1 5.8SF（5′TCCGTAGGTGAACCTGC 3′）
ITS4 5.8SR（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC 3′）
PCR反应体系：ITS: 10×PCR buffer 5 μL，2.5
mmol·L -1 dNTPs 2 μL， ITS1、 ITS4 各 1 μL，25
mmol·L -1 MgCl2 2.5 μL，DNA 模板 2 μL， rTaq
DNA聚合酶 1 U，加 ddH2O至 50 μL。
扩增程序：94 ℃预变性 4 min，94 ℃变性 1
min，53 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 45 s，35个循环，
最后 72 ℃延伸 10 min，4 ℃复性 10 min。
用 Gel extraction Kit 从胶中纯化回收 PCR 产
物，测序工作由上海英骏生物技术公司完成。
1.3.3 序列分析
将测序获得的 ITS序列用 NCBI提供的 Blast程
序与 GenBank中核酸数据库序列进行 Blast 分析，
利用 Clustal x软件包对与所得序列相近的各个序列
进行比对，比对结果用 Mega4.0进行亲缘关系和系
统发育分析。
1.4 供试细胞株及抗肿瘤活性检测方法
人肝癌细胞系 HepG2 和正常肝细胞系 HL-
7702均购买自中国科学院上海细胞生物学研究所。
试验具体步骤采用体外细胞毒测定的 MTT法[9]，用
Bio-tek全自动酶标仪在 570 nm波长下测定 OD值，
按下列公式计算对肿瘤细胞生长的抑制率（IC）。
IC（%）=[（对照组 OD570-试验组 OD570）/对照组
OD570]×100%
1.5 不同温度处理对真菌发酵液抗癌活性的影响
分别于-20、4、25、40、60、80、100 ℃处理
发酵样品 2 h，检测其对 HepG2 细胞系的抑制作
用，以考察不同温度对代谢产物活性的影响。
2 结果与分析
2.1 菌种的鉴定
FSNQ0023菌株在 PDA 培养基、28 ℃培养 4 d
菌落直径为 9 cm（见图版Ⅰ-A），菌落初呈白色，后
略带浅绿色，背面呈浅黄色（见图版Ⅰ-B）。营养菌
丝透明光滑、有隔，0.5～1.5 μm宽，孢子梗从气生
菌丝中分生，2.5～6.5 μm（见图版Ⅰ-C），分生孢子
梗较长，上部次级分枝短，基部次级分枝较长，常
单个伸出或互生，很少再次分枝，枝角度多为锐角
或接近于直角。上生分生孢子、球形，2.5～3.0 μm
（见图版Ⅰ-D），依《真菌鉴定手册》将 FSNQ0023初
步归属为木霉属（Trichoderma）。
A-内生真菌 FSNQ0023菌落形态；B-内生真菌 FSNQ0023菌落背面
形态；C-内生真菌 FSNQ0023菌丝体（×100）；D-内生真菌 FSNQ0023
孢子(×100)
A-Colony of the endophytic fungus(Front); B-Colony of the endophytic
fungus (Back); C-Mycelia of the endophytic fungus (×100); D-Spores of
the endophytic fungus(（×100)
图版Ⅰ 内生真菌形态
PlateⅠ Morphology of endophytic fungus
D
BA
C
吴运帷等：一株楸树内生真菌的鉴定及其发酵产物抗肿瘤特性研究第 6期 ·91·
采用通用引物， PCR 扩增获得菌株 FS -
NQ0023 的 ITS 序列 615 bp。将所得 ITS 序列与
NCBI 数据库中已经收录的序列进行 Blast 分析，
结果表明，FSNQ0023 菌株的 ITS 序列与木霉属
的相似性高达 99%，由此也判断 FSNQ0023 为木
霉属中的一个种。通过选取 NCBI 数据库中与
FSNQ0023 的 ITS 序列同源性高的系列菌株用于
系统发育分析（见图 1）。结合形态学特征观察及
ITS 序列进行聚类分析，初步确定其为木霉属真
菌。
施魏多孔肉座菌/柠檬绿木霉 H. schweinitzii/T. citrinoviride
拟康氏肉座菌/拟康氏木霉 H. pseudokoningii/T. pseudokonin
红褐肉座菌 H. jecorina/T.reesei/ITS1
FSNQ0003
东方肉座菌 H. orientalis/GJS88-81
长梗木霉 T. longibrachiatum/ATCC18648
康长木霉 T. konilangbra/ITS1
丰孢木霉 T. saturnisporum/ATCC18903
安迪伦氏肉座菌 H. andinensis/ITS1
柔膜肉座菌 H. novaezelandiae/ITS1
木霉属 T. sp. MA3642/ITS1
图 1 由 ITS序列绘制的系统发生树
Fig. 1 Phylogenetic tree generated by ITS sequences analysis
2.2 菌株发酵液抗癌活性及对正常细胞的毒性
发酵液终浓度达到 15%时对 HepG2细胞系的
抑制率为 77.5%，而对 HL-7702细胞系的抑制率为
20.0%。计算两者的 IC50分别为 23.62 和 53.70 μL，
说明真菌发酵液对 HepG2肝癌细胞的生长具有明
显的选择抑制作用。结果见图 2、3。
2.3 不同温度处理对真菌发酵液抗癌活性的影响
分别于-20、4、25、40、60、80、100 ℃处理
发酵样品 2 h。处理后再对发酵液样品对肝癌细胞
系 HepG2 的抑制率进行检测。结果发现-20、4、
25、40、60 ℃处理 2 h后发酵液样品对 HepG2细
图 2 菌株发酵液对 HepG2细胞系的抑制作用
Fig. 2 Effect of the strains metabolite to HepG2
◆
◆
◆
◆
100
80
60
20
40
0
0 5 10 15 20 25 30 35
体积（μL）
Volume
抑
制
率
（
％）
In
hi
bi
tio
n
ra
te
◆
◆
◆
◆
25
20
15
5
10
0
0 5 10 15 20 25 30 35
体积（μL）
Volume
抑
制
率
（
％）
In
hi
bi
tio
n
ra
te
图 3 菌株发酵液对 HL-7702细胞系的抑制作用
Fig. 3 Effect of the strains metabolite to HL-7702
·92· 东 北 农 业 大 学 学 报 第 41卷
胞抑制率无明显变化。而 80 ℃处理 2 h后抑制率
降低显著（见图 4），100 ℃处理 2 h后对 HepG2细
胞系几乎无抑制作用。表明发酵液中生物活性物质
在-20～60 ℃时仍然稳定，60 ℃可作为发酵液浓缩
温度，-20～4 ℃可作为发酵液储藏温度。
3 讨论与结论
对源于中草药植物内生真菌的大规模分离, 以
其发酵产物用于人肝癌细胞抗肿瘤模型筛选。分离
自楸树的菌株 FSNQ0023具有与楸树树皮提取物相
似的抗肿瘤活性[10]，该特性与人们提出的“协同进
化”理论以及共生于中草药植物的内生真菌能产生
与其相似的生理活性物质是一致的[11-12]。对其深入
研究、开发有望实现大规模工业化发酵生产，为抗
癌药物生产开辟新途径。
据报道，木霉属真菌是常见的土壤真菌，多分
离自土壤。它适应性强，生长迅速，传播蔓延快，
所分泌毒素能破坏一些药用、食用菌菌丝的细胞
质，抑制菌丝的生长。在农业上它对多种农作物病
原菌，如棉花立枯病具有拮抗作用，可用于农作物
的生防菌[13]。本研究通过对菌株 FSNQ0023发酵代
谢产物特性的初步探索，首次提出木霉菌是潜在的
天然抗癌药物来源之一的观点。同时通过相关研
究，基本掌握了该活性物质在不同温度条件下的稳
定性。为下游生物活性物质的分离纯化工作提供了
参考。
[ 参 考 文 献 ]
[ 1 ] Leuchtmann A. Systematics, distribution, and host specificity of gra－
ss endophytes[J]. Nat Toxins, 1992, 1(2): 150-162.
[ 2 ] 谷苏,邵华,蒋晓华,等.药用植物内生真菌多样性及其活性成
分的潜在应用价值[J].中国药学杂志, 2001, 36(1): 14-15.
[ 3 ] Stierle A, Strobel G A, Stierle D. Taxol and taxane production by
Taxomyces andreanae[J]. Science, 1993, 260: 214-216.
[ 4 ] Puri S C, Verma V, Amna T, et al. An endophytic fungus from Noth-
apodytes foetida that produces camptothecin [J]. Nat Prod, 2005,
68: 1717-1719.
[ 5 ] 杨显志,郭仕平,张玲琪,等.鬼臼类植物产鬼臼毒素内生真菌
的筛选[J].天然产物研究与开发, 2003(5): 419- 422.
[ 6 ] 魏景超.真菌鉴定手册[M].上海:上海科学技术出版社, 1979:
489-496.
[ 7 ] 朱衡,瞿峰,朱立煌.利用氯化苄提取适于分子生物学分析的真
菌 DNA[J].真菌学报, 1994, 13: 34-40.
[ 8 ] 刘春来,文景芝,杨明秀,等. rDNA-ITS在植物病原真菌分子检
测中的应用[J].东北农业大学学报, 2007, 38(1): 101-106.
[ 9 ] Mosmann F. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survi-
val: application to proliferation and cytotoxicity assay[J]. J Immunol
Methods, 1983, 65(1-2): 55-63.
[10] 王春玲,包永明,段彦龙,等.胡桃楸对 Hela, PC-3细胞作用的
研究[J].肿瘤学杂志, 2003(9): 144-146.
[11] 曾松荣,徐成东,王海坤,等.药用植物内生真菌及其具宿主相
同活性成分的机制初探[J].中草药, 2000, 31(4): 306-308.
[ 12 ] Audhya T K, Russell D W. Production of enniatins by Fusarium
bulinum; selection of high -yield conditions from liquid surface
culture[J]. J Gen Microbiol, 1983, 82: 181-196.
[13] 姚彬,王傲雪,李景富.哈茨木霉对 4种番茄病原真菌抑制作用
的研究[J].东北农业大学学报, 2009, 40(5): 26-31.
◆◆◆ ◆
80
70
60
40
50
0
-30 -10 30 50 70 90 110
温度（℃）
Temperature
抑
制
率
（
％）
In
hi
bi
tio
n
ra
te
◆
◆
◆
30
20
10
10
图 4 不同温度处理后真菌发酵液对肝癌细胞 HepG2抑制
率的变化
Fig. 4 Inhibiting rate of fungi fermentation broth on
HepG2 cell at different temperature
吴运帷等：一株楸树内生真菌的鉴定及其发酵产物抗肿瘤特性研究第 6期 ·93·