全 文 ：·中药与天然药物·
超声提取三叶青总黄酮工艺研究
王维华1，2，吴志庄3，牛广俊1，朱 思1，李尚智1，梁一池1* (1. 福建中医药大学药学院 福州 350122;2. 浙江省
竹子高效加工重点实验室 杭州 310000;3. 国家林业局竹子研究开发中心 杭州 310000)
摘要:目的 为优化三叶青中主要活性成分总黄酮的提取工艺。方法 以提取时间、料液比、乙醇浓度和提取温度为试验因素，三叶青中总黄
酮提取率为考察指标，在单因素试验基础上，采用响应面设计方法，对三叶青中总黄酮的提取工艺条件进行优化。结果 试验确定最佳提取工
艺为: 20 倍量 60%乙醇，60℃下超声提取 44min。在此工艺条件下，总黄酮提取率为 5. 55%。结论 经验证，采用响应曲面法优选出的工艺稳
定，为进一步研究三叶青提供参考依据。
关键词:三叶青;总黄酮;超声提取;响应曲面法
中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:1006-3765(2016)-03-11106-0045-04
作者简介:王维华，男(1990. 10 －)。学历:硕士研究生。
通讯作者:梁一池。职称:教授，博士生导师。
基金项目:省发改委项目(闽发改委〔2014〕89 号 750070019);浙江省
科技厅协同创新项目 (2015F50053);浙江省科技计划项目
(2014F10047)
Studies on the Supersonic Extraction Process Total Flavonoids from Tet-
rastigma Hemsleyanum
WANG Wei-hua1，2，WU Zhi-zhuang3，NIU Guang-jun1，ZHU Si1，LI Shang-zhi1，LIANG Yi-chi1* (1. College
of Pharmacy，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350108，China;2. Key Laboratory of
High Efficient Processing of Bamboo of Zhejiang Province，Hangzhou 310000，China;3. China National
Bamboo Research Centre，Hangzhou 310000，China)
ABSTRACT:OBJECTIVE To optimize extraction technique of total flavonoids from main active components in
Tetrastigma Hemsleyanum. METHODS Taking extraction time，solid-liquid ratio，ethanol concentration and extrac-
tion temperature as factors，and extraction rate of total flavonoids from Tetrastigma Hemsleyanum as a selection index，
based on results of single factor tests，extraction technique of total flavonoids in Tetrastigma Hemsleyanum was opti-
mized by the response surface design method. RESULTS The results showed that the optimum conditions were ex-
tracting for 44min at 60℃ with 60% ethanol concentration，solid-liquid ratio was 1∶20，and extraction rate of total fla-
vonoids was 5. 55%. CONCLUSION This technique is stable，and provide reference basis for further study of Tet-
rastigma Hemsleyanum.
KEY WORDS:Tetrastigma Hemsleyanum;Total flavonoids;Supersonic extraction;Response surface methodology
三叶青(Tetrastigma Hemsleyanum)又名蛇附子，为葡萄科
崖爬藤属植物〔1〕的干燥块根，是我国特有的珍稀药用植
物〔2〕。三叶青喜阴，适合林下种植，因此福建省等地已大面
积林下种植，是该省重要的林下经济药用植物，具有较高的经
济价值、观赏价值和药用价值〔3〕。三叶青为畲族特有民族
药，其性凉，味辛、苦，无毒，具有良好的抗炎、调节免疫、保肝
等作用〔4 ～ 7〕。目前研究表明，三叶青中黄酮类成分具有显著
的抗肿瘤效果〔8〕，因此三叶青成为抗肿瘤药物研究的热点。
为更好的利用三叶青中黄酮类成分，本实验在单因素试验基
础上考察提取时间、料液比、乙醇浓度、提取温度对三叶青总
黄酮提取率的影响，采用超声提取响应曲面法对三叶青中总
黄酮的提取工艺进行优化，优选出高提取率、低成本、易操作
且适合于工业生产的工艺技术，为三叶青进一步开发利用提
供一定的实验依据。
1 材料与方法
1. 1 材料、仪器与试药 块根采于福建顺昌，经福建中医药
大学药学院梁一池教授鉴定为三叶青(Tetrastigma Hemsleya-
num)。
数控超声波提取器(THC-10B)，济宁天华超声电子仪器
有限公司;电子天平(CP-214)，奥豪斯(上海)仪器有限公司;
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Strait Pharmaceutical Journal Vol 28 No. 3 2016
电热恒温鼓风干燥箱(DFYDHG-9240)，上海精宏实验设备有
限公司;紫外-可见分光光度计(UV-9100)，北京瑞利分析仪
器公司。芦丁，成都曼斯特生物科技有限公司，纯度≥98%，
批号为 MUST-15010707。水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
1. 2 方法
1. 2. 1 对照品溶液的制备:精密称取 120℃下干燥至恒重芦
丁对照品 10. 60mg，甲醇溶解并定容至 50mL量瓶中，备用。
1. 2. 2 供试品溶液的制备:精密称取干燥至恒重三叶青粉末
(50 目)0. 5g于锥形瓶中，加入 70%乙醇 10mL，称重，于 50℃
下超声提取 40min，补足失重。离心，取上清液 2. 0mL定容至
10mL量瓶中，即得。
1. 2. 3 标准曲线的绘制:分别精密移取 1. 2. 1 所述对照品溶
液 1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0、6. 0mL 于 25mL 量瓶中，依次加入
5% NaNO2溶液 1. 0mL，摇匀，放置 6min，加 10% Al(NO3)3 溶
液 1. 0mL，摇匀，放置 6min，再分别加入 1mol·L －1 NaOH 溶
液 10mL，定容至刻度，摇匀，静置 15min，于 510nm 处测吸光
度(A)。以芦丁对照品浓度 C(mg·mL －1)为横坐标，吸光度
值为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程:A =12. 294 C +
0. 001(相关系数为 r = 0. 9999，线性范围为 0. 00848 ～
0. 05088mg·mL －1)。
1. 2. 4 供试品溶液总黄酮含量测定:精密移取供试品溶液
2. 0mL，按照 1. 2. 3 项下测定吸光度，根据标准曲线方程计算
总黄酮提取率。
1. 2. 5 单因素试验:参考文献〔9〕，分别考察提取时间、料液
比、乙醇浓度、提取温度对三叶青总黄酮提取率的影响情况，
确定各试验因素最佳水平，从而为响应曲面分析试验提供参
考依据。
1. 2. 6 响应面分析方案:采用 Box-Behnken 的中心组合试验
设计原理〔10〕，根据单因素试验结果确定提取时间(A)，料液
比(B)，乙醇浓度(C)和提取温度(D)为考察因素，采用四因
素三水平的响应曲面分析法〔11〕进行分析，每一个考察因素的
低、中、高实验水平分别以 － 1，0，1 进行编码(见表 1)。
表 1 Box-Behnken方案设计的因素和水平编码值表
试验
水平
试验因素
提取时间 A
(min)
料液比 B
(g·mL －1)
乙醇浓度 C
(%)
提取温度 D
(℃)
－ 1 30 1∶10 60 40
0 40 1∶15 70 50
1 50 1∶20 80 60
2 结果与分析
2. 1 单因素试验结果与分析
2. 1. 1 提取时间对三叶青总黄酮提取率的影响:当提取时间
为 40min时，总黄酮提取率最大;当提取时间延长时，提取率
却随之下降。所以选择 40min为超声提取时间(见图 1)。
2. 1. 2 料液比对三叶青总黄酮提取率的影响:当料液比为 1
∶15 时，总黄酮提取率最大;当料液比不断增加时，提取率却
随之下降。所以选择 1∶15 的料液比(见图 2)。
图 1 提取时间对三叶青
总黄酮提取率的影响
图 2 料液比对三叶青
总黄酮提取率的影响
2. 1. 3 乙醇浓度对三叶青总黄酮提取率的影响:当乙醇浓度
为 70%时，总黄酮提取率最大;当提取时间延长时，提取率却
随之下降。因 50% ～60%提取率下降，故进行了 40%乙醇浓
度下提取，发现提取率下降。所以选择 70%乙醇为提取溶剂
(见图 3)。
2. 1. 4 提取温度对三叶青总黄酮提取率的影响:当提取温度
为 50℃时，总黄酮提取率最大;当提取温度下降时，提取率下
降;当提取温度升高时，提取率先下降后平稳。所以选择
50℃为提取温度(见图 4)。
图 3 乙醇浓度对三叶青
总黄酮提取率的影响
图 4 提取温度对三叶青
总黄酮提取率的影响
2. 2 响应曲面试验结果与分析
2. 2. 1 响应面数据统计与分析:应用 Design Expert 8. 0. 6 软
件设计试验方案〔12〕(见表 2)，按表 2 试验序号进行提取(见
表 2)。
表 2 试验设计与结果
试验
序号
试验因素
提取时间 A
(min)
料液比 B
(g·mL －1)
乙醇浓度 C
(%)
提取温度 D
(℃)
总黄酮
提取率
(%)
1 0 0 1 － 1 5. 10
2 － 1 － 1 0 0 4. 57
3 － 1 0 0 1 4. 85
4 0 － 1 0 － 1 4. 57
5 0 1 0 1 5. 23
6 0 － 1 1 0 4. 74
7 0 0 － 1 1 5. 13
8 1 0 0 － 1 5. 04
9 0 1 1 0 5. 10
10 0 1 0 － 1 5. 19
11 1 0 1 0 4. 80
12 0 0 0 0 4. 89
13 0 0 0 0 4. 73
14 0 － 1 － 1 0 4. 71
15 0 0 0 0 4. 74
16 0 1 － 1 0 5. 24
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海峡药学 2016 年 第 28 卷 第 3 期
续表 2
试验
序号
试验因素
提取时间 A
(min)
料液比 B
(g·mL －1)
乙醇浓度 C
(%)
提取温度 D
(℃)
总黄酮
提取率
(%)
17 1 0 － 1 0 5. 06
18 0 0 0 0 4. 68
19 0 0 1 1 4. 63
20 － 1 0 － 1 0 4. 93
21 － 1 0 1 0 4. 86
22 1 0 0 1 4. 62
23 1 1 0 0 4. 80
24 1 － 1 0 0 4. 26
25 － 1 0 0 － 1 4. 66
26 － 1 1 0 0 4. 56
27 0 0 － 1 － 1 4. 64
28 0 － 1 0 1 4. 37
29 0 0 0 0 4. 74
2. 2. 2 拟合模型的建立:应用 Design Expert 8. 0. 6 软件分析
试验结果，以供试品溶液总黄酮提取率 Y 为响应值，经回归
拟合后，得回归方程为:
Y = 1. 51417 + 0. 12733A － 0. 025B － 0. 086417C +
0. 14933D + 0. 0027AB － 0. 000 5AC － 0. 001525AD －
0. 00085BC + 0. 0012BD － 0. 002 375CD － 0. 00069167A2 －
0. 001167B2 + 0. 001670833C2 + 0. 000570833D2，式中，Y 为总
黄酮提取率%，A 为提取时间 /min，B 为料液比 /g·mL －1，C
为乙醇浓度 /%，D为提取温度 /℃。
表 3 回归方程系数及其显著性检验
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 Prob ＞ F
模型 1. 439 14 0. 103 4. 574 0. 0037＊＊
A-A 0. 002 1 0. 002 0. 083 0. 7769
B-B 0. 706 1 0. 706 31. 411 ＜ 0. 0001＊＊
C-C 0. 019 1 0. 019 0. 855 0. 3709
D-D 0. 010 1 0. 010 0. 429 0. 5232
AB 0. 073 1 0. 073 3. 245 0. 0932
AC 0. 010 1 0. 010 0. 445 0. 5155
AD 0. 093 1 0. 093 4. 141 0. 0613
BC 0. 007 1 0. 007 0. 322 0. 5796
BD 0. 014 1 0. 014 0. 641 0. 4367
CD 0. 226 1 0. 226 10. 043 0. 0068＊＊
A2 0. 031 1 0. 031 1. 381 0. 2595
B2 0. 006 1 0. 006 0. 246 0. 6279
C2 0. 181 1 0. 181 8. 060 0. 0131*
D2 0. 021 1 0. 021 0. 941 0. 3485
残差 0. 315 14 0. 022
失拟项 0. 287 10 0. 029 4. 192 0. 0899
纯误差 0. 0274 4 0. 00685
总离差 1. 7533 28
＊＊表示极显著(P ＜ 0. 01)，* 表示显著(P ＜ 0. 05)
由 F检验判定，当“Prob ＞ F”值小于 0. 05 即表示该项指
标显著。模型回归方程方差分析结果(见表 3)。由表 3 分析
可知，整体模型 P值(0. 00037)小于 0. 01，表明二次方程模型
高度显著，料液比(P值 ＜ 0. 0001)影响高度显著，而其他 3 项
P值均大于 0. 1，说明响应值变化非常复杂，各个试验因素对
响应值的影响非简单的线性关系，而存在二次关系，且四因素
间存在交互作用。同时可知，在所选的因素范围内，按照对结
果的影响排序，料液比 ＞乙醇浓度 ＞提取温度 ＞提取时间。
2. 2. 3 因素间的交互作用:响应曲面图形是提取时间、液料
比、乙醇浓度、提取温度之间所构成的等高线图和三维空间曲
面图。由图 5 ～ 7 可知，提取时间增大时，三叶青中总黄酮提
取率先增大后平稳;由图 5，8，9 可知，料液比增大，提取率增
大;图 6，8，10 表明，乙醇浓度增大时，提取率先降低后增大;
图 7，9，10 表明，提取温度增大时，提取率缓慢增大或较平稳。
综上所述，结合实际生产，三叶青总黄酮最佳提取工艺条件确
定为提取时间 44min，料液比 1∶ 20，乙醇浓度 60%，提取温度
60℃，三叶青中总黄酮最大提取率为 5. 55%。为了便于控制
时间，提取时间取 44min。
图 5 提取时间与料液比对总黄酮提取影响的
等高线图和曲面图
图 6 提取时间与乙醇浓度对总黄酮提取影响的
等高线图和曲面图
图 7 提取时间与提取温度对总黄酮提取影响的
等高线图和曲面图
图 8 料液比间与乙醇浓度度对总黄酮提取影响的
等高线图和曲面图
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Strait Pharmaceutical Journal Vol 28 No. 3 2016
图 9 料液比与提取温度对总黄酮提取影响的
等高线图和曲面图
图 10 乙醇浓度与提取温度对总黄酮提取影响的
等高线图和曲面图
2. 3 验证试验 按照最佳提取工艺进行 6 次重复验证试验，
计算总黄酮提取率分别为 5. 42%，5. 44%，5. 49%，5. 48%，
5. 43%，5. 47%，平均提取率为 5. 455%，相对误差为 1. 71%。
说明该提取工艺稳定可行。
3 结论与讨论
响应曲面法可分析各因素之间的交互作用，且具有较好
的试验精度，在药学领域的运用越来越广泛。本试验采用响
应曲面法测定三叶青块根中总黄酮提取率，探究提取时间、料
液比、乙醇浓度和提取温度对三叶青中总黄酮提取率的影响。
结果显示，三叶青总黄酮最佳提取工艺参数为:提取时间
44min，料液比 1:20，乙醇浓度 60%，提取温度 60℃，实际三叶
青总黄酮最大得率为 5. 455%。
三叶青为民族植物药，山奈酚、槲皮素等黄酮类成分为其
活性成分〔13〕，具有显著的药理作用。野生三叶青产量少，价
格昂贵。本试验可知，林下种植的三叶青的总黄酮得率大于
5%，对林下三叶青药材进一步开发利用提供依据。
参考文献
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不同产地槐米炮制前后主成分的含量变化对 α-葡萄糖苷酶活性抑制的影响
阮氏霞，崔玲玲，袁永亮，杨中林* (中国药科大学中药学院 南京 210009)
摘要:目的 比较研究 10 批不同产地槐米炒制前后对槐米中芦丁，槲皮素的含量变化及其对 α-糖苷酶活性抑制作用的影响。方法 对 10 批
不同产地的槐米药材分别进行炒制，采用高效液相色谱法分别测定各槐米药材提取液中芦丁和槲皮素含量; 以对硝基苯酚-β-1，4-葡萄糖苷
( pNPG) 为底物，阿卡波糖为阳性对照，测定各槐米药材提取液对 α-葡萄糖苷酶活性抑制率，比较了芦丁和槲皮素含量变化对 α-葡萄糖苷酶的
抑制活性的影响。结果 经过炒制后，10 批槐米炒制品中的芦丁含量均有所降低，而槲皮素含量则明显升高;槐米炒制品对 α-糖苷酶活性抑制
作用均优于生品。结论 不同产地槐米炮制后，由于槲皮素含量的普遍升高，导致了槐米炒制品对 α-葡萄糖苷酶活性抑制作用升高，表明槲皮
素在对 α-糖苷酶抑制活性起着重要作用。在治疗糖尿病疾病时选用炒制槐米更为合理。
关键词:槐米;炮制;芦丁;槲皮素; α-糖苷酶
中图分类号:R927. 2 文献标识码:A 文章编号:1006-3765(2016)-03-12109-0048-04
作者简介:阮氏霞，女(1988 －)。中国药科大学硕士研究生。研究方向为中药新药研发。联系电话:13951961745，E-mail:ruanshixia@ 163. com
通讯作者:杨中林，女(1950 －)。中国药科大学教授。职称:博士生导师。研究方向为中药新药研发。E-mail:YZL1950@ 126. com
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海峡药学 2016 年 第 28 卷 第 3 期