全 文 ：泸州医学院学报 2013 年 第 36 卷 第 4 期
Journal of Luzhou Medical College Vol.36 No.4 2013
青果多酚对人宫颈癌 Hela细胞增殖与凋亡的影响 *
向丽，叶迎春，胡晓艳，王光西，周铁军 1
（泸州医学院病原生物学教研室；1病理学教研室，四川泸州 646000）
摘 要 目的：研究青果多酚对体外培养的人宫颈癌 Hela 细胞增殖与凋亡的影响。 方法：利用超声波提取青果多酚，分光光
度法检测其含量，采用 MTT 法、免疫细胞化学法、流式细胞术检测 Hela 细胞增殖抑制率与凋亡情况。 结果：青果多酚对 Hela 细
胞的增殖有明显抑制作用，并存在时间和剂量依赖性；青果多酚可通过激活 caspase-3 促进细胞的凋亡。 结论：青果多酚对 Hela
细胞有抑制增殖和促进凋亡的作用。
关键词 青果；多酚；Hela 细胞；增殖与凋亡
中图分类号 R393 文献标识码 A doi:10.3969/j.issn.1000-2669.2013.04.008
Effect of polyphenol from Fructus Canarii on proliferation
and apoptosis of Hela cells
Xiang Li， Ye Yingchun， Hu Xiaoyan， Wang Guangxi， Zhou Tiejun1
Department of Pathogen Biology， 1Department of Pathology， Luzhou Medical College
Abstract Objective: To study the effect of polyphenol from Fructus Canarii on proliferation and apoptosis of
Hela cells in vitro. Methods: Polyphenol from Fructus Canarii was extracted by ultrasonic ethanol method and
was tested by spectrophotometry with Folin -Ciocalteu reagent and standard of Gallic acid. The effect on
proliferation and apoptosis in Hela cells was tested by MTT assay， immunocytochemical methods， and flow
cytometry. Results: Polyphenol from Fructus Canarii could obviously inhibit the proliferation of Hela cells in a
time-and dose -dependent manner. Polyphenol could induce apoptosis by stimulating caspase -3. Conclusion:
Polyphenol from Fructus Canarii could inhibit proliferation and induce apoptosis of Hela cells in vitro.
Key words Fructus Canarii； Polyphenol； Hela cells； Proliferation and Apoptosis
* 泸州市科技计划项目（[2010]128 号）
作者简介：向丽（1977-），女，讲师，硕士
通讯作者：周铁军（1977-），男，副教授
青果 (Fructus Canarii)别名橄榄，为橄榄科植物
橄榄的干燥成熟果实，具有清热、利咽、生津、解毒的
功效。研究显示，以没食子酸为主的多酚物质是其最
重要的药效成分，具有抗菌、抗病毒、抗氧化和抗肿
瘤作用[1-4]，具有较高的药用价值。近年对茶多酚抗肿
瘤机制的研究报道较多， 本研究探讨了青果多酚提
取物在体外对人宫颈癌 Hela 细胞增殖和凋亡的影
响。
1 材料与方法
1.1 材料
人宫颈癌 Hela 细胞株（重庆医科大学病理教研
室馈赠）；RPMI-1640培养液 （赛默飞世尔生物化学
制品有限公司）； 胎牛血清 （北京元亨公司）；MTT
（Sigma公司）；青果（购自泸州宝光医药有限公司，选
择优质果实洗净，风干，粉碎）；兔抗人 caspase-3 单
克隆抗体 （Sigma 公司 ）；Annexin V-FITC （美国
Beckman Coulter 公司）；碘化丙啶（南京凯基生物科
技发展有限公司）； 没食子酸标准品 （批号 MUST-
10080401，纯度≥98%，中国食品药品检定所）；酚试
剂（上海源聚生物科技有限公司）。
1.2 方 法
1.2.1 青果多酚的制备及含量检测[5]
称取青果烘干果实 30 g，加入 600 ml 40%乙醇
（固液比=1∶20），超声萃取，功率 40 W，工作时间 t=
论著
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45 min，上清液抽滤，旋转蒸发器蒸发浓缩后定容为
30 ml，加入 40 ml 甲醇、80 ml 氯仿，萃取 5h。取上层
非脂质部分， 旋转蒸发器蒸发浓缩后 0.45 μm 滤膜
过滤，定容至 5 ml，分光光度法检测多酚含量。
1.2.2 细胞培养及细胞悬液的制备
RPMI-1640 培养液，加入 1%青霉素-链霉素混
合液、10%胎牛血清，Hela 细胞于培养液中在 37℃、
饱和湿度、5% CO2培养箱中常规培养， 细胞贴壁生
长，0.25%胰酶消化传代。 选对数生长期细胞进行试
验。
1.2.3 MTT 法检测青果多酚对 Hela 细胞增殖的影
响
将青果多酚用 PBS（pH 7.2~7.4）溶解，过滤除
菌，稀释为不同浓度。 调整细胞浓度为 105/ml，每孔
100 μl接种于 96孔板，置 CO2培养箱常规培养，24 h
后弃去培养液， 加入不同浓度青果多酚 100 μl/孔
（终浓度为 20、40、80、160、320 μg/ml）， 每组设 6 个
复孔， 同时设细胞对照孔和空白对照孔， 分别培养
24 h、48 h、72 h，加 MTT（5 mg/ml）20 μl/孔，继续孵
育 4 h，弃上清液，加入二甲基亚砜 150 μl/孔，振荡
10 min， 选择 490nm 波长， 酶标仪测定吸光度值
（A）。 实验重复 3次，取各平行孔 A值的平均值。
肿瘤细胞增殖抑制率=（1-药物处理组平均 A
值/细胞对照组平均 A值）×100%。
1.2.4 流式细胞术检测青果多酚对 Hela 细胞凋亡
的影响
调整细胞浓度为 105/ml， 每孔 2 ml 接种于 6 孔
板，待细胞贴壁后，加入不同浓度青果多酚（终浓度
为 20、40、80、160、320 μg/ml），设细胞对照孔，每组
设 6 个复孔， 置 37℃，5% CO2培养箱中培养 24 h、
48 h、72 h后，0.25%胰酶消化后制成细胞悬液。 PBS
洗涤 2 次， 调整细胞浓度为 5×106/ml 后分别加入
Annexin V-FITC 和 PI（碘化丙啶）混匀，置冰上避光
孵育 10 min，每管加入 400 μl 缓冲液，轻柔混匀，流
式细胞仪上机分析，用 EXPO32软件分析结果。
1.2.5 免疫细胞化学检测青果多酚对 Hela 细胞 cas-
pase-3表达的影响
将浓度为 105/ml 的细胞接种于预置盖玻片的 6
孔培养板中，待细胞贴壁后，分别加入不同浓度的青
果多酚（终浓度为 20、40、80、160、320 μg/ml），以未
加青果多酚作为阴性对照组，作用 24h、48h、72h 后，
取出盖玻片，4%中性甲醛固定， 流水冲洗后 PBS 洗
2次。过氧化氢孵育 20 min，PBS冲洗后，滴加 100 μl
一抗 （1∶100），4℃冰箱过夜， 滴加二抗， 室温孵育
30min，DAB 显色，复染，酸酒精褪色，梯度酒精脱水
后封片。Caspase-3阳性颗粒位于细胞浆，呈棕黄色。
染色后的每张细胞爬片随机选取 5 帧图像， 采用
Image-pro plus 6.0图像分析系统，以 IOD /（N* area）
值作为统计指标。
1.3 统计学处理
测量数据用均数±标准差表示， 采用 SPSS11.5
软件处理，多组均数比较采用方差分析，组间多重比
较采用 LSD检验。以 P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 青果多酚对 Hela细胞增殖的影响
MTT结果显示，不同浓度青果多酚对 Hela 细胞
的增殖均有抑制作用，且随作用时间的延长，浓度的
增加，其抑制作用越明显，同一时间段各浓度组细胞
抑制率与对照组比较差异有统计学意义 （P<0.05），
同一浓度组不同时间段细胞抑制率比较差异也有统
计学意义（P < 0.05），呈现时间、剂量依赖性（表 1）。
表 1 青果多酚对人 Hela 细胞增殖的影响(x ± s，n = 6)
青果多酚
浓度（μg/ml）
对照
20
40
80
160
320
24h
A 值 抑制率(%)
0.471±0.006
0.441±0.006a 6.369
0.428±0.006a 9.130
0.405±0.004a 14.013
0.367±0.005a 22.081
0.323±0.004a 31.423
48h
A 值 抑制率(%)
0.662±0.006
0.611±0.005a 7.704
0.581±0.006a 12.236
0.534±0.004a 19.335
0.425±0.007a 35.801
0.383±0.005a 42.145
72h
A 值 抑制率(%)
0.827±0.005
0.726±0.006a 12.213
0.622±0.006a 24.788
0.516±0.004a 37.606
0.394±0.004a 52.358
0.272±0.007a 67.110
2.2 青果多酚对 Hela细胞凋亡的影响
青果多酚作用于 Hela 细胞后能有效诱导其凋
亡，并随着作用时间的延长，浓度的增加，凋亡细胞
相应增加， 同一时间段各浓度组细胞凋亡率与对照
组比较差异有统计学意义（P < 0.05），且同一浓度组
不同时间段细胞凋亡率比较差异也有统计学意义
注：各浓度组分别与对照组比较 a P < 0.01
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（P < 0.05），呈现时间、剂量依赖性（表 2）。
表 2 青果多酚对人 Hela 细胞凋亡的影响(x±s，n = 6)
青果多酚
浓度（μg/ml）
对照
20
40
80
160
320
24h
0.625±0.047
3.372±0.064a
8.473±0.320a
16.776±0.400a
28.648±0.480a
40.570±0.467a
48h
1.351±0.036
5.360±0.052a
11.473±0.245a
27.227±0.358a
38.445±0.417a
52.493±0.488a
72h
2.677±0.064
10.248±0.068a
22.688±0.127a
43.775±0.104a
58.740±0.109a
77.655±0.1.06a
凋亡指数（%）
注：各浓度组分别与对照组比较 a P < 0.01
2.3 青果多酚对 Hela细胞 caspase-3表达的影响
免疫细胞化学结果显示，青果多酚作用 24、48、
72h，caspase-3 蛋白阳性表达细胞的平均光密度值
逐渐增高， 各浓度组细胞平均光密度值与对照组比
较差异有统计学意义 （P < 0.05）；20、40μg/ml 组
caspase-3 阳性表达细胞的平均光密度值各时间组
比较， 差异无统计学意义 （P > 0.05）； 而 80、160、
320μg/ml 组随着时间的延长，caspase-3 蛋白阳性表
达逐渐增高，各时间组平均光密度值比较，差异有统
计学意义（P < 0.05，表 3）。
表 3 青果多酚对人 Hela 细胞 caspase-3 表达的影响(x±s，n=5)
青果多酚
浓度（μg/ml）
对照
20
40
80
160
320
24h
0.248±0.029
0.315±0.016ab
0.324±0.029ab
0.344±0.035a
0.358±0.024a
0.368±0.044a
48h
0.262±0.025
0.326±0.022ab
0.337±0.030ab
0.471±0.019a
0.586±0.025a
0.681±0.023a
72h
0.272±0.018
0.336±0.025ab
0.349±0.028ab
0.554±0.037a
0.677±0.039a
0.811±0.051a
IOD /（N * area）
注：各浓度组分别与对照组比较 a P < 0.01；各时间组比
较 b P > 0.05
3 讨 论
化疗作为肿瘤治疗的一种辅助性手段， 因耐药
性及毒副作用的产生常常容易导致治疗失败。 因此
寻找高效低毒的抗肿瘤药物或者化疗增敏剂， 对肿
瘤治疗具有重要意义。植物是抗癌药的主要来源，如
泰素、喜树碱、长春新碱等均为植物抗肿瘤药物，药
用植物可通过诱导肿瘤细胞凋亡、 干扰肿瘤新生血
管、抑制端粒酶活性、逆转肿瘤多药耐药等机制发挥
抗肿瘤作用[6-7]。 同时天然物质还可以为许多药物提
供先导结构， 以此为模板可以合成许多生物活性更
强的化合物。植物多酚是一类广泛存在于蔬菜、水果
和药用植物内的多元酚化合物， 含多酚较多的常见
植物超过 600种，在某些中药中其含量可达 70％，其
在全球形成了数亿万吨的可再生资源。何志勇等[8]采
用 Folin-Ciocaheus 比色法测定青果果实中酚类含量
为 1.5％，多酚类成分非常丰富，远高于一般的水果，
并且酚类成分主要集中在果肉部分， 果肉中的酚类
成分以含苯甲酰结构的酚酸类为主， 主要为没食子
酸和鞣花酸。
细胞凋亡是维持细胞增殖和死亡动态平衡中非
常重要的因素， 细胞凋亡功能的丧失或者受到抑制
是肿瘤发生的一个非常重要的因素[9]。因此在肿瘤的
治疗中， 是否能诱导肿瘤细胞凋亡是临床上判断肿
瘤治疗成败的关键之一。 有研究表明青果多酚具有
较强的抗氧化、抗肿瘤及抗老化功效。通过减少诱变
剂的致癌作用，增强细胞对染色体修复能力，从而达
到抑制肿瘤细胞生长。 Karna等[10]发现土豆中的多酚
在体内和体外均可诱导人前列腺癌 PC-3 细胞凋
亡， 同时发现凋亡调节分子 Bcl-2 失活，BAX 上调、
细胞色素 C释放及下游凋亡信号被激活。 Thakur等[11]
发现绿茶多酚类似于组蛋白去乙酰化酶抑制剂，其
作用于人前列腺癌 LNCaP 细胞（表达 p53）和 PC-3
细胞（缺乏 p53）24h，对Ⅰ类组蛋白去乙酰化酶活性
及蛋白表达产生剂量依赖性抑制作用， 阻滞两种细
胞 G0-G1周期，诱导凋亡。 本研究发现不同浓度的青
果多酚对 Hela 细胞的增殖均有抑制作用，并能有效
诱导细胞凋亡，且随着时间的延长、浓度增高而更加
明显，均呈现时间、剂量依赖，说明青果多酚可通过
诱导细胞凋亡来抑制 Hela细胞的生长。
细胞凋亡的发生和发展通过信号传递、中央调
控和结构改变三个阶段， 多个信号通路来实现的。
caspase 为天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白水解酶，是
可介导细胞凋亡的水解酶 ， 其家族成员较多 [12]。
caspase-3 是其中最重要的凋亡执行者，以无活性的
酶原形式存在于细胞中， 在细胞凋亡早期阶段被激
活，裂解细胞质及胞核底物，导致细胞凋亡的发生，
是细胞凋亡激活的关键蛋白激酶和效应器 [13]。 本研
究表明，青果多酚作用 Hela 细胞后，随着作用时间
和浓度的增加，caspase-3 的表达逐渐增高， 特别是
高浓度 80、160、320 μg/ml组作用尤为明显。 说明青
果多酚可能通过上调 Hela 细胞中 caspase-3 蛋白的
表达，促进肿瘤细胞的凋亡。
综上所述，青果多酚在体外通过抑制 Hela 细胞
生长， 激活 caspase-3蛋白进而激活 caspase蛋白酶
家族诱导细胞凋亡发生，从而达到抗肿瘤作用。但是
因为青果提取物化学成分复杂， 是否存在不同成分
第 4 期 向丽等：青果多酚对人宫颈癌 Hela 细胞增殖与凋亡的影响 345
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间的协同作用， 以及其与现有的化疗药物有无交叉
反应，对化疗是否起到增敏作用，这些问题还需要进
一步研究证实。
参 考 文 献
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