全 文 ：作者单位:310003 杭州，浙江大学医学院附属儿童医院(李华
美) ;310007 杭州 ，浙江省中医药研究院(魏克民)
通讯作者:李华美，电子信箱:lihuamei333@ sohu． com
三叶青乙酸乙酯提取物对小鼠 Lewis肺癌的抑制作用
李华美 魏克民
摘 要 目的 探讨三叶青乙酸乙酯提取物对小鼠 Lewis 肺癌移植瘤的抑瘤效应及其作用机制。方法 采用动物移植性
肿瘤实验法腋下接种 Lewis肺癌细胞制备小鼠荷瘤模型。观察三叶青乙酸乙酯提取物对瘤重、抑瘤率的影响;并用 TUNEL 法检
测肿瘤细胞凋亡，免疫组化法和 real time RT － PCR法检测瘤组织中 Bcl － 2、Bax、caspase － 3 的表达。结果 三叶青各剂量组抑
瘤率和肿瘤细胞凋亡率均高于模型对照组(P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01) ，其效应呈浓度依赖性;各剂量组 Bcl － 2 的蛋白和 mRNA表达
下降(P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01)、Bax的蛋白和 mRNA表达上升(P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01)、高剂量组 caspase － 3 的蛋白表达上升(P ＜
0. 05)。结论 中药三叶青乙酸乙酯提取物能抑制小鼠 Lewis肺癌细胞的生长，可能与其促进肿瘤细胞坏死及下调 Bcl － 2、上调
Bax和 caspase － 3 从而促进肿瘤细胞凋亡有关。
关键词 三叶青 乙酸乙酯 肺癌 凋亡 Bcl － 2 Bax caspase － 3
Inhibition Effect of the Ethylacetate Extract of Tetrast Igmatis － hemsleyani on C57BL /6J Mice with Lewis Lung Cancer． Li Huamei，Wei
Kemin． Department of Central Laboratory，Children s Hospital Affiliated to the Medical College，Zhejiang University，Zhejiang 310003，
China
Abstract Objective To explore the antitumor effect and the mechanism of The ethylacetate extract of tetrastigmatis hemsleyani in
C57BL /6J mice with lewis lung cancer． Methods Lewis lung tumor cultured in vitro was transplanted into subaxillas of mice to establish
animal models with transplanted tumor． The tumor weight，the rates of tumor inhibition were recorded． Moreover，apoptosis rate was detec-
ted by TUNEL，and the expressions of Bcl － 2 and Bax in tumor tissue were detected through immun － ohistochemical method and realtime
RT － PCR． Results After treating with tetrastigmatis hemsleyani，the rates of tumor inhibition and apoptosis rate increased in dose de-
pendent manner，the protein and mRNA expression of Bcl － 2 decrease in all dose groups in creased (P ＜ 0． 05 or P ＜ 0． 01) ，the protein
and mRNA expression of Bax increased in all dose group(P ＜ 0． 05 or P ＜ 0． 01) ，the protein expression of caspase － 3 increased in high
dose group(P ＜ 0． 05)． Conclution The ethylacetate extract of tetrastigmatis hemsleyani can inhibited Lewis solid tumor growth． The
mechanism may be associated with promotion of necrosis and up － regulation of Bcl － 2 and down － regulation of Bax and Caspase － 3．
Key words Tetrastigma hemsleyanum;Ethylacetate;Lung cancer;Apoptosis;Bcl － 2;Bax;Caspase － 3
目前，肺癌的发病率居高不下，其治疗仍是困扰
医学界的世界性难题。中药因其不仅对肿瘤具有抑
制作用，且不易产生耐药性，对机体的损伤和不良反
应也较小，已经成为治疗肿瘤的重要手段。从传统中
药中寻找高效、低毒的抗肿瘤药物已成为抗肿瘤药物
研究及新药开发的重要组成部分。三叶青(tetrastig-
ma hemsleyanum diels et gilg)属葡萄科崖爬藤属植
物，主要分布于长江以南各地，生于阴湿山坡、山沟或
溪谷旁林下，以块根或全草入药，具有清热解毒、祛风
化痰、活血止痛等功效［1］，临床多用于治疗小儿高热
惊厥、肺炎等症，现常用来防治各类肿瘤。为探讨三
叶青抗肿瘤作用的机制，更好的开发和利用三叶青，
本实验研究了三叶青乙酸乙酯提取物对 Lewis 肺癌
小鼠肿瘤的抑制作用，并探讨其作用机制。
材料与方法
1．药物:三叶青乙酸乙酯提取物制备:将 1kg三叶青用 8L
乙酸乙酯提取三次，萃取液回收乙酸乙酯后，置于冰箱中保存
备用［2］。
2．细胞株及实验动物:小鼠 Lewis 肺癌细胞株和 C57BL /
6J小鼠，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供;饲料由浙
江省实验动物中心提供;实验动物喂养及造模在浙江省中医
药研究院进行。
3．造模方法:取接种 Lewis肺癌 l0 ～ 14 天的 C57BL /6J荷
瘤小鼠 3 只，颈脱臼处死，无菌条件下取瘤组织，剥离血管及
黏附的其他组织，在无菌平皿中剪碎，置组织研磨器中加
4℃生理盐水，轻轻研磨过滤，制成瘤细胞悬液，0． 4%台盼蓝
计数，细胞活力大于 95%，调整细胞为 1 × 107 /ml。消毒小鼠
右前腋，取 0． 2ml上述瘤细胞混悬液接种于小鼠右前肢腋窝
皮下建立模型。
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4．动物分组:小鼠接种 24h后随机分组、编号，分为 4 组:
模型对照组 10 只、三叶青高剂量组 10 只、三叶青中剂量组 10
只、三叶青低剂量组 10 只。
5．给药方法:将三叶青乙酸乙酯提取物用无菌蒸馏水配
制成低(相当于生药 500g /L)、中(相当于原药 1500g /L)、高
(相当于原药 2500g /L)3 个浓度，于小鼠瘤细胞接种后 24h开
始每天灌胃给药，每只 0． 2ml(模型对照组给予等体积的生理
盐水) ，连续给药 14 天。
6．凋亡检测、计算凋亡指数:凋亡采用 TUNEL染色法，试
剂由 TaKaRa公司提供，操作步骤严格按照试剂盒说明书进
行。每次都设立阴性对照，阴性对照 TUNEL 反应液中不含
TdT，阳性对照用 DNA 酶处理切片 10min。TUNEL 的测量:每
张切片在 200 倍视野下计数交界区 200 个以上细胞中染色阳
性的细胞数，换算成凋亡指数。凋亡指数 =视野内的阳性细
胞数 /视野内总细胞数 × 100%。
7．免疫组织化学技术检测肿瘤组织 Bcl － 2、Bax、caspase
－ 3 蛋白的表达:肿瘤组织用中性缓冲甲醛固定后，石蜡包
埋。Bax、Bcl － 2 多克隆抗体购自美国 santa cruz公司，caspase
－ 3 多克隆抗体购自 LabVision NeoMarkers 公司，采用丹麦
DAKO公司 EnVisionTM二步法，操作步骤按试剂盒说明书进
行。以 PBS代替一抗作阴性对照，已知的阳性切片作阳性对
照。使用 Image － ProPlus 5． 0 图像分析软件半定量测量光密
度，即每张切片随机采集 5 个视野(× 200 倍) ，经过该系统自
动分析获得该 5 个视野的光密度值的平均值。
8． Real time RT － PCR 检测肿瘤凋亡因子 Bcl － 2、Bax、
caspases － 3 的表达:采用 Axygen公司试剂盒从液氮保存瘤组
织中提取总 RNA，用紫外分光光度计测其纯度并定量，琼脂糖
凝胶电泳测其完整性，然后用 TaKaRa公司反转录试剂盒将其
反转录成 cDNA。Real time PCR 反应采用 TaKaRa 公司的试
剂盒，反应条件见表 1。
表 1 Realtime RT － PCR反应条件
组别
初始变性 变性 退火 /延伸
温度℃ 时间(min) 循环数 温度℃ 时间(s) 循环数 温度℃ 时间(s) 循环数
Bax 95 2 1 95 15 40 60 45 40
Bcl － 2 /Caspase － 3 95 2 1 95 15 40 62 45 40
9．统计学方法:采用 SPSS 11． 0 软件分析，各药物浓度组
与对照组的比较采用 Dunnett t 检验，不同药物浓度组间的比
较采用完全随机设计的方差分析，其中各组坏死程度的比较
采用秩和检验，以 P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。
结 果
1．三叶青乙酸乙酯提取物对小鼠瘤体的抑制作
用:肺癌移植瘤小鼠经 14 天药物作用后，所有小鼠皮
下均有肿瘤生长，三叶青各组肿瘤质量均低于模型对
照组，与模型对照组相比有显著差异 (P ＜ 0． 05 或 P
＜ 0． 01) ，且随着药物剂量的增大，瘤体质量逐渐减
轻，抑瘤率逐渐增高。三叶青各剂量组之间比较，均
有显著性差异(P ＜ 0． 05) ，见表 3。
表 2 三叶青提取物对荷瘤小鼠抑瘤率的影响(x ± s)
组别 n 瘤重(g) 抑瘤率(%)
模型对照组 10 2． 64 ± 0． 52
三叶青高剂量组 10 1． 72 ± 0． 33▲▲ 34． 85
三叶青中剂量组 10 2． 02 ± 0． 24▲ 23． 49
三叶青低剂量组 10 2． 20 ± 0． 23▲ 16． 67
统计方法:单因素方差分析，与模型组相比，▲ P ＜ 0． 05，▲▲ P ＜
0. 01
2．三叶青对小鼠肺癌移植瘤组织细胞凋亡率的
影响:凋亡细胞表现为细胞核固缩，细胞核变圆，经
TUNEL染色后细胞核为棕黄色。本实验结果显示，
对照组只见少量散在的凋亡细胞，而三叶青各组凋亡
细胞有不同程度的增多，凋亡指数增加，与对照组比
较，均有统计学显著性差异(P ＜ 0． 01) ，并且随着三
叶青药物浓度的增加，凋亡指数也相应增加，呈现量
效依赖性关系。各剂量组两两比较，高剂量组与中、
低剂量组均有显著性差异，而中、低剂量组之间无显
著性差异。见表 4、图 2。
表 3 三叶青提取物对荷瘤小鼠凋亡指数的影响(x ± s)
组别 n 凋亡指数(%)
模型对照组 10 3． 22 ± 0． 98
三叶青高剂量组 10 13． 27 ± 3． 42▲
三叶青中剂量组 10 10． 22 ± 2． 54▲
三叶青低剂量组 10 9． 25 ± 2． 55▲
与模型组相比，▲P ＜ 0． 01
3． 三叶青对荷瘤小鼠凋亡因子 Bax、Bcl － 2、
caspase － 3 蛋白表达的影响:Bax 和 Bcl － 2 阳性定位
于肿瘤细胞的胞质内和或胞膜呈黄色或棕黄色，细胞
核染衬呈蓝色。caspases － 3 阳性定位于肿瘤细胞的
部分胞质内呈黄色或棕黄色，细胞核衬染呈蓝色。结
果表明，三叶青各治疗组 Bax平均光密度均大于对照
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医学研究杂志 2012 年 9 月 第 41 卷 第 9 期 ·论 著·
图 1 各组肿瘤组织凋亡率检测(TUNEL法，× 400)
A．模型对照组;B．三叶青低剂量组;C．三叶青中剂量组;D．三叶青高剂量组
表 4 三叶青提取物对 Bax、Bcl －2、caspase －3 免疫组化平均光密度的影响(x ± s)
组别 n Bax Bcl － 2 caspase － 3
模型对照组 10 0． 277 ± 0． 045 0． 346 ± 0． 055 0． 117 ± 0． 065
三叶青高剂量组 10 0． 333 ± 0． 046▲ 0． 253 ± 0． 034▲▲ 0． 188 ± 0． 033▲▲
三叶青中剂量组 10 0． 335 ± 0． 039▲ 0． 272 ± 0． 029▲ 0． 105 ± 0． 021
三叶青低剂量组 10 0． 304 ± 0． 051 0． 270 ± 0． 037▲ 0． 121 ± 0． 025
与模型组相比，▲P ＜ 0． 05，▲▲P ＜ 0． 01
组，其中三叶青高、中剂量组与对照组比较有明显差
异(P ＜ 0． 05) ，而高、中剂量组之间比较没有显著性
差异;三叶青各治疗组 Bcl － 2 平均光密度均小于对
照组，其中三叶青高、中、低剂量组与模型对照组比较
有显著性差异(P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01) ，而各剂量组之
间比较没有显著性差异。三叶青各剂量组均能提高
caspase － 3 的表达，其中只有高剂量组与对照组相比
有显著性差异(P ＜ 0． 01) ，见表 5、图 3 ～图 5。
4． 三叶青乙酸乙酯提取物对小鼠 Bcl － 2、Bax、
caspases － 3 mRNA 表达的影响:三叶青各剂量组对
小鼠 Bcl － 2、Bax、caspases － 3 mRNA 表达的影响见
图，与模型对照组相比，三叶青各剂量组均能提高
Bax mRNA的表达(P ＜ 0． 01) ，但各剂量组之间比较
均无显著性差异(P ＞ 0． 05) ;与对照组相比，三叶青
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·论 著· J Med Res，Sep 2012，Vol． 41 No． 9
图 5 三叶青乙酸乙酯提取物对小鼠 Bax、Bcl －2、caspases －3 mRNA表达的影响
各治疗组均能降低 Bcl － 2 mRNA 的表达，各剂量组
之间相比，无显著性差异(P ＞ 0. 05) ，各治疗组
caspase － 3 mRNA与模型对照组比较，无明显差异(P
＞ 0. 05)。
讨 论
本研究小组成员丁刚强等［2］前期实验研究发现:
三叶青提取物对人肝癌细胞 HepG2 活性具有较强的
抑制作用，且以乙酸乙酯提取物的作用为最强。笔者
选用乙酸乙酯提取三叶青有效成分进行动物体内的抗
肺癌移植瘤的研究，并进一步研究其作用机制。
部分中药具有抗肿瘤作用已得到公认，但具体的
作用机制还在进一步的研究中。凋亡是目前比较公
认的一个重要机制，是一个基因调控的程序性细胞死
亡过程，其中 Bcl － 2 家族蛋白及 caspase 家族蛋白酶
在细胞凋亡中发挥着重要的作用。Bcl － 2 家族中最
具代表性的是抑制凋亡蛋白 Bcl － 2 和促进凋亡蛋白
Bax。Bcl － 2 基因蛋白家族形成的通道是线粒体凋
亡途径的主要调节因子［3］ Bcl － 2 基因产物主要定位
在线粒体膜、核模及内质网上，细胞凋亡减弱时，Bcl
－ 2 表达增强;反之，细胞凋亡增强时，Bcl － 2 表达减
弱。以单体形式存在于胞质的 Bax在受到凋亡刺激时
构象发生变化，导致 Bax 寡聚体形成并整合到线粒体
外膜上，使线粒体外膜通透性增加，使游离的 cyt － c释
放至胞质，然后通过激活一系列下游基因，促进下游
caspases酶的活化来促进凋亡 ［4． 5］。Bax 基因不但直
接促进细胞凋亡，而且有拮抗 Bc1 － 2 的抑制凋亡作
用［6． 7］。caspase家族以非活性的蛋白酶形式存在于细
胞质中，当它们被激活后，蛋白酶分解并按照一定的顺
序逐级活化或灭活，从而引起细胞凋亡 。其中 caspase
－3被认为是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，
在细胞凋亡过程中则处于中心地位，是细胞凋亡的主
要效应因子［8，9］。因此，笔者选择 Bcl － 2、Bax、Caspase
－3作为研究对象，研究三叶青抗肿瘤的机制。
研究显示三叶青能促进 Bax mRNA的表达，降低
Bcl － 2 mRNA的表达，但没有增强 caspase － 3 mRNA
的表达，可能是因为存在其他途径作用于 caspase －
3m RNA的表达 。另外三叶青虽然没有改变 caspase
－ 3 mRNA的表达，但增强了其蛋白的表达，提示三
叶青可能作用于其蛋白质翻译的某个环节，具体机制
有待进一步研究。
本研究结果显示，三叶青乙酸乙酯提取物能明显
抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞的坏死及凋亡，
进一步的研究显示三叶青可能通过提高 Bax、caspase
－ 3 的表达，降低 Bcl － 2 的表达来发挥其促凋亡的抗
肿瘤作用。
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医学研究杂志 2012 年 9 月 第 41 卷 第 9 期 ·论 著·