全 文 ：离子色谱法测定三叶青多糖中单糖组成
饶君凤１，吕伟德１，倪承珠２，朱　军１
（１．杭州职业技术学院，浙江 杭州３１００１８；２．浙江大学化学系，浙江 杭州３１００２８）
摘　要：建立离子色谱－脉冲安培法（ＩＣ－ＰＡＤ）测定三叶青多糖中单糖组成的方法。方法：三叶青块根、
叶子中的粗多糖采用水提、醇沉法提取，采用２ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸在１００℃下水解粗多糖。采用ＣａｒｂｏＰａｃ
ＰＡ１０分析柱（４ｍｍ×２５０ｍｍ）分离，１０ｍｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠淋洗，流速为１．０ｍＬ／ｍｉｎ，采用脉冲安培法测定
三叶青多糖中岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖含量。结果：该方法线性范围宽，相关
性好（ｒ＞０．９９９，２），相对标准偏差为２．２０％～３．８０％，样品平均加标回收率为９８．０％～１１６．０％，最低
检出限为３．９５～２０．６１μｇ／Ｌ。结论：该实验方法简单、可靠，灵敏度高，具有一定的实用推广价值。
关键词：三叶青；多糖；离子色谱－脉冲安培法；单糖
中图分类号：Ｒ２８４．１　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１６７３－２１９７（２０１６）１２－００４２－０３
ＤＯＩ：１０．１１９５４／ｙｔｃｔｙｙ．２０１６１２０１７
收稿日期：２０１５－１１－２６
基金项目：浙江省自然科学基金（Ｎｏ．ＬＹ１３Ｂ０２０００１）
作者简介：饶君凤（１９６９－），女，浙江省杭州职业技术学院副教授，研究方向为中药品质评价和资源应用。
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｉｎ　Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｏｆ　Ｔｅｔｒａｓｔｉｇｍａｔｉｓ　Ｈｅｍｓｌｅｙａｎｉ
ｂｙ　Ｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｐｕｌｓｅｄ　Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
Ｒａｏ　Ｊｕｎｆｅｎｇ１，Ｌｖ　Ｗｅｉｄｅ１，Ｎｉ　Ｃｈｅｎｇｚｈｕ２，Ｚｈｕ　Ｊｕｎ１
（１．Ｈａｎｇｚｈｏｕ　Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ　＆Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｃｏｌｅｇｅ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３１００１８，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３１００２８，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｗｉｔｈ　ｐｕｌｓｅｄ　ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＩＣ－ＰＡＤ）ｗａｓ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｕ－
ｃｏｓｅ，ｒｈａｍｎｏｓｅ，ａｒａｂｉｎｏｓｅ，ｍａｎｎｏｓｅ，ｇｌｕｃｏｓｅ　ａｎｄ　ｇａｌａｃｔｏｓｅ　ｉｎ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｏｆ　Ｔｅｔｒａｓｔｉｇｍａｔｉｓ　ｈｅｍｓｌｅｙａｎｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ　ｐｏｌｙ－
ｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｗｅｒｅ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｂｙ　ｗａｔｅｒ－ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｌｃｏｈｏｌ－ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｗｅｒｅ　ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ　ｆｏｒ　２ｈａｔ　１００℃ｉｎ　２
ｍｏｌ／Ｌ　Ｈ２ＳＯ４．Ｔｈｅｙ　ｗｅｒｅ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｂｙ　ＣａｒｂｏＰａｃ　ＰＡ１０ｕｓｉｎｇ　１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ，ａｔ　ｆｌｏｗ－ｒａｔｅ　ｏｆ　１．０ｍＬ／ｍｉｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ
ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｓｈｏｗｅｄ　ｇｏｏｄ　ｌｉｎｅａｒｉｔｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　０．０１～２０ｍｇ／Ｌ．Ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ　ｆｏｕｎｄ　ｂｙ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ
ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　９８．０％～１１６．０％．Ｌｏｗ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｌｉｍｉｔｓ（ＬＯＤｓ）ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　３．９５～２０．６１μｇ／Ｌ　ａｎｄ　ｇｏｏｄ　ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ（ＲＳＤ＜
３．８％，ｎ＝６）ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｓｉｍｐｌｅ，ｒｅｌｉａｂｌｅ　ｎａｄ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｉｔ　ｗａｓ　ｗｏｒｔｈ　ａｐｐｌｙｉｎｇ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｔｅｔｒａｓｔｉｇｍａｔｉｓ　Ｈｅｍｓｌｅｙａｎｉ；Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ；Ｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｐｕｌｓｅｄ　Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；Ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ
　　三叶青（Ｔｅｔｒａｓｔｉｇｍａｔｉｓ　ｈｅｍｓｌｅｙａｎｉ）又名有角乌蔹莓、 石老鼠，为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤（Ｔｅｔｒａｓｔｉｇ

ｍａ
中钙、钠、铜的含量，结果显示不同样品中铜含量均较高，山
药中铜的含量为３．５４３～１１．４８９ｇ·ｋｇ－１；甘草中铜的含量为
５．５３０～１１．２３４ｇ·ｋｇ－１。样品中钠的含量均较低，不同产地
样品钠含量差异较大。本研究可为临床合理安全用药、产
品利用开发提供参考依据。
参考文献：
［１］　刘育辰，陈有根，王丹，等．甘草化学成分研究［Ｊ］．药物分析
杂志，２０１１，３１（７）：１２５１－１２５５．
［２］　袁书林．山药的化学成分和生物活性作用研究进展［Ｊ］．食品
研究与开发，２００８，２９（３）：１７６－１７９．
［３］　高晓雪．ＩＣＰ－ＭＳ法测定中国７个主产地的甘草中重金属的
含量［Ｊ］．安徽农业科学，２０１３，４１（２９）：１１６３６－１１６３７．
［４］　宋洪强，郝云彬，吴益春，等．原子荧光光度法中湿法消解、微
波消解、干灰化前处理法测定水产品中总砷含量的比较［Ｊ］．
浙江海洋学院学报，２０１０，２９（４）：３６７－３７２．
［５］　魏得良，黄熠，向牡秀，等．火焰原子吸收光谱法测定黄芪、甘
草、广藿香中的铜［Ｊ］．光谱实验室，２００７，２４（２）：１０６－１０８．
［６］　李军，郭海泉，白雁，等．火焰原子吸收分光光度法测定山药
药材中的微量元素含量的研究［Ｊ］．中医学报，２０１３，２８（１２）：
１８５７－１８５９． （编辑：尹晨茹）
—２４—
ｈｅｍｓｌｅｙａｎｕｍＤｉｅｌｓ　ｅｔ　Ｇｉｌｇ）［１］，三叶青全草均可入药，以地
下块根和果实的药用效果最好，目前以地下块根入药为主。
现代医学研究证实，三叶青对于高热、肺炎、肝炎、胃炎、子
宫颈炎、淋巴结核、败血症等严重感染性疾病均有明显疗
效［２］，三叶青中的三叶青黄酮、伊谷甾醇、多糖等能有效抑
制肿瘤细胞增殖［３］。多糖的质量控制是多糖类药物研发中
急需发展的技术，其中多糖中单糖组分测定是多糖质量控
制的主要指标［４］。目前，单糖的仪器测定方法包括气相色
谱法［５］、液相色谱法［６－７］、毛细管电泳法［８］和离子色谱法［４，９］。
气相色谱法在测定糖类时必须经过衍生化步骤才能分离，
操作费时且繁琐。毛细管电泳法由于对常见糖类的紫外吸
收较弱，也需经过衍生后才能使得糖类达到足够的灵敏度。
普通的液相色谱法在检出限上仅达 ｍｇ／Ｌ级［９］。而离子色
谱－脉冲安培法在测定糖类时灵敏度高，检出限低，操作简
便，因而得到越来越广泛的应用。本文首次采用离子色谱
法研究三叶青各部位多糖组成，为综合开发利用三叶青提
供科学依据。
１　仪器与试剂
ＩＣＳ－３０００型离子色谱仪（美国Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
公司）；ＯｎＧｕａｒｄ　ＩＩＲＰ固相萃取柱（美国Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉ－
ｅｎｔｉｆｉｃ公司）；色谱柱：Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ＣａｒｂｏＰａｃ
ＰＡ１０保护柱（５０ｍｍ×４ｍｍ　ｉ．ｄ．）；Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
ＣａｒｂｏＰａｃ　ＰＡ１０分析柱（２５０ｍｍｍ×４ｍｍ　ｉ．ｄ．）。
高速中药粉碎机（型号ＤＦＹ－５００，温岭市林大机械有限
公司）；分析天平（型号：ＦＡ２００４Ｎ，上海双旭电子有限公
司）；恒温电热套（型号：ＴＣ－１５，海宁市华星仪器厂）；子华牌
循环水真空泵（型号：ＳＨＺ－ＤＩＩＩ，巩义市子华仪器有限责任
公司）；高速离心机（型号：ＬＧ１０－２．４Ａ，北京京立离心机有
限公司）；真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；２ＸＺ－２
型旋片真空泵（浙江台州求精真空泵有限公司）。０．２２μｍ
尼龙滤膜过滤头、铁架台、冷凝管、圆底烧瓶、烧杯、抽滤瓶
等。
９５％乙醇、浓硫酸、碳酸钡、氢氧化钠等试剂均为分析
纯；７种单糖的标准品：葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、甘露糖、岩
藻糖、半乳糖和鼠李糖均购自上海晶纯有限公司；实验室用
水为１８．２ＭΩ·ｃｍ去离子水；三叶青块根和叶子采自杭州
鸿越生态农业科技有限公司生产基地。
２　标准溶液配制及样品处理
２．１　单糖标准溶液配制
分别配制浓度均为１　０００ｍｇ／Ｌ的葡萄糖、果糖、阿拉伯
糖、甘露糖、岩藻糖、半乳糖和鼠李糖七种单糖的储备液，用
去离子水稀释成一系列不同浓度的标准工作溶液，供离子
色谱分析用。
２．２　三叶青块根粗多糖的提取和纯化
称取三叶青块根粉末５．０ｇ，用４０ｍＬ　９５％乙醇浸提１２ｈ
以上脱脂，过滤，取滤渣加７５ｍＬ蒸馏水，沸水提取２ｈ，抽
滤，滤渣再加７５ｍＬ蒸馏水，沸水提取２ｈ，抽滤，合并两次得
到的滤液浓缩至２０ｍＬ，静置冷却后，边搅拌边缓缓加入
９５％乙醇４３ｍＬ，静置过夜，离心，真空干燥，得到三叶青块
根粗多糖。
２．３　三叶青块根粗多糖水解
取８．７ｍｇ三叶青块根粗多糖于５０ｍＬ试剂瓶中，加
５ｍＬ　２ｍｏｌ／Ｌ硫酸溶液，在沸水浴中水解２ｈ。向水解液中加
入适量碳酸钡中和硫酸，再加适量氢氧化钠至ｐＨ＝７～９，
得到水解液，静置后取上清液过Ｃ１８小柱进行前处理，稀释
５０倍后过滤膜进离子色谱分析。
３　实验方法与结果
３．１　色谱与电化学测定条件
色谱柱：Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ＣａｒｂｏＰａｃ　ＰＡ１０保护
柱（５０ｍｍ×４ｍｍ　ｉ．ｄ．）和分析柱（２５０ｍｍ×４ｍｍ　ｉ．ｄ．）；电化
学测定条件：脉冲安培，参比电极为Ａｇ／ＡｇＣｌ模式，经实验
摸索，淋洗液为１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＯＨ，进样体积为２５μＬ，流速为
１．０ｍＬ／ｍｉｎ。
３．２　单糖测定
按照以上色谱条件对七种单糖的混合标准溶液进行分
离，在选定的色谱条件下，７种单糖（各单糖浓度分别为
０．５ｍｇ／Ｌ）得到了较好的分离，见图１。
１．岩藻糖，２．鼠李糖，３．阿拉伯糖，４．甘露糖，５．葡萄糖，６．半乳糖，７．果
糖
图１　７种单糖标准色谱
３．３　７种单糖线性关系、方法的检出限与重现性测定
将配制好的不同浓度单糖混合标准溶液按上述色谱条
件进样测定分析，以峰面积Ｙ对质量浓度Ｘ（ｍｇ／Ｌ）进行线
性回归；对同一浓度混合标准溶液（０．５ｍｇ／Ｌ）连续进样６
次，计算各单糖峰面积积分ＲＳＤ，得到方法线性关系、重现
性及检出限（Ｓ／Ｎ＝３）等结果见表１。
３．４　样品检测与方法验证
按“２．２”项下方法处理三叶青块根，在上述色谱条件下
进样测定，结果见表２。三叶青块根单糖回收率在１０１％～
１１５％之间，按同样方法对三叶青叶进行处理和检测，结果
见表３。三叶青叶单糖回收率在９８．０％～１１６．０％之间，三
叶青块根和叶子所含单糖的摩尔比见表４。
４　讨论
本实验采用水提醇沉法从三叶青块根、叶两个部位中
提取总多糖，通过简单的前处理步骤，利用离子色谱－脉冲
—３４—
安培法测定三叶青块根和叶中多糖的单糖组成，避免了繁
琐的样品衍生化处理等操作，测得三叶青块根和叶中多糖
均含有岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖
六种单糖组分，其中叶子还含有果糖。三叶青块根和叶中
多糖各单糖组分的摩尔比存在一定差异。本实验方法简
单、可靠，灵敏度高，具有一定的实用价值。
表１　方法的线性关系、检出限及重现性
单糖 线性方程 相关系数 线性范围（ｍｇ／Ｌ） 检出限（μｇ／Ｌ） 峰面积相对标准偏差ＲＳＤ（％，ｎ＝６）
岩藻糖 Ｙ＝１．０５６　１Ｘ－０．００７　９　 ０．９９９　４　 ０．０２～２０　 ３．９５　 ２．９１
鼠李糖 Ｙ＝０．６９７　３Ｘ＋０．１１１　５　 ０．９９９　４　 ０．０５～２０　 １０．４０　 ２．３０
阿拉伯糖 Ｙ＝１．２９４　７Ｘ＋０．２８１　０　 ０．９９９　２　 ０．０５～２０　 ５．５３　 ３．７５
甘露糖
葡萄糖
Ｙ＝１．３０３　７Ｘ＋０．２３８　２
Ｙ＝１．８４８　７Ｘ＋０．３９０　４
０．９９９　２
０．９９９　２
０．０５～２０
０．０５～２０
６．９６
５．５２
３．８０
３．７３
半乳糖 Ｙ＝１．０２０　６Ｘ＋０．０９３　０　 ０．９９９　４　 ０．１０～２０　 １１．３８　 ２．２０
果糖 Ｙ＝０．４２９　９Ｘ＋０．０８２　０　 ０．９９９　９　 ０．１０～２０　 ２０．６１　 ２．６８
表２　三叶青块根中多糖测定结果
待测物 原样浓度（ｍｇ／Ｌ） 原样含量（ｍｇ／ｇ）稀释后测定值（ｍｇ／Ｌ） 加标量（ｍｇ／Ｌ） 测得值（ｍｇ／Ｌ） 加标回收率（％）
岩藻糖 １．２４　 ０．６７　 ０．０２　 ０．２０　 ０．２２　 ０．９８
鼠李糖 １５．５９　 ８．４７　 ０．３１　 １．００　 １．４７　 １．１６
阿拉伯糖 ７．８１　 ４．２４　 ０．１６　 １．００　 １．２７　 １．１１
甘露糖 ３５．７２　 １９．４１　 ０．７１　 １．００　 １．８４　 １．１３
葡萄糖 ４．６３　 ２．５２　 ０．０９　 １．００　 １．２０　 １．１１
半乳糖 ６９．４７　 ３７．７５　 １．３９　 １．００　 ２．４２　 １．０３
果糖 １０．８２　 ５．８８　 ０．２２　 １．００　 １．３３　 １．１１
表３　三叶青叶中多糖测定结果
待测物 原样浓度（ｍｇ／Ｌ） 原样含量（ｍｇ／ｇ）稀释后测定值（ｍｇ／Ｌ） 加标量（ｍｇ／Ｌ） 测得值（ｍｇ／Ｌ） 加标回收率（％）
岩藻糖 １．２４　 ０．６７　 ０．０２　 ０．２０　 ０．２２　 ０．９８
鼠李糖 １５．５９　 ８．４７　 ０．３１　 １．００　 １．４７　 １．１６
阿拉伯糖 ７．８１　 ４．２４　 ０．１６　 １．００　 １．２７　 １．１１
甘露糖 ３５．７２　 １９．４１　 ０．７１　 １．００　 １．８４　 １．１３
葡萄糖 ４．６３　 ２．５２　 ０．０９　 １．００　 １．２０　 １．１１
半乳糖 ６９．４７　 ３７．７５　 １．３９　 １．００　 ２．４２　 １．０３
果糖 １０．８２　 ５．８８　 ０．２２　 １．００　 １．３３　 １．１１
表４　三叶青块根和叶中所含单糖摩尔比
摩尔比 岩藻糖 鼠李糖 阿拉伯糖 甘露糖 葡萄糖 半乳糖 果糖
块根 ０．０７　 ０．２２　 ０．４　 １．２７　 ２６．５６　 ０．８７ －
叶子 ０．０４　 ０．４３　 ０．２６　 ０．９９　 ０．１３　 １．９３　 ０．３
参考文献：
［１］　江苏新医学院．中药大辞典［Ｍ］．下册．上海：上海人民出版
社，１９７７：２１２３．
［２］　黄真，毛庆秋，魏佳平．三叶青提取物抗炎、镇痛及解热作用
的实验研究［Ｊ］．中国新药杂志，２００５，１４（７）：８６１－８６４．
［３］　杜苏瑞，向太和，李朦．生物技术在药用植物三叶青中的应用
研究进展［Ｊ］．杭州师范大学学报，２０１２，１１（２）：１４２－１４５．
［４］　李发胜，徐恒瑰，李明阳，等．高效阴离子交换色谱－脉冲安培
检测法分析漏芦多糖中的单糖组成［Ｊ］．理化检验·化学分
册，２００８，４４（４）：３４２－３４４．
［５］　徐桂云，陈汝贤，常理文．用毛细管气相色谱法测定多糖中单
糖的组成［Ｊ］．分析测试学报，２０００，１９（３）：７１－７３．
［６］　李芳，胡容峰，黄丽丹，等．高效液相色谱－蒸发光散射法测定
黄芪中单糖和双糖中的含量［Ｊ］．安徽中医药大学学报，
２０１５，３４（２）：８２－８４．
［７］　万强，吴学昊，范华均，等．ＨＰＬＣ－衍生化法分析决明子多糖
水解产物中单糖组分及其多糖组成特征的研究［Ｊ］．分析测
试学报，２０１４，３３（１１）：１２３１－１２３６．
［８］　郑春英，牛雯颖，吴优．高效毛细管电泳法分析茯苓多糖中的
单糖组成［Ｊ］．中国食品学报，２０１３，１３（５）：２５４－２５８．
［９］　李仁勇，梁立娜，牟世芬，等．离子色谱－脉冲安培检测白醋和
豆腐水中单糖和大豆低聚糖［Ｊ］．分析化学研究简报，２００９，
３７（５）：７２５－７２８．
（编辑：尹晨茹）
—４４—