全 文 ：A. 球松素
A. pinostrobin
图 3 山橿 HPLC色谱图
Fig. 3 HPLC chromatogram of Lindera reflexa Hemsl．
A. 为球松素
A. pinostrobin
图 4 树脂纯化后样品 HPLC图谱
Fig. 4 HPLC chromatogram of sample with resin
purification
参考文献:
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正交试验法比较女贞子中齐墩果酸与特女贞苷的乙醇提取工艺
郭宇洁， 任 烨， 葛争艳， 孟 硕， 金 龙， 李雪丽， 刘建勋*
(中国中医科学院西苑医院实验中心，北京 100091)
收稿日期:2012-05-18
基金项目:科技部“重大新药创制”科技重大专项 (2010ZX09102-213．)
作者简介:郭宇洁 (1968—) ，女，副主任药师，中药制剂及其相关研究。Tel: (010)62835615，E-mail:guoyujie121@ sina． com
* 通信作者:刘建勋 (1955—)，男，研究员，博士生导师，中药药理及其相关研究。Tel: (010)62835601，E-mail:liujx0324@ sina． com
摘要:目的 通过正交试验法比较女贞子药材的乙醇提取工艺。方法 建立 HPLC法测定女贞子药材中齐墩果酸和特
女贞苷含量的方法。采用 L9(3
4)正交试验设计安排实验，分别以齐墩果酸和特女贞苷 2 种指标成分对正交试验结果
进行分析。结果 以齐墩果酸和特女贞苷为指标成分筛选出的女贞子提取工艺为以 6 倍量 75%乙醇提取 3 次，每次 2
h。结论 所得到的最佳醇提工艺可以反映女贞子两种成分的综合提取效果。
关键词:降糖消脂片;女贞子;齐墩果酸;特女贞苷;正交试验
中图分类号:R284. 2 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2013)02-0277-05
Alcohol extraction process of oleanolic acid and specnuezhenide of Ligustri lucidi
Fructus compared by orthogonal test
GUO Yu-jie， REN Ye， GE Zheng-yan， MENG Shuo， JIN Long， LI Xue-li， LIU Jian-xun*
(Center for Research，Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100091，China)
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Vol． 35 No． 2
KEY WORDS:Jiangtang Xiaozhi Tables;Ligustri lucidi Fructus;oleanolic acid;specnuezhenide;orthogonal test
女贞子系木犀科植物女贞 Ligustrum lucidum
Ait． 的干燥成熟果实，具有滋补肝肾和明目乌发
的功效［1］。主要成分有三萜类、环烯醚萜类、苯
乙醇类和黄酮类等成分［2-5］。女贞子系降糖消脂片
的君药，针对女贞子的乙醇提取工艺进行了重点研
究。2005 版《中国药典》女贞子以齐墩果酸为质
量控制指标［6］，2010 版 《中国药典》女贞子以特
女贞苷为质量控制指标［1］。为更好地提取出女贞
子的有效成分，本实验既以齐墩果酸为指标成分，
又以特女贞苷为指标成分，以正交试验法进行女贞
子的乙醇提取工艺研究，所筛选的提取工艺兼顾了
两种成分的提取，并对比两版药典不同质量控制标
准对女贞子醇提工艺的影响。
1 仪器与试剂
AglientHP1100 高效液相色谱仪 (美国) ;
BRANSON超声清洗器 (上海必能信超声有限公
司) ;METTLER AE240 电子天平 (梅特勒 － 托利
多仪器有限公司)。
齐墩果酸标准品 (中国药品生物制品检定所，
批号:110709-200304) ;特女贞苷对照品 (中国中
医科学院中药研究所，编号为 090528) ;女贞子药
材 ［河北神农 (北京)药业有限公司，批号
050428］;乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其
余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2. 1 齐墩果酸的测定
2. 1. 1 对照品溶液制备 精密称取齐墩果酸对照
品适量，加甲醇制成每 1 mL 含齐墩果酸 0. 20 mg
的溶液，即得。
2. 1. 2 供试品溶液制备 精密称取女贞子提取物
0. 4 g，精密称定，加入甲醇 20 mL，加热回流 45
min，放冷，转移至 50 mL 量瓶中，用少量甲醇分
次洗涤容器和残渣，洗液转移至同一量瓶中，摇
匀，用微孔滤膜 (0. 45 μm)滤过，取续滤液，
即得。
2. 1. 3 齐墩果酸色谱条件［7-11］ 岛津 Shim-pack
CLC-ODS色谱柱 (6. 0 mm × 150 mm，5 μm) ;甲
醇 － 0. 05%磷酸水 (90 ∶ 10)为流动相;柱温为 2
℃;检测波长为 215 nm。理论塔板数按齐墩果酸
计算应不低于3 000。对照品进样量、供试品进样
量均 15 μL。
2. 1. 4 齐墩果酸线性关系考察 精密称取齐墩果
酸 4. 95 mg，置 10 mL 量瓶中，加入甲醇至刻度，
摇匀，配制成每 1 mL甲醇含 0. 495 mg的齐墩果酸
标准品溶液，进样体积分别为 2、4、6、8、10、
16、18 μL，注入高效液相仪，测定峰面积，以齐
墩果酸的进样量 (μg)为横坐标 (X)、峰面积为
纵坐标 (Y)作图，进行线性回归，回归方程为
Y = 797. 432 382 4x + 5. 787 446 678，r = 1. 000 0
(n = 7)。说明齐墩果酸在 0. 99 ～ 8. 91 μg之间线性
关系良好。
2. 1. 5 齐墩果酸精密度试验 将供试品溶液注入
高效液相仪，重复进样 5 次，测定峰面积，计算齐
墩果酸的 RSD为 1. 21%，说明仪器的精密度良好。
2. 1. 6 齐墩果酸回收率试验 精密称取已知齐墩
果酸质量浓度的样品适量共 6 份，置 20 mL 量瓶
中，分别精密加入相当于已知对照品量的 50%、
100%的齐墩果酸对照品，甲醇溶解定容，其余
按供试品溶液制备方法进行测定，齐墩果酸的
平均回收率为 99. 71%，RSD 为 1. 05%。
2. 2 特女贞苷的测定
2. 2. 1 特女贞苷对照品溶液制备 精密称取特女
贞苷对照品适量，加甲醇制成每 1 mL 含特女贞苷
0. 10 mg的溶液，即得。
2. 2. 2 供试品溶液制备 精密称取女贞子提取物
0. 15 g，精密称定，加入甲醇 20 mL，加热回流 45
min，放冷，转移至 50 mL 量瓶中，用少量甲醇分
次洗涤容器和残渣，洗液转移至同一量瓶中，摇
匀，用微孔滤膜 (0. 45 μm)滤过，取续滤液，
即得。
2. 2. 3 特女贞苷色谱条件［12-16］ Waters Symmetry
C18色谱柱 (3. 9 mm × 150 mm，5 μm) ;乙腈 －水
(17 ∶ 83)为流动相;检测波长为 224 nm。柱温为
室温。理论塔板数按特女贞苷计算应不低于4 000。
对照品进样量、供试品进样量均 15 μL。
2. 2. 4 特女贞苷线性关系 精密称取特女贞苷标
准品 适 量，加 入 甲 醇 制 成 每 1 mL 甲 醇 含
0. 089 6 mg的特女贞苷标准品溶液，进样体积分别
为 5、10、15、20、25、30、35 μL，注入高效液
相仪，测定峰面积，以特女贞苷的进样量 (μg)
为横坐标 (X)、峰面积为纵坐标 (Y)作图，进
行线性回归，回归方程为 Y = 1 326 951. 834 17x +
16 219. 677 936，r = 0. 999 9 (n = 8)。特女贞苷在
0. 179 2 ～ 3. 316 μg范围内呈良好线性关系。
2. 2. 5 精密度试验 将供试品溶液，注入高效液
相仪，重复进样 5 次，测定峰面积，特女贞苷的
RSD为 0. 35%，仪器精密度良好。
2. 2. 6 回收率试验 精密称取已知特女贞苷质量
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浓度的样品适量，置 25 mL量瓶中，分别精密加入
相当于已知对照品量的 100%的特女贞苷标准品溶
液，加入甲醇溶解定容，其余按供试品溶液制备方
法进行测定，特女贞苷平均回收率为 103. 29%，
RSD为 1. 25%。
2. 3 女贞子乙醇提取工艺
2. 3. 1 以齐墩果酸为指标的醇提工艺 准确称取
破碎过的女贞子药材 20 g，共 9 份，选定醇提浓
度、醇提倍数和醇提次数三个因素作为正交试验的
考察因素，每个因素各取三个水平，提取时间为 2
h。采用 L9(3
4)正交表进行正交试验。因素水平
表见表 1。样品减压干燥后进行以 HPLC 法测定齐
墩果酸，其正交结果见表 2，对表 2 的结果进行统
计学处理后，其方差分析见表 3。
表 1 因素水平 (2005 年版《中国药典》齐墩果酸)
Tab. 1 Fators and levels (Oleanolic Acid of Chinese Phar-
macopoeia 2005)
水平 A (乙醇 /%) B (乙醇倍数 /倍) C (醇提次数 /次)
1 55 4 1
2 75 5 2
3 95 6 3
以齐墩果酸为指标进行直观分析 (见表 2)和
方差分析 (见表 3) ，影响因素顺序为 A ＞ C ＞ B，
即醇提浓度 ＞醇提次数 ＞ 加醇倍数;最佳工艺为
A2B3C3，即以齐墩果酸为考察指标，最佳提取工
艺为 A2B3C3，即以 6 倍量 75%乙醇提取三次，每
次 2 h。方差分析结果表明 3 个因素对齐墩果酸的
提取效果均无显著性影响。
表 2 正交试验结果 (2005 年版《中国药典》齐墩果酸)
Tab. 2 Results of orthogonal test (Oleanolic Acid of Chinese Pharmacopoeia 2005)
序号 A B C D 齐墩果酸 /(mg·g － 1药材)
1 1 1 1 1 2. 24
2 1 2 2 2 4. 83
3 1 3 3 3 7. 28
4 2 1 2 3 7. 65
5 2 2 3 1 8. 13
6 2 3 1 2 6. 34
7 3 1 3 2 6. 94
8 3 2 1 3 6. 26
9 3 3 2 1 7. 26
K1 14. 35 16. 83 14. 84 17. 63 ! = 56. 93
K2 22. 12 19. 22 19. 74 18. 11 CT = !2 /9
K3 20. 46 20. 88 22. 35 21. 19 = 386. 2 187
K1 4. 78 5. 61 4. 95 5. 88
K2 7. 37 6. 41 6. 58 6. 04
K3 6. 82 6. 96 7. 45 7. 06
R 2. 5 900 1. 3 500 2. 5 033 1. 1 867
S 11. 1 623 2. 763 355 6 9. 691 355 6 2. 487 822 3
表 3 方差分析 (2005 年版《中国药典》齐墩果酸)
Tab. 3 Variance analysis (Oleanolic Acid of Chinese Phar-
macopoeia 2005)
方差来源
离均差
平方和
自由度 方差 F值 显著性
A 11. 162 3 2 5. 581 1 4. 486 8
B 2. 763 4 2 1. 381 7 1. 110 8
C 9. 691 4 2 4. 845 7 3. 895 5
D (误差) 2. 487 8 2 1. 243 9
注:F0. 05(2，2) = 19. 00，F0. 01(2，2) = 99. 00
2. 3. 2 以特女贞苷为指标的醇提工艺 准确称取
破碎过的女贞子药材 20 g，共 9 份，选定醇提浓
度、醇提倍数和醇提次数三个因素作为正交试验的
考察因素，每个因素各取三个水平，提取时间为
2 h。采用 L9(3
4)正交表进行正交试验。因素水
平表见表 4。样品减压干燥后进行以 HPLC 法测定
特女贞苷，其正交结果见表 5，对表 5 的结果进行
统计学处理后，其方差分析见表 6。
表 4 因素水平 (2005 年版《中国药典》特女贞苷)
Tab. 4 Fators and levels (Specnuezhenide of Chinese
Pharmacopoeia 2010)
水平 A (乙醇 /%) B (乙醇倍数 /倍)C (乙醇提取次数 /次)
1 35 4 1
2 55 5 2
3 75 6 3
以特女贞苷为指标进行直观分析 (见表 4)和
方差分析 (见表 5) ，影响因素顺序为 C ＞ B ＞ A，
即醇提次数 ＞加醇倍数 ＞醇提浓度;方差分析结果
表明 C 因素对特女贞苷的提取效果有显著性影响。
即:以特女贞苷为考察指标，最佳提取工艺为 A3
B3C3，即以 6 倍量 75%乙醇提取 3 次，每次 2 h。
2. 3. 3 女贞子提取工艺验证试验 准确称取破碎
过的女贞子药材 20 g 共 3 份，按最佳提取工艺条
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件提取，进行验证试验，结果见表 7。
表 5 正交试验结果 (2010 版《中国药典》特女贞苷)
Tab. 5 Results of orthogonal test (Specnuezhenide of Chi-
nese Pharmacopoeia 2010)
序号 A B C D
特女贞苷 /
(mg·g － 1药材)
1 1 1 1 1 11. 58
2 1 2 2 2 22. 33
3 1 3 3 3 22. 67
4 2 1 2 3 20. 19
5 2 2 3 1 23. 86
6 2 3 1 2 17. 19
7 3 1 3 2 24. 31
8 3 2 1 3 15. 73
9 3 3 2 1 23. 76
K1 56. 58 56. 08 44. 50 59. 20 ! = 181. 62
K2 61. 24 61. 92 66. 28 63. 83 CT = !2 /9
K3 63. 80 63. 62 70. 84 58. 59 = 3 822. 032 6
K1 18. 86 18. 69 14. 83 19. 73
K2 20. 41 20. 64 22. 09 21. 28
K3 21. 27 21. 21 23. 61 19. 53
R 2. 406 7 2. 513 3 8. 780 0 1. 746 7
表 6 方差分析 (2010 版《中国药典》特女贞苷)
Tab. 6 Variance analysis (Specnuezhenide of Chinese
Pharmacopoeia 2010)
方差来源
离均差
平方和
自由度 方差 F值 显著性
A 8. 933 1 2 4. 466 5 1. 631 9
B 10. 427 5 2 5. 213 7 1. 904 9
C 132. 106 4 2 66. 053 2 24. 133 1 *
D (误差) 5. 474 1 2 2. 737 0
注:F0. 05(2，2) = 19. 00，F0. 01(2，2) = 99. 00
表 7 验证试验结果
Tab. 7 Results of verification test
序号 齐墩果酸 /(mg·g － 1药材) 特女贞苷 /(mg·g － 1药材)
1 8. 32 24. 55
2 8. 29 24. 52
3 8. 34 24. 69
由以上实验可知，女贞子以齐墩果酸为考察指
标 (2005 年版 《中国药典》)和以特女贞苷为考
察指标 (2010 年版 《中国药典》)进行醇提工艺
优选时，最佳工艺均为女贞子以 6 倍量 75%乙醇
提取 3 次，每次2 h。验证试验表明优选出的提取
工艺稳定、合理、可行。此提取条件可以兼顾到女
贞子中齐墩果酸和特女贞苷成分的提取，更有效保
证女贞子的提取效果。
3 讨论
齐墩果酸为 2005 版 《中国药典》中女贞子的
质量控制指标，在建立齐墩果酸 HPLC 法测定方法
的同时，也必须同时建立 HPLC 测定熊果酸的方
法，因为齐墩果酸和熊果酸是同时存在于女贞子药
材中的两个同分异构体，两者理化性质非常接近。
本研究通过试验，建立了 HPLC法同时测定齐墩果
酸和熊果酸的方法。
齐墩果酸进行 HPLC法测定时，柱温的选择很
关键。曾在柱温 25 ℃、17 ～ 18 ℃、5 ℃和 2 ℃等
条件下进行研究，发现当柱温为 2 ℃时齐墩果酸和
熊果酸的分离度大于 1. 5，符合要求，故选择柱温
2 ℃，解决了 HPLC法同时测定齐墩果酸和熊果酸
的问题。见图 1 ～ 2。
在女贞子的工艺研究中，齐墩果酸、熊果酸和
特女贞苷均为女贞子的有效成分，前者优选的醇提
条件和后者优选的醇提条件正好一致，相一致的提
取工艺仅适用于女贞子，不同的中药需要不同对待
和研究。中药材工艺考察时应该以两种成分或者多
种成分的综合提取效果进行评价，必要的时候结合
药理药效结学评价，才能充分保证提取工艺的可行
性和药物的药效。
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Vol． 35 No． 2
1. 齐墩果酸 2. 熊果酸
1. oleanlic 2. ursolic acid
图 1 齐墩果酸和女贞子药材的液相色谱图
Fig. 1 HPLC chromatograms of oleanolic acid and Ligustri Lucidi Fructus．
1. 特女贞苷
1. Specnuezhenide
图 2 特女贞苷对照品 (A)、女贞子药材样品 (B)液相色谱图
Fig. 2 HPLC chromatograms of specnuezhenide reference substance (A)and sample
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