全 文 ：收稿日期:2009-11-27; 修订日期:2010-03-18
基金项目:宁夏回族自治区卫生厅科研项目(No． 2008028) ;
宁夏银川市科技攻关项目［No．银财发 2009(308 号)－ 46］
作者简介:张立明(1971 －) ，男(汉族) ，宁夏银川人，现任宁夏医科大学
药学院副教授，硕士学位，主要从事天然药物的研究工作．
响应曲面法优化三叶青总黄酮提取工艺研究
张立明1，张 霞1，郑传莉2，董 雪1
(1．宁夏医科大学药学院，宁夏 银川 750004; 2．宁夏医科大学附属医院，宁夏 银川 750004)
摘要:目的 研究乙醇溶剂提取三叶青中总黄酮的最佳工艺条件。方法 以乙醇溶液为提取溶剂，采用响应面设计方法，
对影响总黄酮提取效果的 3 个因素乙醇浓度(C)、液料比(R)、提取时间(t)进行中心组合设计试验，并建立数学模型，研
究这些因素对黄酮提取率的影响。结果 中心组合设计试验建立总黄酮提取率与乙醇浓度(C)、液料比(R)及提取时间
(t)间的数学模型显著，R2 = 0． 950 2;最佳的提取工艺条件为 28%乙醇(V /V) ，液料比 22(ml /g) ，提取时间 2． 2 h;经提取
次数考察，最佳提取次数为 2 次。该条件下三叶青总黄酮的提取率为 0． 30%。结论 验证试验结果表明，应用响应面方
法优选出的工艺稳定、合理、可行。
关键词:三叶青; 总黄酮; 响应面优化; 提取工艺
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2010． 10． 076
中图分类号:R284． 2 文献标识码:B 文章编号:1008-0805(2010)10-2588-02
三叶青 Radix Tetrastigmae 为葡萄科植物三叶崖爬藤 Tet-
rastigma hemsleyanum Diels et Gilg的干燥块根，分布于我国浙江，
江西，福建，台湾，湖北，广东，广西，四川，贵州及云南等省区［1］，
具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛的功能，主要用于治疗高热惊
撅、肺炎、哮喘、肝炎、风湿、咽痛、瘰疬，痈疔疮疖等症［2］。在民
间三叶青用于肿瘤的治疗有很好的治疗作用并基本无毒。三叶
青提取物(ERT)主要含有淀粉、还原糖、黄酮类、甾体类化合物和
氨基酸等。在急慢性肝损伤、肝炎、肝癌的现代药理研究中发现，
ERT中主要的生物活性物质为槲皮素、山萘酚、山萘酚 － 3 － O －
新橙皮糖苷等黄酮类化合物［3］。
响应面分析法(Response Surface Methology，RSM)是近几年
发展起来的一种分析方法，其原理是通过一系列确定性试验拟合
一个响应面来模拟真实的极限状态曲面，从而很容易地进行可
靠性分析［4］。响应面分析法采用多元二次回归方法作为函数估
计的工具，将多因子试验中因子与指标的相互关系用多项式近
拟，精确地表述因素与响应值之间的关系，并依此从响应面的
形状上找到最佳控制点。可用于确定各因素及其交互作用在工
艺过程中对指标的影响，在试验设计与结果表达方面更加优良。
本实验选用乙醇回流法进行三叶青总黄酮的提取，采用响
应面法优化提取工艺条件，为有效开发和利用三叶青，充分提取
其中所含的黄酮类物质提供指导。
1 材料与仪器
1． 1 材料 三叶青(宁夏明德饮片厂提供，宁夏药品检验所鉴
定)切碎，放入广口甁备用;试药、试剂 芦丁对照品(购于中国药
品生物制品检定所) ;AlCl3· 6H2O、95%乙醇均为分析纯试剂。
1． 2 仪器 UV －2550 双光束紫外可见分光光度计(日本岛津) ;
AB256 － S电子天平(梅特勒 －托利多上海有限公司) ;SHZ － D
循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)。
2 方法
2． 1 芦丁标准溶液的配制 准确称取 120℃干燥至恒重的芦丁
对照品 5． 91 mg，用体积分数为 30%的乙醇溶解并定容至 25ml
量瓶，摇匀，得浓度为 0． 236 mg /ml的芦丁标准溶液。
2． 2 标准曲线的绘制 分别准确吸取芦丁标准溶液 0． 0，0． 5，
1． 0，1． 5，2． 0，2． 5 ml 于 25 ml 容量瓶，加入 0． 1 mol /L AlCl3·
6H2O 2． 0 ml，用 30%乙醇定容至刻度，摇匀，室温放置 15 min
后，以试剂空白为参比液，于 410 nm 处测定吸光度值。以测得的
各比色液的吸光度 A 对相应的芦丁质量浓度 C 作标准曲线，得
到该曲线的线性回归方程为 A = 26． 98C + 0． 000 4 ，线性范围
为0． 004 72 ～ 0． 023 6 mg / ml，相关系数 R = 0． 999 5 。
2． 3 样品中总黄酮的提取 精密称取 4． 0 g三叶青样品，按提取
条件热回流提取一定时间后，趁热过滤，将滤液转至 100 ml 容量
瓶，加提取溶剂定容至刻度，摇匀，作为待测溶液。
2． 4 样品中总黄酮的含量测定 供试品溶液的制备:准确吸取待
测液 3 ml于 25 ml容量瓶中，按“2． 2”项步骤进行测定。
根据标准曲线的回归方程导出
样品中总黄酮的含量(%)= (A － 0． 0004)× 25． 0 × 10026． 98 × 3． 0 × m × 100%
其中:A － 吸光度;m － 称取的样品质量(mg)
2． 5 单因素实验 以总黄酮含量为考察指标，按“2． 3”项方法提
取后“2． 2”项步骤进行测定。采用单因素法考察药材粒度、提取
溶剂、溶剂浓度、料液比、提取时间等因素对三叶青中总黄酮提取
率的影响。
2． 6 工艺优化方法 在单因素试验结果基础上，采用中心组合试
验 Box － Behnken(BBD)设计方案，选择提取剂乙醇浓度(%)、液
料比(ml / g)以及提取时间(h)3 个因素，以 + 1、0、－ 1 分别代表
变量的水平(表 1) ，进行 15 个试验点(3 个中心点)的响应面分
析试验，使用 Design － expert software 7． 1． 3 Tril进行数据分析，求
出数学模型，进而对回流提取三叶青中总黄酮的影响因素进行研
究和条件优化。
表 1 中心组合试验 Box － Behnken方案设计的因素和水平编码值表
自变量 提取液浓度(%) 液固比 R(ml /g) 时间 t /h
－ 1 10 15 1． 5
0 30 20 2
1 50 25 2． 5
3 结果与分析
3． 1 单因素实验
3． 1． 1 提取溶剂的选择 黄酮类化合物无论是游离的黄酮苷元
还是黄酮苷都易溶于乙醇、甲醇、水等极性大的溶剂中。考虑到
甲醇的毒性，本实验以水和不同浓度的乙醇回流提取，结果以水
为提取剂提取率较低。因此，本实验选择乙醇溶液作为提取溶
剂。
3． 1． 2 粒度的选择 考察不同粒度对总黄酮提取率的影响，以原
料(未粉碎)、未过 1 号筛、过 1 号未过 2 号筛、过 2 号筛 4 种粒
度进行回流提取。由于三叶青含有较多的淀粉、黏液质，粒度较
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小时在加热情况下容易使淀粉糊化，细胞内大量的黏液质渗出，
不利于其它成分的浸出，且过滤困难。而未粉碎药材总黄酮提取
率低于切碎未过 1 号筛者，因此本实验粒度选用未过 1 号筛。
3． 2 响应面试验结果与分析
3． 2． 1 提取剂浓度、液料比和提取时间的优化试验结果 单因素
试验结果表明，在 10 ～ 90%范围内，乙醇体积分数为 30%时提取
率最高;液料比在 5 ～ 25 ml /g 范围内，20 ml /g 时提取率最高。
提取时间在 0． 5 ～ 3 h 范围内，3 h 时提取率最高，但提取时间超
过 2 h，提取率增加速度趋缓。以乙醇溶液为提取溶剂，提取条件
的响应面分析试验设计及结果见表 2。试验号 1，2，3，4，5，6，7，
9，10，11，14，15 是析因试验，试验号 8，12，13 是中心试验。其中
析因点为自变量取值在 C、R、t所构成的三维顶点;零点为区域的
中心点，零点试验重复 3 次，用以估计实验误差。
表 2 BBD设计和实验结果
操作序号
因素 1
乙醇浓度 C(%)
因素 2
液料比 R(ml /g)
因素 3
提取时间 t /h
响应值
吸光度(A)
1 30． 00 25． 00 2． 5 0． 275
2 50． 00 20． 00 2． 5 0． 201
3 10． 00 20． 00 2． 5 0． 230
4 10． 00 20． 00 1． 5 0． 218
5 10． 00 15． 00 2． 0 0． 202
6 50． 00 25． 00 2． 0 0． 205
7 50． 00 15． 00 2． 0 0． 201
8 30． 00 20． 00 2． 0 0． 269
9 30． 00 15． 00 1． 5 0． 209
10 10． 00 25． 00 2． 0 0． 230
11 30． 00 15． 00 2． 5 0． 231
12 30． 00 20． 00 2． 0 0． 288
13 30． 00 20． 00 2． 0 0． 288
14 50． 00 20． 00 1． 5 0． 195
15 30． 00 25． 00 1． 5 0． 232
3． 2． 2 回归分析 对试验数据进行响应曲面回归分析。结果见
表 3。
表 3 实验数据的二次响应面模型和回归分析
变异来源 平方和 自由度 均方 F 值 Prob ＞ F值
Model 0． 014 9 1． 599E －003 10． 59 0． 009 1 显著
A － C 7． 605E －004 1 7． 605E －004 5． 04 0． 074 7
B － R 1． 225E －003 1 1． 225E －003 8． 12 0． 035 8
C － t 8． 611E －004 1 8． 611E －004 5． 71 0． 062 5
AB 1． 440E －004 1 1． 440E －004 0． 95 0． 373 5
AC 9． 000E －006 1 9． 000E －006 0． 060 0． 816 8
BC 1． 102E －004 1 1． 102E －004 0． 73 0． 431 7
A2 8． 850E －003 1 8． 850E －003 58． 66 0． 000 6
B2 1． 989E －003 1 1． 989E －003 13． 18 0． 015 1
C2 1． 740E －003 1 1． 740E －003 11． 53 0． 019 3
失拟项 5． 138E －004 3 1． 713E －004 1． 42 0． 438 0 不显著
当“Prob ＞ F”值小于 0． 05 时，即表示该项指标显著，而对三
叶青总黄酮提取率方差分析(表 3)结果表明，对总黄酮提取率所
建立的回归模型是显著的。并且该模型的 R2 = 0． 950 2，说明此
模型与实际试验拟合较好，试验失拟项小，因此可用该回归方程
代替试验真实点对实验结果进行分析。
3． 2． 3 拟合模型的建立 以供试液的吸光度(A)为响应值，经回
归拟合后，各因子与响应值的回归方程为:
A = － 0． 584 53 + 8． 356 25E － 003C + 0． 037 208R + 0． 330 58t －
6． 000 00E － 005C × R － 1． 500 00E － 004 C t + 2． 100 00E － 003Rt
－ 1． 223 96E － 004C2 － 9． 283 33E － 004 × R2 － 0． 086 833t2
3． 2． 4 响应面(RSM)分析 响应曲面图是响应值对各试验因子
C、R、t所构成的响应面图形，从响应面分析图上可形象地看出最
佳参数及各参数之间的相互作用。本实验根据回归方程进行不
同因子的响应面分析。结果图 1 ～ 3。
通过软件分析，得到热回流提取三叶青总黄酮的最佳条件为
乙醇浓度 28%，液料比为 22 ml /g，提取时间为 2． 2 h。在此条件
下，总黄酮单次提取供液吸光度的理论预测值为 0． 286。
3． 2． 5 验证性试验 为检验 RSM 法的可靠性及稳定性，精密称
取 5 份药材样品按上述最佳提取工艺进行验证试验，操作方法同
前述。结果供试液的吸光度分别 0． 289，0． 281，0． 274，0． 285，
0． 291，平均值为 0． 284，单次提取总黄酮的提取率为 0． 22%，RSD
= 2． 4%(n = 5)。与理论预测值比较误差在 3%以内。因此，采
用 RSM法优化得到的提取条件参数准确可靠，具有实用价值。
图 1 乙醇浓度和液料比对三叶青总黄酮提取影响的曲面图和剖面图
图 2 乙醇浓度和提取时间对三叶青总黄酮提取影响的曲面图和剖面图
图 3 液料比和提取时间对三叶青总黄酮提取影响的曲面图和剖面图
3． 2． 6 提取次数的考察 在已优化的单次提取条件下，考察不同
提取次数对总黄酮提取率的影响。结果如图 4 所示，提取 2 次后
总黄酮的提取率为 0． 30%，已提出总黄酮的 88% ，从生产工艺
的角度考虑，选用提取次数为 2 次。
图 4 提取次数对三叶青总黄酮提取率的影响
4 讨论
本试验所用三叶青中总黄酮的含量测定方法经方法学考察，
精密度、稳定性及加样回收试验均符合规定。
三叶青总黄酮含量测定方法选用 Al(NO3)3 － NaNO2 －
NaOH 显色后，明显生成红色絮状沉淀，此法不宜采用。而用
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2010 VOL ． 21 NO． 10 时珍国医国药 2010 年第 21 卷第 10 期
AlCl3 显色后，芦丁标准液的 λmax = 410 nm，样品溶液的 λmax
= 400 ～ 410 nm，故选择 AlCl3 显色后 410 nm 波长处测定吸光
度。
以乙醇溶液为提取溶剂，采用热回流法提取三叶青中的总黄
酮，考察了乙醇浓度、液料比、提取时间等对三叶青总黄酮得率的
影响，并结合 BBD实验设计得到了最优提取工艺参数:乙醇浓
度为 28%，液料比为 22 ml /g ，提取时间为 2． 2 h，提取 2 次。在
此条件下，三叶青总黄酮提取率为 0． 30 %。经验证试验证明用
该工艺提取三叶青总黄酮工艺简单、稳定性好。本次实验优选出
来的实验条件，对今后开发利用三叶青中的总黄酮具有一定的指
导意义。
参考文献:
［1］ 中国医学科学院药物研究所． 中药志． 第二册［M］． 北京:人民卫
生出版社，1984:219．
［2］ 江苏新医学院．中药大辞典(下册) ［M］ ．上海:上海人民出版社 ，
1977:2123．
［3］ 刘 东，鞠建华，林 耕，等．三叶崖爬藤中的新黄酮碳甙［J］ ． 植
物学报 ，2002 ，44 (2) :227．
［4］ R． V． Muralidhar，R． R． Chirumamila． A response surface approach
for the comparison of lipase production by Candida cylindracea using
two different carbon sources［J］ ． Biochemical Engineering Journal，
2001，9 (1) :17．
收稿日期:2009-05-08; 修订日期:2010-03-17
基金项目:山东省中医管理局资助项目(No． 2001-12)
作者简介:刘红燕(1980-) ，女(汉族) ，山东肥城人，现任山东中医药大学
讲师，硕士学位，主要从事中药质量控制与资源研究工作．
山东不同产地单叶蔓荆子
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验研究
刘红燕
(山东中医药大学，山东 济南 250355)
摘要:目的 建立山东省两种生境下 3 个不同产地的单叶蔓荆子药材的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)指纹图谱，探讨蔓
荆子种内变异规律。方法 蛋白质、过氧化物酶同工酶 PAGE 指纹图谱分析。结果 两种生境 3 个产地的单叶蔓荆子的
Pro － PAGE、POD － PAGE图谱无显著差异。结论 两种生态环境对蔓荆子遗传特征无影响。
关键词:蔓荆子; 聚丙烯酰胺凝胶电泳; 指纹图谱
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2010． 10． 077
中图分类号:R284． 1 文献标识码:B 文章编号:1008-0805(2010)10-2590-02
蔓荆子为马鞭草科植物单叶蔓荆 Vitex trifolia L． var． simpllic-
ifolia Cham．或蔓荆 Vitex trifolia L．的干燥成熟果实［1］，具有疏散
风热、祛风胜湿、清利头目的功效。山东是单叶蔓荆的主产区。
目前我省单叶蔓荆的生境主要有:海岸沙滩、河岸沙滩、盐碱地。
实验研究［2，3］表明环境对蔓荆子有效成分及含量影响较大。为
进一步探讨环境与蔓荆子种内变异的关系，揭示其种内变异的规
律，本研究采用蛋白质和过氧化物酶同工酶电泳两种生化标记方
法对来源于山东省不同生境下的单叶蔓荆子进行了分析研究，以
期为种质资源的收集和药效成分研究提供参考。
1 仪器与材料
1． 1 仪器 DYY －Ⅲ型多用电泳仪，DYY －Ⅲ28D 型垂直电泳
槽，EDAS － 290 凝胶成像紫外分析仪，LD5 － 2A 低温离心机，
LGR16 － W型高速冷冻离心机，FA1104 型电子天平，SHZ － 3 型
循环水真空泵，真空干燥器，KQ －50 型超声波清洗器等。
1． 2 试剂 三羟甲基氨基甲烷，丙烯酰胺，过硫酸铵，N，N －亚
甲基双丙烯酰胺，甘氨酸，40%蔗糖溶液，考马斯亮蓝 R250，醋酸
联苯胺，四甲基乙二胺，溴酚蓝等，所用试剂均为分析纯。
1． 3 实验材料 新鲜单叶蔓荆 Vitex trifolia Lin． Var． simplicifolia
果实采于威海海岸沙滩、牟平海岸沙滩、大汶河河岸沙滩，冷冻保
鲜。
2 方法
2． 1 蛋白质 PAGE指纹图谱分析
2． 1． 1 样品液制备 称取新鲜蔓荆子药材约 1． 0 g，加入 2 ml稀
释 4 倍的浓缩胶缓冲液(pH8． 9) ，超声提取 30 min，3 500 r /min
离心 15 min，取上清液加等体积的 40%蔗糖溶液，作为供试品溶
液，4 ℃冰箱内冷藏，备用。
2． 1． 2 蛋白质电泳 参照文献［4］方法安装好电泳槽，凝胶板参
照文献［5］方法制备。用微量进样器吸取样品提取液 20 μl，缓
缓注入样品槽底部，在负极槽电极缓冲液中加入 1 滴溴酚蓝指示
剂示踪，将电泳槽正负极与电泳仪正负极相连，电泳开始时控制
电流 15 mA，样品进入分离胶后，电流调整至 25 mA。待示踪指
示剂行至距琼脂层约 1 cm时，关闭电源，停止电泳。整个过程约
需 3 h，为防止温度过高，电泳在冰箱内进行。
2． 1． 3 染色与保存 打开电泳槽，取出胶板，标记前沿。将凝胶
板浸于考马斯亮蓝染色液内，在恒温培养箱中 37 ℃染色 1 ～ 2 h，
至谱带清晰。胶板染色后，用蒸馏水洗去凝胶表面附着的染料，
再将胶板浸于脱色液中脱色，直至谱带背景清晰。放入 7%醋酸
液中长期保存。
2． 1． 4 蛋白质指纹图谱分析 蛋白质 PAGE 图谱见图 1。胶板
用 EDAS － 290 凝胶成像紫外分析仪成像分析。以泳道中各谱带
所在位置 Pos为横坐标，谱带透光率 OD 为纵坐标作图，绘制各
谱带的透光率图并分析谱带相似度，结果见图 2。
1，2:威海蔓荆子;3，4:大汶河蔓荆子;5，6，7，8:牟平蔓荆子
图 1 蛋白质电泳指纹图谱
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时珍国医国药 2010 年第 21 卷第 10 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2010 VOL． 21 NO． 10