全 文 ：2 (X) 3年 so (6) 微 生 物 学 通 报 · 29 ·
酮康哩是一种细胞色素 4P 50 抑制剂 , 能够抑制真菌细胞膜基本组成成分— 麦角街醇的合成 , 从而引起细胞膜结构和功能的改变〔` 0] 。 19 98 年 atK a几犯1。 p~ 欢i iew c z 等报
道通过诱变获得的新月弯抱霉高产菌 , 其抗酮康哇的能力比亲株提高了 2 . 5 倍 , 突变株
的 45P 0 酶含量比亲株高出至少 3 倍
, 转化率提高了 4 . 4 倍囚 。 1993 年 eK inz ,~ ik 等报
道酮康哩对新月弯抱霉 4P 50 酶活性具有抑制作用 , 进而影响氢化可的松的产量回 。 本
文通过筛选酮康哩抗性突变株可 以有效地提高突变株的正变频率 。 这些研究均表明新
月弯抱霉酮康哇抗性与其街体 1 1俘经化能力之间有一定的相关性 。
由于细胞色素 4P 50 酶分布在细胞膜或线粒体膜上 , 可能酮康哩抗性突变菌株 4P 50
酶结构发生改变后引起酶活性的变化 , 或者膜结构和通透性的改变对底物吸收或产物
分泌产生影响 , 关于此方面的研究我们正在深人进行 。
参 考 文 献
[ l ] iWb
l田 ls k a D , M i l e` 王庄 ek K , R l u l li ji o w s` a A , et a l
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19 83
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2 15 ~ 2 2 3
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固定化啤酒酵母废菌体吸附 P d Z 十 的研究 `
谢丹丹l,2 刘月英“ ` 吴成林` 傅锦坤3 薛 茹,
(厦门大学生命科学学院 厦门 361 侧〕5 )` (厦门海洋职业技术学院 厦门 3 6 10 12 )“
(厦门大学化学化工学院 厦门 3 61 X() 5 ) 3
摘要 : 用 2%海藻酸钠与 1% 明胶混合为包埋剂固定啤酒酵母废菌体 。 S EM 、 苏射线能谱和
ET M研究结果表 明 , 该固定化啤酒酵母废菌体 ( sI CWB ) 颗粒中的菌体分布较均匀 ,
ls CWB不仅能吸附对 + , 而且能将 dzP + 还原成 可 。 sI CW旧 吸附 时 十 的最适 pH 值为 3 . 5 。
在 30 ℃ 一 70 ℃范围内 , 吸附作用不受温度的影响 。 吸附作用是一个较快的过程 , 在最初的
5而 n 内吸附量可达最大吸附量的 36 % 。 吸附作用受 sI cWI〕浓度 、 dzP 十起始浓度和共存离子
的影响 。 在起始 时 + 浓度 10 呵L 、 ls CW B 浓度 1 . 8梦L 、 P3H . 5 和 30 ℃条件下振荡 吸附
90 而 n , 吸附量为叨 . 6m g / g 。 以 0 . smol L/ 盐酸作为解吸剂解吸率达 98
.
7 %
。 连续吸附与解吸
附试验结果表明 , CIS 珊 的最大饱和吸附量为 46 . 3呵 g , 解吸率为 98 % 。
关键词 : 啤酒酵母废菌体 , 固定化 , 生物吸附 , 把
中图分类号 : 09 3 9 . 5 文献标识码 : A 文章编号 : 02 53 一265 4 〔2 0 3 ) 06 ~ 《X )2 9一 06
、 国家自然科学基金资助项目 ( No . 29 87 6 02 6 )
R 句ce t GI 翅 z翩 师 Chin a aN h O l la] aN t u 王司 氏i en , Fun ( l ( No . 2 98 76 0 26 )
作者还有 : 古萍英 3
联系人 elT : 05 92 一 1853 60 , E一耐 l : 1 11犯 119 64D I @ is n a . c , . cn收稿 日期 : Zf们夕 _ 11 _汉 修回 日期 : 口丈丫】2 _ 12 _ 16
DOI : 10. 13344 /j . mi crobi ol . chi na . 2003. 06. 008
微 生 物 学 通 报 2 (X )3 年 30 ( 6 )
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30 ℃ for 90 而 n . 98 . 7% of 对 + ads obr ed on B C职卫 。oul d be des obr 闭 iw ht o . s n l o l / L clH . nI p a c k掀一 b ed ~
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把在化工 、 电子等工业上有广泛的应用 , 但把资源稀少 。 因此 , 从含把的废料 、
废液和废水等 “ 二次资源 ” 中回收把具有重要的经济价值 。 在微生物吸附贵金属的研
究中 , 我们曾从金矿矿坑水分离 、 筛选得到一株吸附 、 还原 dzP 十能力较强 的菌株地衣
芽抱杆菌 0R 8 , 并研究了该菌株 [`〕及其固定化菌体图吸附 dzP + 的特性 。 然而 , 如能用发
酵工业的残留菌体制备固定化菌体作为 dzP + 的吸附剂 , 将具有重要的经济意义和社会
意义 。 因为这些生物材料来源丰富 、 价格低廉 , 它们的利用不仅可 以降低生物吸附剂
的生产成本 , 而且可以提高发酵工业中废菌体的利用价值或减少废菌体对环境的污染 。
本文报道用啤酒酿造厂的啤酒酵母废菌体作为生物材料 , 用海藻酸钠和明胶为包埋剂
制备的固定化菌体吸附 dzP + 的一些特性 。
1 材料与方法
L l 菌体的制备
将来 自啤酒厂的啤酒酵母废菌体用蒸馏水洗 2 一 3 次 , 离心 ( 3 , 50 r/ m in , 10而n) ,
收集菌体 , 80 ℃下烘干 , 研磨成细粉后干燥保存 。
1
.
2 固定化菌体的制备
海藻酸钠 一 明胶包埋法 : 称取 2 9 海藻酸钠和 1g 明胶 , 加适量的蒸馏水加热溶解 ,
然后加人 L 2 9菌体和补加蒸馏水至 l o mL , 混合均匀后用注射器滴人 4 % C aC 几溶液中 ,
静置固化 24 h , 洗净备用 。
海藻酸钠包埋法 : 除不加明胶外 , 其它的步骤同上 。
聚乙烯醇 ( PV A ) 一海藻酸钠包埋法 : 以 2 % VP A 加 1% 海藻酸钠作包埋剂 , 其它的
步骤同上 。 、
海藻酸钠 一明胶一VP A 包埋法 : 以海藻酸钠 、 明胶和 PV A 各 1%作包埋剂 , 其它的步
2以〕 3年 0 3(6 ) 微 生 物 学 通 报 · 1 3·
骤同上 。
1
.
3固定化菌体机械强度及耐酸性测定
按照文献 仁 31的方法测定 。
L4 固定化菌体的分批吸附与解吸附试验
除另有说明外 , 准确称取 18 . omg 固定化菌体 (以干重计 ) , 加人 l o ms/ L 的 dzP
十
( P dC lz) 溶液 10 . o mL , 在 p壬13 . 5 和 30 ℃下振荡 ( 130r /n l il l ) 吸附卯~
, 取上清液用 Jas -
im 法囚或用 A 80 原子吸收分光光度法测定 dzP + 浓度 。 按文献 仁2」计算固定化菌体对
dzP
+ 的吸附率和吸附量 。
将上述吸附了 dzP 十 的固定化菌体 , 用 I )H3 . 5 的水洗涤 2 次 , 弃上清液 ; 分别加人
不同的解吸液 10 . 0毗 , 室温振荡解吸 90 面 n , 测定解吸液 dzP + 浓度 , 按文献 「2」计算
解吸率 。
1
.
5 填充床反应器中的连续吸附与解吸附试验
连续吸附试验 : 称取 0 . 6 9 (以干重计 ) 固定化菌体填人吸附柱 (堆积高度 l o cm 左
右 ) , 将 50呵 L的 dzP + 溶液以 3 n止 /imn 的流速从吸附柱上方流下 , 在吸附柱下方定时取样 , 测定 时 主浓度 , 至流出液浓度达流人液浓度的 95 % 一 98 % 时停止进液。
连续解吸附试验 : 将解吸液以 3 11止 /而 n 的流速从吸附柱上方流下 , 在吸附柱下方定
时取样 , 测定 dzP 干浓度 , 直至流出液浓度小于 sms/ oL
1
.
6 扫描电子显微镜 ( S EM ) 与透射电子显微镜 ( T EM ) 表征
s E M 表征 : 将固定化菌体颗粒真空干燥后置于溅射仪中镀金 10 人, 然后在 比。 场
发射扫描电子显微镜 (德国 LE O 公司 ) 下观察 。
TE M 表征 : 将固定化菌体与 dzP 十 溶液接触不同时间 , 现场取样 , 将固定化菌体颗
粒磨碎 , 用具有聚乙烯醇缩甲醛膜的铜网蘸取样品 , 置滤纸上室温干燥 , 用透射电子
显微镜 ( JE M l o CXl l 型 ) 在加速电压 l o kV 下观察 。
2 结果
2
.
1 固定化方法的选择
对各种固定化菌体的成球性 、 机械强度和耐酸性进行比较 。 结果表明 , 用 2% 海藻
酸钠与 1% 明胶混合作为包埋剂制备的固定化
菌体 , 其机械强度 、 成球性和耐酸性均比其它
几种方法制备的固定化菌体好 。 固定化菌体颗
粒与 dzP 十溶液接触 24 h 后在 SEM 下观察 , 结果
表明 , 固定化菌体颗粒上的酵母菌体完整 , 并
较均匀地分布于固定化载体中 (图 1 ) ; X 射线
能谱分析表明 , 固定化菌体能够从 dP c lZ 溶液
中吸附 dP (图 2 ) 。 比较与 dP C12 溶液接触 的
(图 3a) 和不接触的 (图 3b) 的固定化菌体的
TE M 图 , 可见前者菌体上存在电子不透明的微
粒 , 说明该固定化菌体不仅能吸附 dzP 斗 而且能
将 dzP 十 还原成 d0P 微粒 。 以下试验均采用 2 %
图 1 固定化啤酒酵母废菌
体的 S EM 照片 ( 5 (X) x )
微 生 物 学 通 报
1 % 明胶混合包埋啤酒酵母废菌体 。
20 3 年 30 ( 6 )
海藻酸钠与
{
C I川RC {犷钾瞥一犷一~ 一犷一丁甲 , 一护一一一厄二言Fu l l Se a l e 2 12 2 e t s c u r s o r: 5 49 9 k e v ( 22 c t s ) k e v
图 2 固定化啤酒酵母菌体吸附 dzP 十 的 X一射线能谱
2
.
2 固定化啤酒酵母废菌体分
批吸附 R r+ 的特性
2
.
2
,
1 吸附时间的影响 : 分别
将固定化菌体与 dzP 十溶液接触
吸附 5 、 15 、 3氏 45 、 60 、 90
和 120 面 n , 结果吸附量分别为
15
.
3
、
25
.
1
、
3 2
.
2
、
3 5
.
6
、
37
.
6
、
40
.
6 和 42 . 2 呵 g 。 说明固定化菌体对 R f + 的吸附量随
吸附时间的延长而增加 , 但在
图 3 固定化菌体吸附 dzP + 的 T EM 照片 ( x 10 洲刀 )
最初 s im n 内 , 吸附量已达 90 而 n 时的 37 . 7% , 90 面 n 之后吸附量仅增加 1 . 6ms/ g
。
2
,
.2 2 p H 值的影响 : dP C几溶液在 p H ) 4 时会产生絮状沉淀 , 因此试验将 dP c石溶液
的州值分别调至 1 . 0 、 2 . 0 、 3 . 0 、 3 . 5 和 3 . 8 进行吸附试验 。 结果吸附量分别为 认
.10 6
、 犯 · 3 、 40 . 6 和 38 . 6呵g 。 说明溶液的 声值对固定化菌体吸附 dzP 十影响较大 , 其
最适 州值为 3 . 5 。
.2 .2 3 温度的影响 : 在不同的温度下进行吸附试验 。 结果表明 , 在 东 1认 30 、 40 、
50
、
O6 和 70 ℃下 , 吸附量分别为 19 . 8 、 20 . 7 、 40 . 6 、 叨 . 8 、 41 . 0 、 42 . 4 和 42 . 5 mg /go
说明在 5 和 10 ℃下 , 固定化菌体吸附 dzP + 的能力明显降低 , 而在 30 ℃ 一 70 ℃范围内 ,
温度对吸附作用的影响不大 。
2
.么4 固定化菌体浓度的影响 : 用不同的固定化菌体浓度 ( 0 . 45 一 3 . 61 刃)L 进行吸附
试验 。 结果 (图 4 ) 表明 , 固定化菌体对 dzP + 的吸附率随着固定化菌体浓度的提高而提
高 , 而吸附量则反之 。 当固定化菌体浓度为 0 . 45 翻L 时 , 吸附量为 71 . 8呵 g ; 当固定化菌体浓度为 .3 6 19 L/ 时 , 吸附率为 87 . 5% 。
2
.
2
.
S dzP
+ 起始浓度的影响 : 用不同的 dzP + 起始浓度进行试验 。 结果 (图 5 ) 表明 ,
在 dzP ` 起始浓度 25 一 25 Om g几 的范围内 , 固定化菌体的吸附量随着 dzP + 起始浓度的提
高而增大 , 在 2 5耐 L 时 , 吸附量达 64 . 6mg / ;g 在 25 mg 几 时 , 吸附率为 91 % , 随着
dzP
十 起始浓度的提高 , 吸附率则降低 。
2X() 3 年 30 (6 ) 微 生 物 学 通 报
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0 5 0 1 00 1 5 0
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p (菌体 ) / g L一 , + )/ gm L一 1
图 4 固定化菌体浓度对吸附作用的影响
一口一吸附量 , 一 . 一 吸附率
.2 .2 6 共存 离 子 的 影 响 : 在 p 3H . 5 、
lo
xx】
g(P 犷+ L/ 溶 液 中 分 别 加 人 灯 + 、
B矛十 、 usA
+ 和 bzP 十 等金属离子 (终浓度
均为 l o gm / )L , 以不加的为对照 。 结果
(表 l) 表明 , 在固定化菌体吸附 P子十 的
系统中 , 当有其它所试的金属离子存在
时 , 固定化菌体吸附 dzP + 的能力均有不
图 5 时 + 起始浓度对吸附作用的影响
一口一吸附量 , 一 . 一 吸附率
表 1 共存离子对固定化菌体吸附时 十的影响
共存离子 吸附量 (州 g ) 下降率 ( % )
0.16.3947.5
ù
6
刁.ù、J
24403217燃+bzPaB护usA
同程度的降低 , 这可能是由于上述金属离子与 dzP + 竞争菌体上的结合位点的结果 。
、 ,少ō内污一唯l以ùOJ月, .工]O了RS
2
.
3 固定化菌体的分批解吸附
分别用不同的解吸剂对已吸
附 P d Z + 的固定化菌体颗粒进行解
吸附 。 结果 (表 2 ) 表明 , 盐酸的
解吸效果最好 , 其浓度为 0 . smo F L
时 , 洗脱率达 98 . 7% 。 因此 , 在
连续解吸附试验中以 0 . smo lL/ 盐
酸为解吸剂 。
表 2 不同解吸剂解吸效果的比较
解吸剂 解吸率 (% ) 解吸剂 解吸率 ( % )
盐酸 ( l m o l /L )
盐酸 ( 0 . 5加。 /L )
H卜马 ( 0 . s rn o l /L )
草酸 ( 0 . 5 n l o l /L )
入 a 〔:1( 0 . 5 1加 l / L )
醋酸 ( 9% )
N日劫CI ( 0 . s n l d /L )
尿素 (o . smol zL )
49
.
7
24
.
6
7
.
1
2
.
4
2
.
4 填充床反应器中的连续吸附与解吸附试验
在填充床反应器中 , 固定化菌体对 dzP + 的吸附量 、 吸附率和解吸率在首次吸附 -
解吸附时分别为 46 . 3 n lg / g 、 8 % 和 98 % , 而连续吸附与解吸附至第 3 次时 , 则分别为
19
.
s m g / g
、
6 1% 和 9 8% 。
3 讨论
应用于吸附金属 的菌体固定化方法有将菌体吸附在惰性载体上 、 包埋在多聚物中 、
共价键合于载体和用交联剂交联等困 。 本文采用包埋法 , 通过对几种包埋基质的比较 ,
选用 2% 海藻酸钠与 1% 明胶混合作为包埋基质固定啤酒酵母废菌体 。 用该法制备的固
定化菌体具有机械强度高 、 成球性好和耐酸等特性 。 从 s E M 、 x 射线能谱和 1飞 M 研究
结果表明 , 该固定化菌体颗粒中的菌体分布较均匀 , 固定化菌体不仅能吸附 dzP 十 而且
能将 dzP 十 还原成 d0P 。 这与地衣芽抱杆菌能吸附 、 还原 dzP + 的特性相同 [`飞
在分批吸附试验中 , 固定化菌体吸附 dzP + 的特性与固定化地衣芽抱杆菌吸附 P dZ +
的特性相似川 , 在 dzP + 起始浓度 10呵 L 、 固定化菌体浓度 1 . 8留L , pH3 . 5 和 so ℃下吸
附 90 而 n , 固定化菌体对 dzP + 的吸附量为 4D . 6mg / g 。 与 固定化地衣芽抱杆菌 吸附
dzP
+ 〔 2〕、 固定化芽枝状枝抱霉菌体球吸附 uaA ` 困 、 微小真菌 (而 c omyr
c
et ) 吸附绳 ` 川
·
34
· 微 生 物 学 通报 2朋 3 年 30 (6)
和 A S c叩人郊zum l刃面3um 、 st 子’eP t o 了孙℃ e s ~
us
、
ucF
us 哪 ic咖。 吸附 nzZ + 、 c了+ 、 iN Z + 阔 比较 , 固定化啤酒酵母废菌体在把的吸附回收中具有较好的应用前景 。
在连续吸附一解吸附的初步研究 中 , 固定化菌体对 dzP + 的最大饱和吸附量为
46
.
3mg / g
, 使用 3 个循环的解吸附率仍达 98 % 。 若进一步优化反应条件将有可能提高固
定化菌体对 dzP 十 的吸附能力 , 并延长固定化菌体在填充床反应器中的寿命 。
参 考 文 献
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棕色固氮菌 n办 敲除菌株的构建 `
汪道涌` ,2 谢 维` 毛晓华2“
(东南大学遗传学研究中心 南京 21 以X旧 )` (东南大学医学院生物化学与分子生物学系 南京 21 仍的 ) 2
摘要 : 从 八加勿 b~ “
刀以。刀成 i 中通过 cP R扩增了 5’ 和 3’ 端分别缺失 264 饰和 26 1如 的 刀娜 ,片
段 , 克隆至载体叫1C 8 , 形成重组质粒叫cs , 再通过同源重组的方法 , 将 叫cs 插人 击。动 -
`
~
沉刀以。 了诚 i 的哪 中 , 形成 了那 阻断突变体 sU I , 经 阮 l lht e n l 杂交和 PCR 扩增 , 证明所得确为 刀湃 阻断突变株 。 su l 在外加氮源的 B BNG 培养基中能够快速生长 , 但在 B t血k , s 无
氮培养基中 , 生长却极其缓慢 , 表明 刀那基因的破坏 , 已造成 su l 的固氮能力接近完全丧
失 。 该突变体的成功构建 , 为进一步从中纯化固氮酶两组分 , 研究 n尹对固氮酶结构及功
能的影响及 流s 与 刀梦, 之间的关系奠定了良好的基础 。
关键词 : 凡切勿 b~
瓦了记勿刀 d“ , 护娜 敲除 , 固氮
中图分类号 : 9Q 3 文献标识码 : A 文章编号 : 025 3 ~ 2654 (20 3 ) 06 一田34 一。
T B E C O N ST RU C n 0 N AN D AN A L Y S IS ( ) F A n湃 D IS R U F FI ON 加1兀 AN T
双叭人 G D a `卜Y耐 ,2 xI E W七11 M AO 兀。 H u a早
(& 砚 c名衣活而己。 兀丙& 几沈 r尸又” `尹二召“ , t 厄乃11` e此妙 , 肠孑嘛刀9 21 以】刃 ) `
场泊山把瓜 of B众兀石e冲山卿 山以 乃全。肠口由 r icB l`吸夕 , S 刀`触心` 。 h￡,祀招妙 , aN 蟒嗒 ZI J x粗
川比 t , d : A (℃ n t l目 和 d ion of 刀娜 , d es ig l at 司 了娜 ` , was an 甲il if记 五切 n 了俪 `人 CZ et 护硫成如尹以“ . hT e 刀娜 ,~ d加以1
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* 东南大学医学基金资助课题 (oN . 92 3 0 n 67 )
* * 联系人 elT : 02 5一327 23 14 , E ·~ l : iwe
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收稿日期 : 2X() 2~ 11一以 , 修回日期 : 2X() 2一12 -20