全 文 ：三叶青提取物对 A375 细胞增殖、酪氨酸酶
活性及黑色素合成的影响
吕雯婷1，顾书畅2，丁 丽1，张立飞2
(浙江医药高等专科学校 1．药学系;2．生物与食品系，浙江 宁波 315100)
摘要:目的 探讨三叶青乙醇提取物对人恶性黑色素瘤 A375 细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑色素合成的影响。方法 采用 MTT比色法，
测定不同浓度三叶青乙醇提取物对 A375 细胞体外抑制作用;比色法测定酪氨酸酶活性和黑色素含量。结果 在质量浓度为 1 ～ 625
μg /ml范围内，随着三叶青乙醇提取物浓度增大可抑制 A375 细胞的增殖(P ＜ 0． 01) ;三叶青乙醇提取物浓度在 1 ～ 5 μg /ml 时，对酪
氨酸酶活性和黑色素合成抑制有增加趋势;而在 25 ～ 625 μg /ml时，对 A375 细胞有一定毒性。结论 三叶青乙醇提取物在一定浓度范
围内(1 ～ 625 μg /ml)能抑制 A375 细胞的增殖，且呈剂量依赖关系。
关键词:三叶青乙醇提取物;A375 细胞;细胞增殖;酪氨酸酶;黑色素合成
中图分类号:R285． 5 文献标志码:A 文章编号:1673 － 4610(2011)10 － 0624 － 03
基金项目:浙江省大学生科技创新活动计划(新苗人才计划) (编号:ZJPCKJCX201005)
作者简介:吕雯婷，2009 级学生，E-mail:nbncdl@ 163． com
通讯作者:丁 丽，硕士，讲师，主要从事中药药效物质基础研究，Tel:0574 － 88221493，E-mail:dingl@ mail． zjpc． cn． net
Primary Study on effect of Ethanol Extract of Tetrastigma Hemsleyanum
Diels et． Gilg on Inhibiting Proliferation of Melanoma A375 Cells
L Wen-ting，GU Shu-chang，DING Li，ZHANG Li-fei
(Department of pharmacy，Zhejiang Pharmaceutical College，Ningbo，Zhejiang 315100，China)
Abstract:Objective To study the effects of the ethanol extract of Tetrastigmatis hemsleyani Diels et Gilg on the inhibition
of proliferation and the tyrosinase activity and melanogenesis in melanoma A375 cells． Methods The time-effect and
quality-effect of the ethanol exact of Tetrastigmatis hemsleyani Diels et Gilg on melanoma A375 cells were measured by
methyl thiazolyltet razolium(MTT)colorimetric assay． The tyrosinase activiry and melanin content were measured by
colorimetry assay． Results When the concentration of the ethanol extract of Tetrastigmatis hemsleyani Diels et Gilg was
range from 1 μg /ml to 625 μg /ml，a proliferation inhibiting was shown with the increase of the concentration． When the
concentration was in 1 ～ 5 μg /ml，a positive effect of tyrosinase activity and melanogenesis was shown． When the
concentration was in 25 ～ 625 μg /ml，cytotoxic effect occurred． Conclusions There is a concentration-dependent
relationship between the ethanol extract of Tetrastigmatis hemsleyani Diels et Gilg and the inhibition effect of A375 cells
proliferation．
Key words:the ethanol extract of Tetrastigmatis hemsleyani Diels et Gilg;A375 cells;cell proliferation;tyrosinase;mel-
anogenesis
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Pharmacy Today ·2011 10 Vol． 21 No． 10·
三叶青(Tetrastigmatis hemsleyani)为葡萄科崖爬藤
属植物三叶崖爬藤(Tetrastigmatis hemsleyani Diels et
Gilg) ，具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛等功效，民间
主要用于治疗小儿高热惊厥、肺炎、肝炎及病毒性脑膜
炎等疾病［1］。近几年来，文献报道三叶青在体外可抑
制肿瘤细胞的增殖和诱导其凋亡［2 － 5］。在前期预试中
发现，三叶青的乙醇提取物对黑色素瘤 A375 细胞表现
出较强的体外抑制作用。本研究通过观察三叶青乙醇
提取物对人恶性黑色素瘤 A375 肿瘤细胞的增殖、酪氨
酸酶的活性及黑色素合成的影响，旨在为今后深入研
究三叶青的抗肿瘤活性机制提供实验依据。
1 材料
1． 1 材料
1． 1． 1 三叶青原料 三叶青饮片产自云南，购自宁波
鄞州医药药材公司，经鉴定为 Tetrastigma hemsleyanum
Diels et． Gilg。
1． 1． 2 细胞株 人恶性黑色素瘤细胞株 A375 购自上
海中科院细胞生化所。
1． 1． 3 试剂与仪器 MTT (美国 Amresco 公司) ;RP-
MI 1640 培养基(美国 Invitrogen公司) ;胎牛血清(上海
蓝季科技发展有限公司) ;胰岛素(上海蓝季科技发展有
限公司) ;5-氟尿嘧啶注射液(天津金耀氨基酸有限公
司) ;Triton X-100(美国 Amresco 公司) ;L-DOPA(美国
Sigma公司) ;酶标仪(Bio-Rad) ;倒置生物显微镜(Mot-
ic) ;CO2 培养箱(力康生物医疗科技控股有限公司)。
2 方法
2． 1 药物及其溶液制备
2． 1． 1 三叶青提取物溶液制备 三叶青饮片，95%
(φ)乙醇回流提取 3 次，每次 1 h，60%乙醇回流提取 3
次，每次 1 h，合并提取液，过滤，减压浓缩得乙醇浸膏。
取三叶青乙醇提取物适量，用 1 ml DMSO 溶解，用含
10%(φ)灭活新生小牛血清 RPMI-1640 培养液稀释，分
别配制成 20、100、500、2 500 mg /L溶液，备用。
2． 1． 2 阳性对照溶液制备 精密量取 5-氟尿嘧啶注
射液适量，加入 1 ml DMSO，用含 10%(φ)灭活新生小
牛血清 RPMI-1640 培养液稀释，分别配制成 20、100、
500、2 500 mg /L溶液，备用。
2． 2 细胞培养
A375 细胞用含 10% 灭活新生小牛血清 RPMI-
1640 培养液在 37 ℃、5% CO2、饱湿条件下培养。
2． 3 三叶青提取物对人恶性黑色素瘤 A375 细胞增殖的
取对数生长期 A375 细胞用 0． 25%的胰蛋白酶进
行消化后，以 5 000 个 /孔的密度接种于 96 孔培养板，
培养 24 h后，分别加入 500 mg /L的三叶青乙醇提取物
溶液 50 μl，终质量浓度为 125 mg /L。阴性对照组加 50
μl培养液，阳性对照组加入 500 mg /L的 5-氟尿嘧啶溶
液 50 μl，每种药物重复 3 孔，重复 3 次，另设 1 个空白
对照孔，分别在 24、48、72、96 h测定细胞活性。
2． 4 三叶青提取物对人恶性黑色素瘤 A375 细胞增殖
的量效关系
取对数生长期 A375 细胞用 0． 25 %的胰蛋白酶进
行消化后，配成 3． 3 × 104 个 /L 的细胞悬液接种于 96
孔培养板，每孔加细胞悬液 150 μl;培养 24 h 后，分别
加入 4、20、100、500、2 500 mg /L 的三叶青乙醇提取物
溶液 50 μl，终质量浓度为 1、5、25、125、625 mg /L。阴
性对照组加 50 μl培养液，阳性对照组分别加入 4、20、
100、500、2 500 mg /L 5-氟尿嘧啶溶液 50 μl，终质量浓
度为 1、5、25、125、625 mg /L。各个浓度药物设 3 复孔，
重复 3 次，另设 1 个空白对照孔，分别在 48 h测定细胞
活性。
2． 5 胞活性测定
每孔加入 5 g /L MTT 20 μl，培养 4 h 后，弃去上清
液，加入 150 μl DMSO震荡 10 min，570 nm波长下测定
吸光度值(A值)。按下式计算药物对肿瘤细胞生长的
抑制率。
肿瘤细胞生长抑制率 =(1 －实验组平均 A 值 /对
照组平均 A值)100%
2． 6 酪氨酸酶活性的测定［6 － 8］
待 A375 细胞生长至近融合状态，按照“2． 4”项下
方法，加入不同浓度的乙醇提取物溶液，作用 48 h后弃
培养液，用 pH7． 4 的 PBS 洗涤 2 次，每孔加入 1%(φ)
Triton X-100 溶液 90 μl，迅速置 － 80 ℃冻存 30 min，随
后室温融化使细胞完全裂解，37 ℃预温后加入 2． 5
mmol /L多巴溶液 100 μl，37 ℃反应 0． 5 h，490 nm处测
定 A值，每一浓度设 3 个复孔，重复 3 次，取平均值。
酪氨酸酶活性抑制率 =(1 －各浓度平均 A 值 /对
照组平均 A值)100%
2． 7 黑色素含量测定［6，7］
将对数生长期 A375 细胞浓度调整为 3． 3 × 104 /L，
接种于 24 孔板，每孔 1． 5 ml，24 h 后加入不同浓度的
各提取物溶液 0． 5 ml，对照组不加。培养 2 d 后，用
0. 25%的胰蛋白酶进行消化后，将细胞收集入离心管离
心 10 min(1 000 r /min) ，倾去上清液，再用 PBS 洗 2 次
后，用 1 mol /L 氢氧化钠溶液(含 10% DMSO)在 37 ℃
作用 48 h，充分裂解细胞和溶解黑色素颗粒，每孔加入
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·2011 年 10 月第 21 卷第 10 期· 今日药学
100 μl裂解液，470 nm 处测定 A 值。每一质量浓度设
3 个复孔，重复 3 次，取平均值。
2． 8 统计方法
采用 SPSS17． 0 处理，实验数据用(珋x ± s)表示，用 t
检验进行统计分析，P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。
3 结果
3． 1 三叶青提取物对人恶性黑色素瘤 A375 细胞增殖
的时效关系
A375 细胞贴壁培养 24 h 后，用 MTT 法检测发现，
正常组细胞活性逐步增加，72 h 活性达到最高，以后因
细胞过度增殖而导致活性急剧下降;加入三叶青乙醇
提取物后，细胞增殖受到抑制，48 h对细胞活性的抑制
率最高(见表 1)。
表 1 三叶青乙醇提取物对 A375 肿瘤细胞增殖的影响 (珔x ± s)
药物 ρ /(μg /ml)
抑制率(%)
24 h 48 h 72 h 96 h
空白对照 － 0 0 0 0
三叶青提取物 1 0． 54 ± 0． 60＊＊▲ 17． 35 ± 8． 77＊＊▲ 9． 31 ± 3． 86＊＊▲ 4． 11 ± 1． 94＊＊▲▲
5 6． 03 ± 3． 08＊＊▲▲ 28． 68 ± 6． 71＊＊ 12． 87 ± 4． 74＊＊ 10． 94 ± 4． 95＊＊
25 12． 95 ± 2． 46＊＊▲ 36． 32 ± 11． 74＊＊▲▲ 28． 39 ± 5． 69＊＊ 19． 44 ± 6． 88＊＊
125 23． 67 ± 3． 15＊＊▲▲ 41． 45 ± 11． 74＊＊▲ 36． 36 ± 12． 04＊＊▲▲ 23． 84 ± 2． 98＊＊
625 60． 02 ± 8． 10＊＊▲ 93． 86 ± 10． 71＊＊ 88． 31 ± 6． 20＊＊▲▲ 58． 46 ± 7． 65＊＊▲
5 － Fu 1 18． 91 ± 11． 72＊＊ 34． 99 ± 12． 09＊＊ 45． 06 ± 7． 90＊＊ 58． 90 ± 9． 92＊＊
5 22． 83 ± 4． 11＊＊ 49． 14 ± 8． 13＊＊ 67． 88 ± 7． 04＊＊ 69． 81 ± 2． 59＊＊
25 26． 72 ± 3． 75＊＊ 68． 90 ± 6． 53＊＊ 84． 61 ± 4． 40＊＊ 90． 63 ± 4． 09＊＊
125 40． 30 ± 12． 09＊＊ 89． 00 ± 5． 46＊＊ 91． 50 ± 4． 22＊＊ 91． 85 ± 4． 09＊＊
625 40． 72 ± 9． 39＊＊ 91． 58 ± 4． 37＊＊ 93． 22 ± 2． 18＊＊ 94． 80 ± 2． 93＊＊
和空白组比较:* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01;与 5 － Fu比较:▲P ＜ 0． 05，▲▲P ＜ 0． 01
3． 2 三叶青提取物对人恶性黑色素瘤 A375 细胞增殖的
三叶青提取物各浓度组和 5-Fu 处理组作用 A375
细胞后，显著抑制了 A375 细胞的增殖，细胞抑制率与
空白对照组比较，差异均有统计学意义(P ＜ 0． 01)。与
5-Fu组比较，1、25、125 μg /ml 三叶青提取物的细胞抑
制率差异有统计学意义(P ＜ 0． 05) ，且呈浓度依赖性，
625 μg /ml时与相应浓度的阳性对照药物作用相似(见
表 2)。
表 2 三叶青乙醇提取物对 A375 细胞酪氨酸酶活性和黑色素
合成的影响(珔x ± s)
ρ(μg /ml) 酪氨酶活性 黑色素含量
0 0． 063 ± 0． 014 0． 086 ± 0． 002
1 0． 073 ± 0． 003＊＊ 0． 106 ± 0． 006＊＊
5 0． 065 ± 0． 004 0． 096 ± 0． 004＊＊
25 0． 060 ± 0． 007 0． 084 ± 0． 003
125 0． 058 ± 0． 009 0． 081 ± 0． 005
625 0． 017 ± 0． 008＊＊ 0． 050 ± 0． 003＊＊
和空白组比较:* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01
3． 3 酪氨酸酶活性的测定
由表 2 可见，乙醇提取物在 25 ～ 625 μg /ml浓度范
围内对 A375 细胞中酪氨酸酶活性有抑制作用，且呈浓
度依赖性，而在 1 ～ 5 μg /ml 浓度范围内则对活性抑制
作用减弱，甚至增加其活性。
3． 4 黑色素含量测定
当药物质量浓度 ＞ 25 μg /ml 时，A375 细胞中黑色
素的含量呈下降趋势，而在 1 ～ 5 μg /ml浓度范围内，黑
色素含量反而增加，说明三叶青乙醇提取物在高浓度
时对 A375 肿瘤细胞有显著的体外抑制作用。
4 讨论
恶性黑色素瘤是一种恶性程度很高的皮肤癌［9］，
其多发、易转移，目前还没有可以有效治疗黑色素瘤的
药物。在癌症的治疗用药上目前仍以化学合成药为
主，这些药物在杀灭肿瘤细胞的同时，对人正常细胞也
有很大的损害。中国传统的医药在抗肿瘤方面显示了
独有的优势，以毒副作用小而受到人们的青睐。本研
究对中国特有的中药三叶青的乙醇提取物进行体外抗
肿瘤试验，以期开发出新型抗肿瘤药物。
(下转第 648 页)
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实抗菌药物分级管理制度;加强抗菌药物购用管理;开
展抗菌药物临床应用监测与评估;使用 HIS 系统限制
抗菌药物使用天数等，使抗菌药物使用率明显下降，抗
菌药物平均疗程基本控制在 5 d以内。
4． 3 有些指标仍需要不断完善。处方评价分析中发
现仍有部分医生处方书写不规范。如患者疾病诊断字
迹潦草，造成药师在核对用药合理性时遇到困难。患
者年龄以“成”代替，导致难以判断用药剂量的准确性，
因为老年患者的药物用量为成人用量的 1 /2 ～ 3 /4。只
有准确写出患者年龄才能有利于个体化用药，便于药
师核对准确剂量。极个别医生处方仍开具 6 种以上药
物，药师应当对处方的合理性进行判断，并对医生进行
教育。对于抗菌药物联合使用的处方，除治疗疾病需
要联合使用的方案(如根除幽门螺杆菌)外，也需要根
据抗菌药物的应用指征对处方的合理性进行分
析［6 － 8］。
从以上 3 年 6 个季度的处方平均资料来看，本院
门诊用药基本合理，但仍存在一些不足。《办法》和《规
范》的实施使处方点评更趋于规范化。医院高度重视
处方点评制度，通过多渠道严格管理也取得了有效地
成果。对保证患者用药安全、有效、经济，提高医疗质
量和安全，真正做到以“患者为中心”的医疗服务起到
积极的作用。处方点评也可以推动药学人员业务能力
的提高，加强药学专业知识的学习，更好地为临床一线
提供药学服务。
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(收稿日期:2011 － 09 － 20

)
(上接第 626 页)
本研究通过 MTT 比色法、酪氨酸酶活性及黑色素
含量测定，初步探讨了三叶青乙醇提取物抗黑色素瘤
的作用机制。实验结果表明，三叶青乙醇提取物在 1 ～
5 μg /ml 浓度时，对 A375 细胞合成黑色素和酪氨酸酶
的活性有促进作用，而在 25 ～ 625 μg /ml浓度时能抑制
A375 细胞中酪氨酸酶的活性和黑色素的合成，说明三
叶青在高质量浓度时体外可能对 A375 细胞有毒性作
用。三叶青乙醇提取物抗黑色素瘤 A375 的具体作用
机制还有待于进一步研究。
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