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三叶青水提物体内、体外抗肿瘤作用的研究
丁 丽， 纪其雄， 吕雯婷， 王玉连
(浙江医药高等专科学校，浙江 宁波 315100)
收稿日期:2012-10-22
基金项目:浙江省教育厅 2010 年度科研项目 (Y201019049)
作者简介:丁 丽 (1979—) ，女，硕士，讲师，研究方向:中药药效物质基础及中药药理学。E-mail:nbncdl@ 163． com
摘要:目的 考察三叶青水提物体内、体外抗肿瘤的作用。方法 应用中药血清药理学方法，制备三叶青水提物的含
药血清。采用 MTT法观察不同质量浓度三叶青水提物及其含药血清对人宫颈癌细胞 Hela229 和人恶性黑色素瘤细胞
A375细胞的体外抑制作用;以小鼠 S180肉瘤为模型，观察三叶青水提物在体内对肿瘤生长的抑制作用。结果 三叶青
水提物对 Hela229 和 A375 细胞有增殖抑制作用，且呈现出剂量依赖性，IC50分别为 45. 60 g /L和 38. 35 g /L;三叶青水
提物含药血清高、中、低 (20，10，5 g /kg)剂量组也可抑制 Hela229 和 A375 细胞的体外增殖，IC50分别为 41. 82 g /L
和 248. 60 g /L，呈现出剂量依赖性;三叶青水提物在体内对小鼠 S180肉瘤的生长具有一定的抑制作用，高、中、低
(24，12，6 g /kg)剂量组的抑瘤率分别为 28. 24%、41. 56%和 6. 00%。结论 三叶青水提物体内、体外均具有抗肿
瘤作用。
关键词:三叶青;水提物;抗肿瘤;含药血清;Hela229 细胞;A375 细胞;S180
中图分类号:R285. 5 文献标志码:B 文章编号:1001-1528(2013)05-1076-03
doi:10． 3969 / j． issn． 1001-1528． 2013． 05． 053
三叶青 Tetrastigma hemsleyanum是葡萄科植物，以块根
或全草入药，在浙江地区常被用来治疗小儿惊厥高热、肺
炎、支气管炎、肝炎及病毒性脑膜炎等症［1］。有报道称三
叶青对多种肿瘤细胞有抑制作用［2-6］。本课题组前期研究结
果也发现，三叶青石油醚和三氯甲烷两个提取部位对
A375、Hela229、5637 及 AGS 等肿瘤细胞表现出较强的抑
制作用［7］，三叶青的三氯甲烷提取部位还能抑制 A375 细
胞中黑色素的合成［8］。还发现三叶青水提物及其小鼠含药
血清对人胃腺癌细胞株 AGS肿瘤细胞有较强地体外抑制作
用。因此，本实验进一步研究了三叶青水提物及其含药血
清对 Hela229 和 A375 细胞的体外抑制作用，并以 S180荷瘤
小鼠为模型进行了体内抗肿瘤实验，为三叶青抗肿瘤的作
用机制及活性成分的研究提供依据。
1 材料
1. 1 药材 三叶青块根饮片购自宁波市鄞州医药药材公
司，经浙江医药高等专科学校中药系杨雄志教授鉴定为
Tetrastigma hemsleyanum Diels et． Gilg。
1. 2 细胞株 人宫颈癌细胞株 Hela 229、人恶性黑色素瘤
细胞株 A375 和小鼠 S180肉瘤细胞由本校细胞实验室冻存。
1. 3 动物 清洁级昆明种小鼠，雄性，体质量 (18 ～ 26)
g，购 自 浙 江 省 实 验 动 物 中 心，许 可 证 号 SCXK
(浙)20080033。
1. 4 仪器与试药 iMark 酶标仪 (美国 Bio-Rad 公司) ，
AE21 型倒置生物显微镜 (Motic 中国公司) ，HF160W 型
CO2培养箱 (中国力申科学仪器有限公司)。MTT 购于美国
Amresco公司;RPMI 1640 培养基购自美国 Invitrogen 公司;
胎牛血清购于上海蓝季科技发展有限公司;胰岛素购自上
海蓝季科技发展有限公司;注射用环磷酰胺购自山西普德
药业有限公司。
2 方法
2. 1 药物配制
2. 1. 1 三叶青水提物制备 取三叶青饮片，碾碎，加水适
量，回流提取 3 次，每次 1 h，合并提取液，过滤，弃去药
渣，滤液浓缩，挥去溶剂得三叶青水提物 (每 1 g 三叶青
水提物相当于 1. 43 g饮片) ，备用。
2. 1. 2 细胞抑制试验供试液制备 取三叶青水提物适量，
加水适量溶解，离心，取上清液浓缩至生药含有量为 1. 0
g /mL的供试溶液，调节其 pH 值为 7. 0 ～ 7. 2，分别用含
10% (体积分数)小牛血清的培养液稀释制成质量浓度为
20、40、60、80、100 g /L的溶液，过滤除菌，备用。
2. 1. 3 小鼠含药血清制备 随机将小鼠分为 5 组，每组 20
只，分别为三叶青水提物高、中、低剂量组［9］ (分别相当
饮片 20、10、5 g /kg) ，阳性对照 (注射用环磷酰胺，0. 1
g /kg)组及阴性对照组。各组均灌胃给药 (阴性对照组给
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予蒸馏水［10］) ，每次 20 mL /kg，连续 3 d，每天 2 次，最后
1次给药前禁食 12 h，灌胃 1 h后断头取血，分离血清，56
℃灭活 30 min后，过滤除菌，冷冻保存备用。
2. 2 细胞培养 Hela 229 和 A375 以含 10% (体积分数)
灭活小牛血清的 RPMI1640 培养液，在 37 ℃，含 5% (体
积分数)的 CO2，饱湿条件下培养。
2. 3 体外抑制试验 (MTT法) 取对数生长期的 Hela 229
和 A375 细胞接种于 96 孔培养板，细胞密度为 2. 5 × 104
个 /L，每孔 200 μL;24 h后，吸除培养板内原培养液，每
孔加入不同质量浓度的三叶青水提物溶液或含药血清各
200 μL，前者以每孔 200 μL含 10%小牛血清的培养液为空
白对照，后者以每孔 200 μL含 10%阴性对照组血清但不含
细胞的培养液为空白对照，以每孔 200 μL 含 10% (体积
分数)含药血清的培养液为阴性对照，每剂量组均设 6 复
孔，37 ℃、5% (体积分数)CO2、饱湿条件下培养 48 h
后，每孔加入 MTT 液 (5 g /L)20 μL，4 h 后，吸除上清
液，加入 150 μL DMSO 终止反应，用酶标仪在 570 nm 波
长处测定吸光度 (A)值。计算抑制率 (%)。
细胞抑制率(%)= (1 － A药物 /A对照)× 100%
2. 4 体内抗肿瘤试验 取腹腔接种 7 ～ 9 d 生长良好的荷
S180小鼠 4 ～ 5 只，断颈处死。无菌抽取 1 ～ 2 mL 腹水，再
用无菌生理盐水按 1 ∶ 3 比例稀释成瘤细胞悬液，并用
0. 4%苔盼蓝染色，计活细胞率 ＞ 90%，调整瘤细胞密度为
1 × 107个 /mL。取 50 只小鼠，每只小鼠右前肢腋下皮下接
种 0. 2 mL。接种次日，按体质量随机分成 5 组，每组 10
只。阴性对照组灌胃给予等体积的蒸馏水;阳性对照组腹
腔注射用环磷酰胺 0. 02 g /(kg·d) ;三叶青水提物高、中、
低剂量组分别灌胃给予相当于饮片 24、12、6 g /(kg·d)的
药物。每日 1 次，连续 10 d。末次给药 24 h后称质量，脱
臼处死动物，剪开肿瘤部位，完整剥离瘤块，用滤纸吸净
其上血和液体，称取瘤块质量，计算抑瘤率。并且分离胸
腺和脾脏，精密称定质量，计算胸腺和脾脏指数。
2. 5 统计方法 所有实验数据均用 x ± s 表示，采用 SPSS
17. 0 统计软件对其进行处理，统计分析方法采用 Dunnett
检验，以 P ＜ 0. 05 为有统计学意义。
3 结果
3. 1 三叶青水提物对 Hela 229 和 A375 细胞的抑制作用
实验结果显示，与阴性对照组比较，一定质量浓度范围的
三叶青水提物和环磷酰胺处理 48 h的 Hela 229 和 A375 细
胞抑制率随质量浓度的增加均有显著地升高 (P ＜ 0. 01)
(见表 1)。Hela 229 和 A375 肿瘤细胞 IC50分别为 45. 60
g /L和 38. 35 g /L。
表 1 三叶青水提物对 Hela229 和 A375 细胞的抑制作用 (x ± s，n =6)
组 别 质量浓度 / (g·L －1)
Hela229 A375
抑制率 /% IC50 / (g· L －1) 抑制率 /% IC50 / (g·L －1)
阴性对照 0 0 0 0 0
三叶青水提物 1 5. 79 ± 5. 50 10. 72 ± 10. 77
20 25. 81 ± 8. 1# 26. 19 ± 11. 00
40 44. 93 ± 8. 60# 45. 60 50. 69 ± 12. 13
#
38. 35
60 56. 31 ± 4. 19# 82. 06 ± 9. 28#
80 95. 43 ± 0. 45# 95. 03 ± 6. 49#
100 97. 31 ± 0. 29# 98. 51 ± 0. 45#
注射用环磷酰胺 0. 1 70. 48 ± 5. 45# － 79. 77 ± 5. 46# －
注:和阴性组比较，#P ＜ 0. 01 (表 2、表 3 同)。
3. 2 三叶青水提物含药血清对 Hela 229 和 A375 细胞的抑
制作用 结果见表 2。与阴性对照组比较，三叶青水提物含
药血清对 Hela 229 和 A375 细胞具有显著地抑制作用 (P ＜
0. 01) ，且呈剂量-效应关系， IC50 分别为 41. 82 g /L 和
248. 60 g /L。Hela 229 细胞对三叶青水提物高、中、低剂量
组含药血清的敏感性与三叶青水提物直接作用于该细胞时
的结果相似，而三叶青水提物含药血清对 A375 细胞抑制作
用不如三叶青水提物。
表 2 含药血清对 Hela 229 和 A375 细胞体外抑制作用的影响(x ± s，n =6)
组 别 剂量 /(g·L －1)
Hela229 A375
抑制率 /% IC50 /(g·L －1) 抑制率 /% IC50 /(g·L －1)
阴性对照组 0 0 0 0
三叶清水提物含药血清低剂量组 5 48. 62 ± 10． 40# 35. 39 ± 8． 03#
三叶清水提物含药血清中剂量组 10 50. 57 ± 12． 59# 41. 82 37. 64 ± 11． 40# 248. 60
三叶清水提物含药血清高剂量组 20 55. 26 ± 7． 49# 40. 34 ± 15． 10#
注射用环磷酰胺组 0. 1 58. 99 ± 12． 01# － 46. 76 ± 9． 07# －
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3. 3 体内肿瘤抑制试验 三叶青水提物高、中、低剂量组
对小鼠 S180肉瘤的抑制作用与阴性对照组比较，高、低剂量
组无明显差异，而中剂量组表现出非常显著的差异 (P ＜
0. 01) ;与阴性对照组比较，各剂量组小鼠脾脏指数和胸指
腺数均呈下降趋势，低剂量组与高剂量组下降较多，其胸
腺指数有显著差异性 (P ＜ 0. 05) ;中剂量组下降较少
(P ＞ 0. 05)。见表 3。
表 3 三叶青水提物对荷 S180小鼠肿瘤生长的抑制作用(x ± s，n =10)
组 别
剂量 /
(g·kg －1)
体质量 /
g
瘤质量 /
g
抑制率 /
%
脾脏指数 /
(mg /10 g)
胸腺指数 /
(mg /10 g)
阴性对照组 0 27. 52 ± 2． 70 1. 6718 ± 0． 64 0 47. 98 ± 12． 24 17. 42 ± 3． 91
三叶青水提物低剂量组 6 26. 26 ± 2． 55 1. 5475 ± 0． 42 6. 00 39. 40 ± 7． 99 9. 16 ± 2． 70#
三叶青水提物中剂量组 12 27. 43 ± 2． 12 0. 9769 ± 0． 29# 41. 56 41. 51 ± 5． 42 15. 89 ± 3． 77
三叶青水提物高剂量组 24 25. 77 ± 3． 28 1. 1997 ± 0． 50 28. 24 37. 16 ± 10． 87 8. 41 ± 6． 12#
注射用环磷酰胺组 0. 02 26. 21 ± 3． 75 0. 6408 ± 0． 27# 61. 67 27. 00 ± 10． 68# 6. 92 ± 2． 02#
4 讨论
有报道称从三叶青中分离得取了 6-O-苯甲酰基胡萝卜
苷、胡萝卜苷、β-谷甾醇［10］、麦角醇、蒲公英萜酮［11］，山
柰酚-3-O-新橙皮糖苷、槲皮素［12］、5，7，4-三羟基黄酮-6-α-
L-吡喃鼠李糖 (1-4)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷，5，7，4-三羟基
黄酮-8-α-L-吡喃鼠李糖 (1-4)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷和
5，7，4-三羟基黄酮-6，8-二-C-β-D-吡喃葡萄糖苷［13］。其中
的 6-O-苯甲酰基胡萝卜苷、三叶青黄酮有抗肿瘤作
用［3，5，10］。前期实验对三叶青脂溶性提取物做了体外肿瘤细
胞抑制试验，发现其有较强的细胞毒作用［7-8］。有人从三叶
青中提取出了多糖成分［14］，本课题组认为三叶青中可能存
在水溶性的多糖成分，因此有必要研究三叶青水提物的抗
肿瘤作用，便于以后全面研究三叶青中的抗肿瘤活性成分。
三叶青水提物是粗制剂，体外试验受其中杂质的影响，可
能会产生假阳性或假阴性的结果。所以本实验同时采用中
药血清药理学的方法及小鼠体内、体外试验。
从本实验结果分析，三叶青水提物对 Hela 229 和 A375
细胞均有较强地体外抑制作用，采用中药血清药理学方法
则发现三叶青含药血清对 Hela 229 仍表现出明显的细胞毒
作用，而对 A375 细胞的抑制作用稍弱，但二者的抑制作用
均呈剂量-效应关系。试验结果还表明，三叶青水提物对小
鼠 S180肉瘤的有一定地抑制作用，且不表现出剂量依赖性。
中剂量组 (12 g /kg)的抗肿瘤作用优于高剂量组 (24
g /kg)与低剂量组 (6 g /kg) ;与阴性对照组比较，其脾脏
指数与胸腺指数均有所下降，提示三叶青水提物可能含有
毒性作用的杂质，或者三叶青水提物本身可能具有毒性。
本实验通过体内外抗肿瘤试验，表明三叶青具有明显
的抗肿瘤活性。结果显示三叶青抗肿瘤的机制并不是通过
提高宿主免疫功能的途径，其作用机理有待于进一步研究。
另外三叶青的抗肿瘤活性成分还未知，作者将继续研究，
为开发利用三叶青提供依据。
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