全 文 ：2 mg /ml，分别下降了 38． 8%，48． 6%和 38． 2%。虽然各生物碱
含量也均有下降，但都没有与甘草配伍煎煮后的效果好。附子与
甘草同时煎煮炮制后，乌头碱含量降低量约为不加甘草时减少量
的两倍。
可见，研究结果很好地解释了周至人食用附子加入甘草的科
学性和很少中毒的原因。尽管如此，但附子始终是大毒之物，为
确保安全起见，食用前应该保证足够的煎煮时间和温度。
参考文献:
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收稿日期:2011-09-01; 修订日期:2011-12-07
基金项目:浙江医药高等专科学校校级科研课题(No． ZPCSR2008005)
作者简介:丁 丽(1979-) ，女(汉族) ，江西南昌人，现任浙江医药高等专
科学校讲师，硕士学位，主要从事中药药效物质基础研究工作．
三叶青脂溶性提取物对 A375 细胞增殖
及黑色素合成的影响
丁 丽，纪其雄
(浙江医药高等专科学校，浙江 宁波 315100)
摘要:目的 探讨三叶青三氯甲烷提取物对人恶性黑色素瘤 A375 细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑色素合成的影响。方法
采用 MTT比色法，测定不同浓度三叶青三氯甲烷提取物对 A375 细胞体外抑制作用;比色法测定酪氨酸酶活性和黑色素
含量;采用光学显微镜法观察其对细胞形态的影响。结果 三叶青三氯甲烷提取物在 6 ～ 500 μg /ml 浓度范围内对 A375
细胞增殖有显著的抑制作用(P ＜ 0． 01) ，且呈时间 －剂量依赖性;浓度小于 50 μg /ml 时，对酪氨酸酶活性和黑色素合成
抑制有增加趋势;在 100 ～ 500μg /ml时，对 A375 肿瘤细胞有较强的抑制作用;光学显微镜下可见典型凋亡细胞形态学改
变。结论 三叶青三氯甲烷提取物对 A375 细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑色素合成具有抑制作用。
关键词:三叶青; A375 细胞; 细胞增殖; 酪氨酸酶; 黑色素合成
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2012． 04． 080
中图分类号:R284． 2 文献标识码:B 文章编号:1008-0805(2012)04-0962-02
三叶青为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤 Tetrastigmatis
hemsleyani Diels et Gilg，具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛的功
效，在浙江地区应用非常广泛，在民间常被用来治疗小儿惊厥高
热、肺炎、支气管炎、咽喉炎、痢疾、肝炎、病毒性脑膜炎、瘰疬、痈
疔疮疖等症［1］。近年来，人们发现三叶青可抑制肿瘤细胞的增
殖和诱导其凋亡［2 ～ 5］。本课题组在前期实验中发现，三叶青的三
氯甲烷提取物对体外培养的人恶性黑色素瘤细胞 A375 表现出
较强的抑制作用。本研究通过观察三叶青脂溶性提取物对人恶
性黑色素瘤 A375 肿瘤细胞的增殖、酪氨酸酶的活性及黑色素合
成的影响，旨在为今后深入研究三叶青的抗肿瘤活性机制提供实
验依据。
1 仪器与试药
1． 1 仪器与试药 酶标仪(Bio － Rad) ;倒置生物显微镜(Motic) ;
CO2 培养箱(力康生物医疗科技控股有限公司) ;人恶性黑色素
瘤细胞株 A375(上海中科院细胞生化所) ;MTT (美国 Amresco
公司) ;RPMI 1640 培养基(美国 Invitrogen公司) ;胎牛血清(上海
蓝季科技发展有限公司) ;胰岛素(上海蓝季科技发展有限公
司) ;5 －氟脲嘧啶注射液(天津金耀氨基酸有限公司) ;Triton X
－ 100(美国 Amresco公司) ;L － DOPA(美国 Sigma公司) ;三叶青
饮片(宁波市鄞州医药药材公司) ，经鉴定为 Tetrastigma hemsley-
anum Diels et． Gilg。
1． 2 药物 三叶青饮片，用 95%乙醇回流提取 3 次，1h /次，60 %
乙醇乙醇回流提取 3 次，1h /次，合并提取液，过滤，减压浓缩得乙
醇浸膏，用少量水将乙醇浸膏分散，用三氯甲烷萃取，回收溶剂
后，得到三氯甲烷萃取物。临用前用 1 ml DMSO 溶解，含 10 %
(体积分数)灭活新生小牛血清 RPMI － 1640 培养液稀释，无菌过
滤备用。
1． 3 细胞株 人恶性黑色素瘤细胞株 A375 购自上海中科院细
胞生化所。
2 方法
2． 1 细胞培养 人恶性黑色素瘤细胞株 A375 用含 10%(体积分
数)灭活新生小牛血清 RPMI － 1640 培养液在 37 ℃、5 % CO2、饱
湿条件下培养。
2． 2 MTT试验 取对数生长期 A375 细胞用 0． 25 %的胰蛋白酶
进行消化后，配成 2 × 104 /L 的细胞悬液接种于 96 孔培养板，每
孔加细胞悬液 150 μl;培养 24 h后，分别加入不同浓度的三叶青
三氯甲烷萃取物溶液 50 μl，终浓度为 6，12． 5，25，50，100，200，
500 μg /ml。空白对照组加 50 μl培养液，阳性对照组分别加入不
同浓度的 5 －氟脲嘧啶溶液 50 μl，分别培养 24，48，72 h后，每孔
加入 5 g /L MTT 20 μl，培养 4h后，弃去上清液，加入 150 μl DM-
SO震荡 10 min，570 nm波长下测定 OD 值，每剂量组设 3 复孔，
重复 3 次。按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率。
肿瘤细胞生长抑制率(%)=(1 －实验组平均 OD值 /对照组
平均 OD值)× 100%
2． 3 酪氨酸酶活性的测定［6 ～ 8］ 待 A375 细胞生长至近融合状
态，按照“2． 2”项，加入不同浓度的萃取物溶液，作用 72 h后弃培
养液，用 pH7． 4 的 PBS洗涤两次，每孔加入 1%(体积分数)Triton
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时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 4 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL． 23 NO． 4
X －100 溶液 90 μl，迅速置 － 80℃冻存 30 min，随后室温融化使
细胞完全裂解，37℃预温后加入 2． 5 mmol /L 多巴溶液 100 μl，
37℃反应 0． 5 h，490 nm 波长处测定吸光度值，每一浓度设 3 个
复孔，重复 3 次，取平均值。酪氨酸酶活性抑制率(%)=(1 －各
浓度平均吸光度值 /对照组平均吸光度值) × 100%。
2． 4 黑色素含量测定［6，7］ 将对数生长期 A375 细胞浓度调整为
2 × 104 /L，接种于 24 孔板，每孔 1． 5 ml，24 h 后加入不同浓度的
各提取物溶液 0． 5 ml，对照组不加。培养 3d 后，用 0． 25 %的胰
蛋白酶进行消化后，将细胞收集入离心管离心 10 min(1 000 r /
min) ，倾去上清液，再用 PBS洗两次后，用 1 mol /L 氢氧化钠溶液
(含 10%DMSO)在 37℃作用 48 h，充分裂解细胞和溶解黑色素
颗粒，每孔加入 100 μl裂解液，470 nm处测定吸光度值。每一质
量浓度设 3 个复孔，重复 3 次，取平均值。
2． 5 统计学方法 本实验数据采用 SPSS13． 0 进行处理，结果均
用 珋x ± s表示，用 t检验分析法对结果进行统计分析，当 P ＜ 0． 05
时，认为两组间有显著性差异。
3 结果
3． 1 三叶青三氯甲烷提取物对 A375 细胞增殖的影响 不同浓
度的三叶青三氯甲烷提取物作用 A375 细胞 24 ～ 72 h 后，对
A375细胞增殖的抑制结果见表 1。与空白对照组比较，浓度为 6
～ 500μg /ml三叶青三氯甲烷提取物能有效抑制 A375 肿瘤细胞
的增殖(P ＜ 0． 01) ，并且随着药物浓度的增加及作用时间的延
长，对细胞增殖的抑制率增加，呈现出时间 －剂量依赖性。
3． 2 酪氨酸酶活性的测定 由表 2 可见，三氯甲烷提取物在 50
～ 500 μg /ml浓度范围对 A375 细胞中酪氨酸酶活性有抑制作
用，且呈浓度依赖性，而在小于 25 μg /ml药物组则对活性抑制作
用减弱，甚至增加其活性。
表 1 三叶青三氯甲烷提取物对 A375 细胞增殖的影响(珋x ± s)
组别
浓度
C /μg·ml － 1
抑制率(%)
24 h 48 h 72 h
空白对照 0 0 0 0
三氯甲烷提取物 6 15． 13 ± 4． 03＊＊ 21． 52 ± 2． 07＊＊ 29． 22 ± 1． 32＊＊
12． 5 22． 43 ± 4． 06＊＊ 30． 21 ± 6． 44＊＊ 33． 23 ± 2． 40＊＊
25 28． 96 ± 4． 77＊＊ 35． 83 ± 3． 00＊＊ 37． 89 ± 2． 77＊＊
50 33． 66 ± 3． 47＊＊ 39． 14 ± 6． 42＊＊ 41． 70 ± 3． 51＊＊
100 40． 49 ± 4． 50＊＊ 43． 76 ± 3． 69＊＊ 46． 06 ± 2． 99＊＊
200 44． 06 ± 3． 05＊＊ 46． 78 ± 2． 32＊＊ 51． 88 ± 3． 17＊＊
500 49． 88 ± 4． 58＊＊ 51． 02 ± 4． 03＊＊ 61． 27 ± 7． 84＊＊
5 －氟脲嘧啶 6 17． 12 ± 7． 88＊＊ 47． 55 ± 4． 83＊＊ 69． 25 ± 5． 58＊＊
12． 5 21． 32 ± 6． 69＊＊ 58． 61 ± 2． 87＊＊ 77． 18 ± 3． 21＊＊
25 30． 53 ± 6． 14＊＊ 62． 43 ± 3． 46＊＊ 82． 86 ± 4． 15＊＊
50 38． 67 ± 4． 35＊＊ 67． 59 ± 4． 54＊＊ 87． 31 ± 2． 17＊＊
100 44． 20 ± 4． 50＊＊ 75． 56 ± 3． 17＊＊ 91． 68 ± 1． 42＊＊
200 48． 01 ± 2． 99＊＊ 84． 11 ± 4． 24＊＊ 97． 78 ± 1． 30＊＊
500 53． 35 ± 2． 35＊＊ 95． 46 ± 3． 20＊＊ 99． 85 ± 0． 26＊＊
与空白组比较，＊＊P ＜0． 01
3． 3 黑色素含量测定 当药物质量浓度大于 100 μg /ml时，A375
细胞中黑色素的含量呈下降趋势，而在 6 ～ 50 μg /ml 浓度范围
内，黑色素含量反而增加，说明三叶青在高浓度时对 A375 肿瘤
细胞有显著的体外抑制作用。
3． 4 细胞形态观察 不同浓度的三叶青三氯甲烷提取物作用
A375 细胞 72 h 后，倒置光学显微镜观察可见，阴性对照组 A375
细胞饱满透亮，轮廓清晰，胞核、胞仁较大。而三叶青三氯甲烷提
取物处理组与阴性对照组相比，细胞数量减少，部分细胞体积变
小，变圆并浮起。随着药物浓度增加，细胞数量明显变少，更多细
胞变成圆形，细胞表面突起多个小球状凋亡小体。
表 2 三叶青三氯甲烷提取物
对 A375 细胞酪氨酸酶活性和黑色素合成的影响(珋x ± s)
药物质量浓度 C /μg·ml －1 酪氨酸酶活性 黑色素含量(OD)
0 0． 052 ± 0． 014 0． 075 ± 0． 002
6 0． 060 ± 0． 003* 0． 091 ± 0． 006＊＊
12． 5 0． 056 ± 0． 004 0． 081 ± 0． 004＊＊
25 0． 051 ± 0． 007 0． 077 ± 0． 003＊＊
50 0． 048 ± 0． 009 0． 075 ± 0． 005
100 0． 043 ± 0． 008＊＊ 0． 072 ± 0． 003
200 0． 039 ± 0． 005＊＊ 0． 068 ± 0． 002＊＊
500 0． 032 ± 0． 004＊＊ 0． 065 ± 0． 005＊＊
与空白组比较，＊＊P ＜ 0． 01;与空白组比较，* P ＜ 0． 05
图 1 三氯甲烷提取物对黑色素瘤 A375 细胞形态学的影响
4 讨论
本研究通过 MTT比色法观察发现，三叶青三氯甲烷提取物
在一定浓度下可显著抑制人恶性黑色素瘤 A375 细胞的增殖，并
且其抑制作用表现出时间 － 剂量依赖性。在高浓度(50 ～
500μg /ml)下，三叶青提取物对 A375 细胞表现出较强的毒作用，
从而抑制了酪氨酸酶的分泌和黑色素的合成。光镜检测也同样
观察到了经三叶青三氯甲烷提取物处理后的 A375 细胞数量减
少、细胞变圆、外形皱折、凋亡小体等现象的出现。但三叶青三氯
甲烷提取物抗肿瘤作用的物质基础尚不明确，课题组将继续研
究，追踪三叶青的抗肿瘤活性成分。
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL ． 23 NO． 4 时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 4 期