全 文 ：49上海医药 2012年 第33卷 第13期 （7月上）
药 物 研 发
注射剂产品可见异物可控化管理的方法还有待于进
一步完善 [9]，企业下一步重点是如何落实可见异物控制
在万分之五以内这一挑战性目标，并形成可复制的标准
化操作方法。这需要企业在重点环节、共性研究、长效
机制上作进一步探索。
参考文献
[1] 国家药典委员会 . 中华人民共和国药典 2010 年二部 [M].
北京 ： 中国医药科技出版社 , 2010 ：附录 IX H 76-78.
[2] 张长海 . 小容量注射液可见异物影响因素分析 [J]. 首都医
药 2010, 17（12）：72.
[3] 刘树华 , 鲁建夏 , 王家尧．精益生产 [M]. 北京 : 机械工业
出版社 , 2009: 14-18.
[4] 中华人民共和国卫生部 . 药品生产质量管理规范（2010
年 修 订 ）[EB/OL]. (2011-1-17)[2012-4-1].http://www.sda.
gov.cn/WS01/CL0053/58500.html.
[5] 罗龙昌 , 胡军 , 邓伟根 . 质量管理学 [M]. 广州 : 暨南大学
出版社 , 2003: 130-132.
[6] 李钧 , 李志宁 . 制药质量体系及 GMP 的实施 [M]. 北京 :
化学工业出版社 , 2012: 48-51.
[7] 李晓瑞 , 刘少琴 , 马振嗣 , 等 . 小容量注射剂可见异物影响
因素分析和处理措施 [J]. 亚太传统医药 , 2011, 7(9): 203-204.
[8] 余小亮 . 质量风险管理技术在小容量注射剂可见异物检查
中的应用 [J]. 机电信息 , 2011, 299(17): 30-33.
[9] 沈红宾 . 小容量注射剂可见异物来源及控制方法 [J]. 北方
药学 , 2011, 8(7): 76-77.
（收稿日期 ：2012-03-28）
楸树内生真菌抗癌性能研究
于湘莉 赵静雅 张利达 苗志奇 *
（上海交通大学农业与生物学院 上海 200240）
摘 要 在新抗癌药物筛选过程中获得一种具有明显抗癌能力的楸树内生真菌，命名为 FSN002。采用形态学和分
子生物学方法判断该内生真菌为短枝木霉。FSN002 发酵产物能够有效抑制肝癌、肺癌等多种癌症细胞，同时对正常肝
细胞几乎没有明显的细胞毒性。FSN002 发酵产物的有效抗癌成分为一种次生代谢物小分子楸灵素，有望开发成一种拥
有自主知识产权的高效低毒抗癌药物。
关键词 内生真菌 抗癌药物 次生代谢物
中图分类号 ：R965.1; R914 文献标识码 ：A 文章编号 ：1006-1533(2012)13-0049-04
Study on the anti-cancer acitivity of endophytic fungi
isolated from Juglans mandshurica Maxim
YU Xiang-li, ZHAO Jing-ya, ZHANG Li-da, MIAO Zhi-qi*
(The School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)
ABSTRACT An entophytic fungus named FSN002 was isolated from the inner bark of Juglans mandshurica Maxim.
Based on the morphology identification and internal transcribed spacer (ITS) sequence, it is clear that this fungus belongs to the
Deuteromycotina, Hyphomycetes, Moniliales, Trichoderma longibrachiatum. The fermentation broth of FSN002 shows high
anti-tumor activity against liver cancer, lung cancer, while the inhibiting effect against hepatic cell (strain HL-7702) is only one
quarter of that against hepatocellular carcinoma cell (HepG2) at its IC50 concentration. Therefore, the fermentation of FSN002
provides a possible way to produce anticancer drug with higher efficiency and lower toxicity.
KEy wORDS entophytic fungi; anti-cancer drug; secondary metabolite
* 通讯作者 ：苗志奇。E-mail: zqmiao@sjtu.edu.cn
据世界卫生组织统计，2007-2010 年全球每年新确 诊的癌症病人多达 1 200 万人，每年死于癌症的病人高
50 上海医药 2012年 第33卷 第13期 （7月上）
药 物 研 发
达 700 万人以上。癌症已取代心血管病成为全球死亡人
数最多的疾病。2009 年，全球抗癌药物的总销售额接近
1 000 亿美元，年增长率为 15%。但重要抗癌药物的知
识产权都掌握在欧美医药巨头手中，价格昂贵。因此，
利用我国丰富的天然植物资源开发具有自主知识产权的
天然抗癌药物不仅具有重要的社会价值和临床意义，也
具有潜在的、巨大的经济价值。本项目的研究目的在于
筛选具有自主知识产权的新抗癌药。
肝癌的全球发病率在癌症中排名第三，仅次于肺癌
和乳腺癌，每年因肝癌死亡者数超过 60 万人。我国和日
本等东南亚地区是世界上肝癌发病率最高的地区，每年
死于肝癌的病人数占全球肝癌总死亡人数的 55% 以上。
目前临床上多用紫杉醇治疗乳腺癌和肺癌、用顺铂或阿
霉素治疗肝癌，但顺铂和阿霉素具有很强的细胞毒性，
而紫杉醇则受制于药源植物红豆杉资源稀少、产量有限
而价格昂贵。因此，上海交通大学植物生物技术中心将
新药筛选目标定在新型抗肝癌天然药物上，通过大规模
筛选、分离获得多株具有明显抗癌活性的内生真菌 [1-4]。
其中一种楸树内生真菌编号为 FSN002，其发酵产物的
抗癌活性优于紫杉醇，可望开发成一种具有完全自主知
识产权、价格适中、可口服给药的高效低毒抗癌一类新药。
1 楸树内生真菌的分离
考虑到植物内生真菌往往具有和其宿主植物相似的
次生代谢合成能力，故从抗癌药用植物内部分离内生真
菌、再利用发酵法生产抗癌药物成为抗癌药物生产的途
径之一。相对于药用植物，其内生真菌培养更容易、发
酵周期也短，更便于人工调控和放大，是研究的热点领
域之一。
上海交通大学植物生物技术中心以楸树、红豆杉等
抗癌药用植物为对象，分离其内生真菌，获得了 30 多株
内生真菌。经色谱、质谱检测发现一些红豆杉内生真菌
具有微弱的紫杉醇合成能力，发酵液中紫杉醇含量为 10
～ 100 μg/L，但因浓度过低，不具有明显的癌细胞抑制
活性。而其中一株编号为 FSN002 的楸树内生真菌的发
酵液却对肝癌细胞表现出非常强的抑制作用。
将真菌 FSN002 接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）
培养基平板上，室温下其生长迅速并形成白色绒状辐射
状菌落。PDA 平板上生长的真菌能够合成并分泌黄色色
素类物质，使培养基呈现出均匀的淡黄色。该真菌在液
体完全培养基（CM）摇瓶培养时会形成均匀的圆形菌球，
菌球表面粗糙并有针状突起、质地疏松，液体培养过程
中也会产生大量黄色色素，使菌球和培养基呈现为黄色。
2 楸树内生真菌的鉴定
真菌 FSN002 的菌丝细长，有分支，透明、有隔，
细胞壁光滑。分生孢子梗由菌丝直立生出，无色、多对，
分枝与分生孢子梗呈近似直角，末端为小梗。小梗为瓶形，
分生孢子呈球形或长椭圆形，表面粗糙，分生孢子为绿色，
具有典型的木霉形态特征。
提取该真菌基因组 DNA，采用通用引物 ITS1（5-
TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4（5-TCCTCCG-
CTTATTGATATGC-3′）对真菌 18S rDNA ITS 区域进行扩
增。将测序获得的 ITS 序列与 GenBank 核酸数据库序列
进行 blast 等生物信息学分析，结合形态学鉴定 FSN002
为半知菌亚门丝孢纲丛梗孢目木霉属长枝木霉，是一个
全新菌种，与东方肉唑菌和长梗木霉的亲缘关系最密切，
种质资源库保存编号为 CCTCC M 208102。
3 楸树内生真菌发酵液抗肝癌作用
楸树内生真菌发酵液为真菌 FSN002 在 PDF 液体培
养基中发酵 1 周后用 0.22 μm 微滤获得的无菌发酵液。
发酵培养条件为 25 ℃，摇床 120 rpm，避光培养。
3.1 FSN002 发酵液在细胞水平上的抗肝癌作用
将真菌 FSN002 发酵液的稀释样品加至肝癌细胞培
养体系中，8 h 后观察到明显的肝癌细胞受抑现象，且此
现象随培养时间的延长而越来越明显。
细胞试验显示，FSN002 发酵液在稀释 40 倍后仍能
有效抑制肝癌细胞的生长，而在稀释 20 倍时对肝癌细
胞的杀灭率达 97% 以上（图 4-A 为不加 FSN002 发酵液
的肝癌细胞培养结果 ：细胞生长旺盛，形成覆盖整个培
养皿表面的致密细胞层 ；图 4-B 为加入稀释 20 倍后的
FSN002 发酵液的肝癌细胞培养结果 ：肝癌细胞数量明
显下降，细胞形态从正常的不规则形状转化为圆型且见
细胞核固缩、核 DNA 降解，呈现出 DNA LADDER 的
典型细胞凋亡特征）。细胞活力染色检测（MTT）发现，
以圆型形态存活的癌细胞活力显著下降、细胞分裂停止。

培养皿反面 培养皿正面

FSN002 菌丝显微照片 FSN002 液体发酵
图 1 真菌 FSN002 的菌落、菌丝和液体发酵物
51上海医药 2012年 第33卷 第13期 （7月上）
药 物 研 发
FSN002 发酵液对肝癌细胞的体外抑制能力与 1 g/L 紫杉
醇溶液相同。
3.2 FSN002 发酵液在细胞水平上的毒、副作用
对正常肝细胞 HL-7702 进行的培养试验表明，加入
稀释 5 倍的 FSN002 发酵液在短期（8 h）内未表现出明
显的细胞毒性，而这一浓度比有效抑制肝癌细胞的浓度
高 5 倍以上，说明 FSN002 发酵液的短期细胞毒性很小。
稀释 10 倍的 FSN002 发酵液在长期（2 d 以上）时具有
轻微的细胞毒性，只有当真菌发酵液在整个肝细胞培养
体系中的体积比达到 50% 后才能达到肝细胞的半数抑
制，说明 FSN002 发酵液对正常肝细胞的 IC50 比对肝癌
细胞的 IC50 高 10 倍以上。在给予能有效抑制肝癌细胞
的稀释 20 倍的 FSN002 发酵液浓度下，FSN002 发酵液
对正常细胞基本没有明显的细胞毒性。
3.3 FSN002 发酵液口服对肝癌模型小鼠肿瘤生长的
抑制作用
利用腹腔接种肝癌细胞的方法制备肝癌模型小鼠，
然后通过灌胃方法给药，以水替代 FSN002 发酵液作为
阴性对照、以 13 mg/(kg·d) 紫杉醇注射作为阳性对照，
考察口服 1 ml/d FSN002 发酵液对肿瘤团块大小的影响。
给药 1 个月后的分析发现，FSN002 发酵液灌胃组
和紫杉醇注射组小鼠的体内肿瘤团块大小相似、仅相当
于阴性对照组的 60%，抑制率达到 40%，抑制效果明显。
试验结果还显示，FSN002 发酵液在口服给药模式下可以
达到与紫杉醇注射相似的肝癌治疗效果，证明 FSN002
发酵液中的抗癌活性成分可被肠胃有效吸收。试验同时
发现，FSN002 发酵液灌胃组小鼠的肝癌肿块颜色变浅、
血管密度降低，提示 FSN002 发酵液能抑制肿瘤血管形
成，这可能是其抗癌机制之一。

A B
图 4 加入稀释 20 倍后的 FSN002 发酵液
的肝癌细胞培养显微照片（右图，左图为
对照用的加入水的肝癌细胞培养显微照片）
图 5 不同稀释度的 FSN002 发酵液
对肝癌细胞和正常肝细胞的抑制效果
TGTCTCCTCAGCATGCGCTCCCTACCCCATGTG
AACGTTACCAATCTGTTGCCTCGGCGGGATTCT
CTTGCCCCGGGCGCGTCGCAGCCCCGGATCCC
ATGGCGCCCGCCGGAGGACCAACTCCAAACTC
TTTTTTCTCTCCGTCGCGGCTCCCGTCGCGGCT
CTGTTTTATTTTTGCTCTGAGCCTTTCTCGGCGA
CCCTAGCGGGCGTCTCGAAAATGAATCAAAAC
TTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGA
TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGT
GAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTT
GAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCG
GGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCG
AACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGG
CCCCTCACCGGGCCGCCCCCGAAATACAGTGG
CGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCATAGTTT
GCACACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGGCCA
CAGCCGTAAAACACCCCAAACTTCTGAAATGT
TGACCTCGGATCAAGTAGGAATACCCGCTGAA
CTTATCATATCAATAAGCGGAGGAATTA
图 2 真菌 FSN002 的 18S rDNA ITS 序列
图 3 真菌 FSN002 18S rDNA ITS 序列进化树分析
52 上海医药 2012年 第33卷 第13期 （7月上）
Time
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00
A
u
0.0
1.0e-2
2.0e-2
3.0e-2
4.0e-2
5.0e-2
6.0e-2
9.90
435.0000
0.76
435.0000
10.09
435.0000
15.15
435.0000
Time /Min
图 7 FSN002 发酵液的 HPLC 色谱图（其中楸灵素滞留时间为 9.9 min，10.1 min 色谱峰为类似物杂质）
3.4 FSN002 发酵液具有广谱抗癌作用
除肝癌外，FSN002 发酵液对脑癌、肺癌等也显示
有抑制效果 ：加入 FSN002 发酵液，培养基中的脑癌细
胞从长条形迅速转为圆形并失去快速生长分裂能力、细
胞活力显著下降，出现核固缩和 DNA LADDER 等典型
的细胞凋亡现象 ；加入 FSN002 发酵液，培养基中的肺
癌细胞密度明显下降、细胞分裂受到明显抑制，并同样
观察到核固缩和 DNA LADDER 等典型的细胞凋亡现象。
4 楸树内生真菌发酵液的抗肝癌活性成分分离与
鉴定
FSN002 发酵液中的活性抗癌成分为黄色晶体，命
名为楸灵素，分子量为 498，其分子结构中有 1 个亲水
端和 1 个疏水端，具有一定的表面活性剂性质，水溶性好；
还含有羧基，呈弱酸性，在中性或弱碱性条件下稳定。
采用冻融法对 FSN002 发酵液进行浓缩，然后通过
疏水层析和分子筛过滤并结合重结晶技术可分离获得楸
灵素纯品。
5 结语
楸树内生真菌 FSN002 的发酵液具有显著的抗癌活
性，对肝癌、肺癌等多种癌细胞具有强力的生长抑制作用，
能有效诱导癌细胞凋亡。FSN002 发酵液的有效成分为
小分子次生代谢物楸灵素，其抗肝癌作用与紫杉醇相当，
可望开发成一种拥有自主知识产权的、可口服给药的高
效低毒抗肝癌新药。
药 物 研 发
图 6 FSN002 发酵液对肺癌细胞 SGC 的抑制效果
（左为用水的阴性对照）显微照片
参考文献
[1] Miao ZQ, Wang YC, Yu XL, et al. A new endophytic taxane
production fungus from Taxus Chinensis [J]. Appl Biochem
Micro, 2009, 45(1): 81-86.
[2] Walker KD, Klettke K, Akiyama T, et al . Cloning,
heterologous expression, and characterization of a
phenylalanine aminomutase involved in taxol biosynthesis [J].
J Biol Chem, 2004, 279(52): 53947-53954.
[3] 苗志奇 , 李美芽 , 唐克轩 . 抑制肝癌细胞生长的发酵液的
制备方法 : 中国 , 200810041214.8 [P]. 2010-09-29.
[4] 李美芽 , 吴运帷 , 蒋福升 , 等 . 一株具有抗 HepG2 活性的
胡桃楸内生真菌的分离及研究 [J]. 中国中药杂志 , 2009,
34(13): 1623-1627.
（收稿日期 ：2012-03-16）
热烈祝贺《上海医药》第十届编委会成立
（编委名单详见本刊2012年（5）期附页Ⅱ）