全 文 ：收稿日期：２０１３－１１－１２；修回日期：２０１３－１２－１２
基金项目：周口师范学院２０１３年实验室开放项目（Ｎｏ．Ｋ２０１３３９）
作者简介：赵亚萍（１９９１－），女，河南周口人，周口师范学院生命科学与农学学院生物科学专业学生．
＊通信作者：赵锦慧（１９７９－），女，河南周口人，讲师，硕士，主要从事生物技术研究工作．
第３１卷 第２期 周口师范学院学报 ２０１４年３月
Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．２ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｈｏｕｋｏｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍａｒ．２０１４
三叉苦等５味中草药活性成分提取与抑菌性能研究
赵亚萍，赵锦慧＊，古红梅，张永亮
（周口师范学院 生命科学与农学学院，河南 周口４６６００１）
摘 要：采用煎煮法，对三叉苦等５味中草药组配的９个复方制剂进行活性成分提取，并通过测定抑菌率、抑
菌圈大小、最小抑菌浓度和最小杀菌浓度等指标，研究其对大肠杆菌的体外抑菌效果．结果显示：各复方制剂
的抑菌效果有明显差异，同一复方制剂的抑菌效果随浓度增加而增强，抑菌效果与复方制剂中所含的中草药
种类多少并非呈正相关，而是由中草药种类及各种中草药之间的用量配比决定的．筛选出的对大肠杆菌抑制
效果较好的复方制剂为三叉苦２０ｇ，白英２０ｇ，刺五加２０ｇ，半枝莲２０ｇ和三叉苦１５ｇ，白英２０ｇ，刺五加１０
ｇ，龙葵２０ｇ，半枝莲１０ｇ．
关键词：中草药；复方制剂；活性成分；抑菌性能；大肠杆菌
中图分类号：Ｒ２８５．５ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７１－９４７６（２０１４）０２－０１１９－０４
近年来，随着饲料工业的飞速发展，虽然很多
人工合成的饲料添加剂如抗生素、调味剂、激素、防
腐剂、促长素等在饲料中普遍添加，对畜牧业的发
展起到了很大的促进作用，但其导致的负面效果如
药物残留、抗药性及对人体等的毒副作用已经引起
了国内外广大消费者和科研工作者的关注和忧虑．
在目前的情况下，纯天然的中草药饲料添加剂以其
具有安全特点、能预防动物疾病、改善畜禽产品质
量、提高畜禽产品产量而日益受到广泛关注，从而
促进了中草药饲料添加剂的应用和发展．关于三叉
苦、白英、刺五加、龙葵、半枝莲等几味中草药，其单
方抑菌作用研究有报道［１－１０］，但有关这几味中草
药的复方制剂抑菌性能研究鲜有报道．笔者通过测
定抑菌率、最小抑菌浓度（ＭＩＣ）、最小杀菌浓度
（ＭＢＣ）、抑菌圈大小等指标，对三叉苦等５味中草
药组配的９个复方制剂的抑菌性能进行研究，旨在
为开发和利用中草药饲料抗菌添加剂提供理论依
据．
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 中药材
三叉苦、白英、刺五加、龙葵、半枝莲，购于周口
市同和堂大药店．
１．１．２ 供试菌种
大肠杆菌，由周口师范学院生命科学与农学学
院提供．
１．１．３ 培养基
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（营养琼脂培养基）、
营养肉汤培养基．
１．１．４ 实验器具
实验仪器：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、数显电
热培养箱、恒温振荡培养箱、干燥箱、超净工作台
等．
低值易耗品：试管、培养皿、接种环、烧杯、量
筒、滤纸、酒精灯、万用电炉、毫米刻度尺、砂锅、脱
脂棉等．
１．２ 方法
１．２．１ 三叉苦等５味中草药复方制剂活性成分的
提取
方１：称取三叉苦２０ｇ，白英２０ｇ，刺五加２０
ｇ；方２：称取三叉苦２０ｇ，白英２０ｇ，龙葵２０ｇ；方
３：三叉苦２０ｇ，白英２０ｇ，半枝莲２０ｇ．３个配方中
分别加入４００ｍＬ的蒸馏水，文火加热煮沸１ｈ，用
纱布过滤后得提取液，滤渣用４倍水量煎煮２次后
弃去，将３次所得滤液混合并浓缩到６０ｍＬ，使提
取液原液浓度达到１ｇ／ｍＬ．方４：称取三叉苦２０
ｇ，白英２０ｇ，刺五加２０ｇ，龙葵２０ｇ；方５：称取三
叉苦２０ｇ，白英２０ｇ，刺五加２０ｇ，半枝莲２０ｇ；方
６：称取三叉苦２０ｇ，白英２０ｇ，半枝莲２０ｇ，龙葵
２０ｇ．同法制备，使提取液原液浓度达到１ｇ／ｍＬ．
方７：称取三叉苦１５ｇ，白英１５ｇ，刺五加１５ｇ，龙
葵１５ｇ，半枝莲１５ｇ；方８：称取三叉苦２０ｇ，白英
１０ｇ，刺五加１０ｇ，龙葵１５ｇ，半枝莲２０ｇ；方９：称
取三叉苦１５ｇ，白英２０ｇ，刺五加１０ｇ，龙葵２０ｇ，
半枝莲１０ｇ．同法制备，使提取液原液浓度达到１
ｇ／ｍＬ．
将上述各个配方所得提取液在１２１．３℃下高
压蒸汽灭菌２０ｍｉｎ后，４℃保存备用．
１．２．２ 普通培养基及药液培养基的制备
普通培养基的制备［１１］：制备牛肉膏蛋白胨琼
脂培养基和营养肉汤培养基．
药液培养基的制备［１２］：将灭菌的提取液原液
用营养肉汤培养基进行倍比稀释，分别得到含提取
液为０．５ｇ／ｍＬ，０．２５ｇ／ｍＬ，０．１２５ｇ／ｍＬ的药液
培养基．
１．２．３ 菌种活化、菌悬液的制备及筛选［１３，１４］
用无菌接种环分别从试管斜面上挑取大肠杆
菌少许接种于斜面上，３７℃活化培养２４ｈ．分别挑
取活化后的大肠杆菌单个菌落放入无菌生理盐水
中制备成菌液，采用菌悬液ＯＤ值测定及平板菌落
计数法调节菌液稀释度，使菌体密度为１０２ ｃｆｕ／
ｍＬ．
１．２．４ 抑菌率的测定
采用平板菌落计数法［１４］统计９个复方中草药
提取液不同浓度下的抑菌率，设对照，每个浓度设
３个重复，抑菌率取３个重复的平均值．
抑菌率（％）＝
对照菌落数－处理菌落数
对照菌落数 ×１００．
１．２．５ 最小抑菌浓度（ＭＩＣ）的测定［１５，１６］
在装有１ｍＬ药液培养基的各试管中加入０．１
ｍＬ的菌悬液（菌悬液的菌体密度为１０２ ｃｆｕ／ｍＬ），
３７℃恒温条件下振荡培养，２４ｈ后观察结果．以试
管中无浑浊现象出现的最低药液浓度作为 ＭＩＣ，
每个浓度下均设置３个重复，实验设置对照管．
１．２．６ 最小杀菌浓度（ＭＢＣ）的测定［１７］
以 ＭＩＣ测定结果为基础，从未见细菌生长的
各管培养物中吸取０．１ｍＬ涂布平板，３７℃条件
下培养２４ｈ，观察结果，菌落数少于５个的最小稀
释度即是最小杀菌浓度．
１．２．７ 抑菌圈大小测定
采用药敏纸片法［１８，１９］测定各个复方中草药提
取液的抑菌圈直径．将滤纸用打孔器制成６ｍｍ的
小圆纸片，高压灭菌后放入１ｇ／ｍＬ的各个复方中
草药提取液中，浸泡１～２ｈ，制成药敏纸片，干燥
后备用，对照用无菌水浸泡．吸取０．１ｍＬ的菌悬
液于平板中央，用玻璃涂棒将菌液均匀涂布于平板
上．含菌平板倒置干燥约３０ｍｉｎ后，用无菌镊子取
药敏纸片均匀贴在平板上，每个平板贴３个药敏纸
片，每个处理做３个平板．２０ｍｉｎ后，将平板放入
３７℃恒温培养箱中倒置培养１８～２４ｈ．用毫米刻
度尺测量抑菌圈直径，以３个平板的平均值表示抑
菌圈直径．
药敏纸片法可参考以下标准记录结果：抑菌圈
为１６～２０ｍｍ，表示高度敏感；１１～１６ｍｍ，表示中
度敏感；１０～１１ｍｍ表示轻度敏感；小于１０ｍｍ，
表示不敏感．
２ 结果与分析
２．１ ５味中草药组配的９个复方制剂对大肠杆菌
的抑菌率
９个复方制剂在不同浓度下对大肠杆菌的抑
菌率统计结果见表１．由表１可知：各个浓度下，９
个复方制剂对大肠杆菌均有不同程度的抑制作用，
且抑菌效果随着复方制剂浓度的增大而增强．当浓
度为０．５ｇ／ｍＬ时，９个复方制剂对大肠杆菌的体
外抑菌作用强度为方９＞方５＞方３＞方７＞方６＞
方８＞方１＞方４＞方２；当浓度为０．２５ｇ／ｍＬ和
０．１２５ｇ／ｍＬ时，９个复方制剂的抑菌作用强度均
为方５＞方９＞方３＞方７＞方６＞方８＞方４＞方
１＞方２．此结果显示，复方制剂的抑菌效果强弱和
其包含的中草药种类多少并非呈正相关，并不是配
伍的中草药种类越多，抑菌效果就越强．此外，方
１、方２、方３均包含３味药材，其中２味相同，１味
不同；方４、方５均包含４味药材，其中３味相同，１
味不同；方４、方６均包含４味药材，其中３味相
同，１味不同；方５、方６均包含４味药材，其中３味
相同，１味不同．其抑菌率显示明显的差异，这表明
复方制剂的抑菌效果和配伍的中草药种类有密切
关系．最后，方７、方８、方９均由相同的５味中草药
配伍而成，仅各中草药的用量有差异，但其抑菌率
也差异明显，这说明复方制剂的抑菌效果和各中草
药之间的用量配比关系密切．
０２１ 周口师范学院学报 ２０１４年３月
２．２ ５味中草药组配的９个复方制剂对大肠杆菌
的抑菌圈大小
９个复方制剂在１ｇ／ｍＬ浓度下对大肠杆菌的
抑菌圈大小统计结果见表２．由表２可知：９个复方
制剂对大肠杆菌的抑菌圈大小存在差异，大肠杆菌
对方９表现出高度敏感，对方３、方５、方６、方７表
现出中度敏感，对方１、方４、方８表现出轻度敏感，
对方２表现出不敏感．从抑菌圈大小测定结果看，９
个复方制剂在１ｇ／ｍＬ浓度下的抑菌强度为方９＞
方５＞方３＞方６＞方７＞方８＞方４＞方１＞方２．
这与上述抑菌率统计结果不一致，说明复方制剂的
浓度对抑菌效果影响明显，每个复方制剂都有一个
抑菌杀菌效果较好的合适浓度．
表１ ９个复方制剂在不同浓度下对大肠杆菌的抑菌率统计结果
复方制剂浓
度／（ｇ／ｍＬ）
抑菌率／％
方１ 方２ 方３ 方４ 方５ 方６ 方７ 方８ 方９
０．５ ４６．３ ３７．５ ７１８ ４４．７ ８３１ ５６．５ ５８．７ ５５．２ ８５．８
０．２５ ３０．１ ２５．４ ５４６ ３０．９ ７６．４ ４０．２ ４２．５ ３４．８ ７４７
０．１２５ １４．７ ９．２ ３８．５ １６．１ ４８８ ２１．７ ２２．９ １９．７ ４７．９
表２ ９个复方制剂对大肠杆菌的抑菌圈大小统计结果
复方制剂 方１ 方２ 方３ 方４ 方５ 方６ 方７ 方８ 方９
抑菌圈直径／ｍｍ １０．１ ８．４ １２．７ １０．３ １５８ １２．５ １１．６ １０．８ １６．４
抑菌效果 ＋ － ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋＋
注：“－”表示不敏感，“＋”表示轻度敏感，“＋＋”表示中度敏感，“＋＋＋”表示高度敏感．
２．３ ９个复方制剂对大肠杆菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度
不同浓度的复方制剂下大肠杆菌的生长情况
见表３，９个复方制剂对大肠杆菌的最小抑菌浓度
与最小杀菌浓度统计结果见表４．由表３可知，方
５、方９在０．５ｇ／ｍＬ和０．２５ｇ／ｍＬ的浓度下，试管
内均无浑浊现象；方３、方６、方７、方８在０．５ｇ／ｍＬ
的浓度下，试管内无浑浊现象，其余各管中均有不
同程度的浑浊现象．从表４可以看出，方５的 ＭＩＣ
和 ＭＢＣ均为０．２５ｇ／ｍＬ；方９的 ＭＩＣ为０．２５ｇ／
ｍＬ，ＭＢＣ为０．５ｇ／ｍＬ；方３、方６、方７、方８的
ＭＩＣ均为０．５ｇ／ｍＬ，但其 ＭＢＣ未确定；其余各方
的 ＭＩＣ和 ＭＢＣ均未确定．
表３ 不同浓度的复方制剂下大肠杆菌的生长情况
复方制剂浓
度／（ｇ／ｍＬ）
抑菌率／％
方１ 方２ 方３ 方４ 方５ 方６ 方７ 方８ 方９
０．５ ＋ ＋＋ － ＋ － － － － －
０．２５ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋ － ＋ ＋ ＋ －
０．１２５ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋ ＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋ ＋
注：“－”表示无菌生长；“＋”表示少数菌落生长；“＋＋”表示稍多菌落生长；“＋＋＋”表示菌落生长良好．
表４ ９个复方制剂对大肠杆菌的最小抑菌浓度与最小杀菌浓度
复方制剂 方１ 方２ 方３ 方４ 方５ 方６ 方７ 方８ 方９
ＭＩＣ／（ｇ／ｍＬ） － － ０．５ － ０．２５ ０．５ ０．５ ０．５ ０．２５
ＭＢＣ／（ｇ／ｍＬ） － － － － ０．２５ － － － ０．５
注：“－”表示未测出，ＭＩＣ及 ＭＢＣ均高于０．５ｇ／ｍＬ．
３ 讨论
实验结果显示，不同中草药组配的复方制剂对
大肠杆菌的抑菌、杀菌效果不同，同一种复方制剂
不同浓度下，大肠杆菌对其敏感性不同．抑菌效果
强弱并非由复方制剂中所含的中草药种类多少决
定，而是由复方制剂中所含的中草药种类及各种中
草药之间的用量配比所决定．
研究发现在抑菌率、抑菌圈大小等指标统计
上，不同浓度下９个复方制剂的抑菌效果强弱排序
并不一致，可能因为中草药复方制剂作用机制复
杂，多种中草药自身的化学成分之间会相互发生反
应，而且活性成分提取中条件上存在的稍微差异也
会造成最终的有效成分含量有差异，从而影响抑菌
效果．
中草药属于纯天然的物质，具备营养与治疗２
种功效，具有与食物同体、同源、同用的特点，很多
中草药人类和动物是可以食用的，这也是抗生素、
１２１第３１卷 第２期 赵亚萍，等：三叉苦等５味中草药活性成分提取与抑菌性能研究
现代化学合成药物等无法比拟的［２０］．对中草药复
方制剂作为饲料中的防病抗病添加剂或者作为营
养添加剂的研究［２１］较少，而且目前实际应用作为
饲料添加剂的中草药品种并不多，因此有待进一步
研究开发．
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ｆｉｆｔｈ ａｎｄ ｎｉｎｔｈ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｗｈｉｃｈ ｈａｄ ｂｅｔｔｅｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｂｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．
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２２１ 周口师范学院学报 ２０１４年３月