全 文 ：　　收稿日期:2006-07-06
　　作者简介:杨润亚(1974—),女 ,副教授 ,博士 ,主要从事生物农药研究 ,(Tel)0535-6681862,(E-mail)yry74@163.com.
南蛇藤果中内生真菌的抑菌活性研究
杨润亚 ,程　亮 ,刘　珂
(鲁东大学生命科学学院 ,山东 烟台 264025)
摘要:对从南蛇藤果实中分离的 16 株内生真菌用马铃薯葡萄糖培养基进行液体培养 , 将发酵产物中的发酵液
用高压蒸汽湿热灭菌 ,菌丝体晾干研磨后用丙酮提取.用发酵处理液和丙酮粗提物对一些常见的植物病原菌
进行抑菌活性测定.结果表明 , 发酵产物的抑菌率在 50%以上的活性菌株有 13株(占 81.2 %).说明南蛇藤内
生真菌中的抗病原真菌资源十分丰富 ,其中抑菌活性最强的发酵处理液的抑菌率高达 90.5%, 菌丝粗提物的
抑菌率达 89.2%, 但活性菌株的抗菌谱比较狭窄.
关键词:南蛇藤;内生真菌;抑菌活性
中图分类号:TQ450.1　　文献标识码:A　　文章编号:1673-8020(2006)03-0228-04
　　植物内生真菌是指存在于健康植物体内或其
生活史的一定阶段存在于植物体的根 、茎及叶等
组织的细胞间隙或细胞内并与植物建立无害的共
生关系的一类真菌 ,是植物微生态系统的天然组
成成分.内生真菌几乎存在于所有植物体内 ,其具
有生物活性的代谢产物和次生代谢产物也十分丰
富 ,有的活性成分和宿主植物的活性成分相同或
相似 ,有的活性成分则和宿主植物活性成分完全
不同 ,内生真菌是天然活性物质的重要来源[ 1—3] .
内生真菌易于发酵培养 ,便于组织工业化生产 ,因
此进行植物内生真菌研究 ,提取其具有生理活性
的次生代谢物并直接开发利用 ,前景十分广阔.许
多植物内生真菌的代谢物具有农药活性 ,利用植
物内生真菌来研究开发生物农药 ,是解决化学农
药“3R”问题(抗性 、残留和再猖獗)的有效途径之
一[ 4—6] .南蛇藤(Celastrus orbiculatus Thunb)是卫矛
科南蛇藤属植物 ,藤本 ,主要分布于我国的东北 、
华北 、西北 、华东 、西南 、广东及两湖地区 ,朝鲜和
日本亦有分布 ,根 、茎 、叶 、果可入药 ,研究证实其
具有消炎镇痛 、抗肿瘤 、抗菌 、抗病毒 、抗生育 、对
昆虫具有拒食及毒杀等作用[ 7] .但对其内生真菌
的研究尚未见报道.本文对南蛇藤果实内生真菌
进行了分离 ,并对其对植物病原真菌的抑菌活性
进行了筛选研究 ,旨在研究南蛇藤内生真菌代谢
产物的化学成分 ,为生物农药的研制开发提供理
论依据.
1　材料和方法
1.1　材料
　　实验所用的南蛇藤果实采自鲁东大学西山.
供试植物病原真菌共 10 种 ,分别为苹果褐腐菌
(Sclerotinia frucligena)、番茄早疫菌(Alternaria
solani)、番茄晚疫菌(Phytophthora infestans)、小麦
赤霉菌(Fusarium graminearum Schw)、西瓜炭疽菌
(Colletetrichum orbiculare)、棉花立枯菌(Rhizoctonia
solani)、棉花枯萎菌(Fusarium oxysporum vasinfec-
tum)、小麦纹枯菌(Rhizoctonia cerealis)、辣椒疫霉
菌(Phytophthora capsici Leonian)、苹果轮纹菌
(Physalospora nasei),均由西北农林科技大学植物
病理研究室提供.实验所用培养基为 PDA 培养基
(马铃薯 200 g/L ,葡萄糖 20 g/L ,琼脂 20 g/L , pH
值自然 ,液体培养基不加琼脂).
1.2　仪器
　　离心机 、电子天平 、恒温干燥箱 、高压灭菌锅 、
超净工作台 、生化培养箱和水浴锅.
1.3　方法
　　1)内生真菌的分离　在常规无菌操作下 ,取
新鲜无病虫害的南蛇藤果实 ,用清水冲洗干净后
　鲁东大学学报(自然科学版)
　Ludong University Journal(Natural Science Edition) 2006 , 22(3):228—231　
进行表面消毒(先用 75%的酒精浸泡 3—5 min ,
用无菌水漂洗 3 次后 ,再在 0.1%的升汞中浸泡
3—5 min ,最后用无菌水漂洗 5次),消毒过的材
料在超净工作台上用灭菌的解剖刀切为两半 ,切
口朝下接种到 PDA平板上 , 28℃培养.待材料周
围长出菌落时 ,采用尖端菌丝挑取法对所分离的
内生真菌进行纯化.根据菌落特征和菌丝特点 ,将
分离到的内生真菌归成不同的类群 ,并转接到
PDA斜面上 ,28℃培养 2—4 d ,4℃冰箱保存[ 8] .
　　2)液体培养及后处理　将保存的南蛇藤内
生真菌先接种到PDA斜面上 ,28℃培养 4—5 d进
行活化.将已活化的内生真菌再分别接种到装有
200 mL PDA液体培养基的三角瓶中 ,置于摇床上
(28℃,140 r/min)培养 10 d ,纯培养基作对照.从
每种发酵液中吸取 50 mL 分别经 5000 r/min 离
心15 min后 ,取上清液保存;用两层纱布过滤菌
丝体 ,晾干 ,研磨后将菌丝体按 1(g)∶15(mL)的比
例用丙酮 40℃水浴分两次提取 ,第一次 5 h ,第二
次过夜 ,保存提取液.
　　3)发酵液和菌丝体粗提物抑菌活性的测定
采用生长速率法[ 9] .用离心法获得的内生真菌发
酵液 ,按 1∶9的体积比与 PDA 培养基混匀 ,121℃
高温灭菌[ 10]后倒平板 ,用液体培养时的对照 PDA
培养基作空白对照;菌丝体丙酮提取液在无菌体
条件下按照 1∶9的体积比加入已灭菌的熔化 PDA
培养基混匀后倒平板 ,用丙酮作空白对照.用直径
0.5 cm的打孔器在生长 5 d 左右的植物病原真
菌的菌落边缘按同心圆制备菌饼 ,然后将菌饼接
种于含发酵处理液或丙酮提取液的 PDA 培养基
上 ,每个处理设 3个重复 ,于 28℃恒温培养 3 d
后 ,采用十字交叉法测量菌落直径 ,按照公式抑制
率(%)=(对照净生长量-处理净生长量)/对
照净生长量 ×100 计算抑菌率 ,其中净生长量=
三次重复平均值-0.5(菌饼直径).
2　结果及分析
2.1　南蛇藤果内生真菌的分离纯化
　　经过分离纯化 ,从南蛇藤果实中共分离到 16
株内生真菌 ,编号为 G1-G16.根据其主要的群体
形态特点(包括菌落大小 、颜色 、表面特征 、质地)
和个体形态特点(包括菌丝 、子实体和孢子形态),
对其分类地位进行了初步鉴定 ,初步认为有 8株
(50%)属于半知菌亚门 、丝孢纲 、丝孢目或无孢
目 ,G10属于接合菌亚门 、接合菌纲 、毛霉目 、毛霉
科 、根霉属 , G12 属于接合菌亚门 、接合菌纲 、毛
霉目 、内囊霉科 ,G11属于半子囊菌纲 、内孢霉目 、
内孢霉科 ,另外 5株(G3 ,G5 ,G6 ,G13 ,G16)的分类
地位未定.进一步鉴定结果拟另文报道.
2.2　内生真菌发酵液对植物病原真菌的抑菌活
性
　　南蛇藤果实中内生真菌发酵液对植物病原菌
的抑菌活性结果见表 1.从表 1可以看出 ,有 9株
内生真菌(占总供测菌株数的 56.2%)发酵液经
过高压灭菌处理后仍具有一定的抑菌活性(抑菌
率大于 50%),最高抑菌率为 90.5%(G10对苹果
褐腐菌),这表明南蛇藤内生真菌中存在着广泛的
抗病原真菌资源.另外 ,南蛇藤内生真菌发酵液的
抗菌谱比较狭窄 ,只有 2 株内生真菌(G10 ,G11)
的发酵液同时对两种或两种以上病原菌有大于
50%的抑菌活性 ,其他菌株则仅对一种病原菌有
大于 50%的抑菌活性或没有明显的抑菌活性 ,且
抑菌活性主要表现在对小麦赤霉菌 、苹果褐腐菌
及小麦纹枯菌 3种病原菌上 ,16株内生真菌发酵
液中有 7 株对小麦赤霉菌有大于 50%的抑菌活
性 ,有 3 株对苹果褐腐菌有大于 50%的抑菌活
性 ,有 1株(G14)对小麦纹枯病有大于 50%的抑
菌活性.有些菌株的发酵液对病原真菌的抑菌率
为负值 ,表明它们之间的关系不是拮抗作用 ,而是
协同作用 ,具体机制尚不明确.
　第 3期 杨润亚 ,等:南蛇藤果中内生真菌的抑菌活性研究 229　
表 1　南蛇藤内生真菌发酵液对植物病原菌的抑菌率 (%)
菌株 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9
G1 37.0 -1.3 2.6 27.0 4.4 0.4 5.9 -44.3 -3.8
G2 25.6 44.3 9.0 57.2 28.1 26.4 -5.5 — -30.3
G3 20.0 39.4 10.5 34.1 25.4 25.6 -10.5 — -11.2
G4 22.3 12.2 11.2 15.9 6.6 15.2 2.7 -84.1 -7.5
G5 20.5 16.1 6.1 57.9 2.2 -43.5 -3.9 -25.0 -17.6
G6 36.4 41.1 9.6 59.6 12.7 10.0 -5.0 — -8.5
G7 52.9 -5.2 9.0 21.3 6.6 6.7 -0.3 -8.0 9.1
G8 9.8 41.2 1.5 64.0 5.3 11.0 -0.8 — -11.2
G9 15.0 31.2 -4.6 48.6 5.3 -18.4 -5.7 — -4.5
G10 90.5 33.9 24.9 51.7 33.9 36.3 8.6 -45.5 22.9
G11 57.1 16.3 10.7 51.4 11.9 -10.8 -3.1 -79.0 13.8
G12 13.6 17.4 -4.3 44.2 0.9 -5.8 -18.8 — -0.6
G13 5.2 -1.8 -3.7 5.8 -10.1 -15.1 -14.6 — -8.2
G14 -59.2 1.5 -14.9 -42.4 -4.1 3.4 -4.8 77.1 —
G15 -3.9 11.3 -5.8 67.5 -2.7 6.4 -20.2 — 21.2
G16 19.3 20.9 11.2 41.1 8.4 2.7 -0.3 -27.3 -5.5
　　注:B1苹果褐腐菌;B2番茄早疫菌;B3番茄晚疫菌;B4小麦赤霉菌;B5西瓜炭疽菌;B6棉花立枯菌;B7棉花枯萎菌;B8小麦纹枯
菌;B9辣椒疫霉菌.“ —”表示未测定.
2.3　内生真菌菌丝体粗提物对植物病原真菌的
抑菌活性
　　南蛇藤果实中内生真菌菌丝体丙酮粗提物对
植物病原菌的抑菌活性见表 2.从表 2可以看出 ,
16株内生真菌有 9株对1种或多种指示菌具有大
于50%的抑菌活性 ,活性菌株占果实内生真菌总
数的 56.2%,最高抑菌率可达 89.2%(G1对棉花
立枯菌);南蛇藤内生真菌菌丝体粗提物的抗菌谱
比较狭窄 ,只有 3株(G1 ,G5 ,G12)对两种或两种
以上的病原菌有大于 50%的抑菌活性 ,其他菌株
则仅对一种病原菌有大于 50%的抑菌活性或没
有明显的抑菌活性 ,且抑菌活性主要表现在对小
麦赤霉病菌 、苹果褐腐病菌 、小麦纹枯病菌及棉花
立枯病菌四种植物病原菌上;16株内生真菌发酵
液中有 4株对小麦赤霉病菌 、2株对苹果褐腐病
菌 、5株对小麦纹枯病菌 、2株对棉花立枯病菌表
现出大于 50%的抑菌活性.有些菌株的菌丝体丙
酮粗提物对某些病原真菌(小麦赤霉菌 、苹果轮纹
菌和苹果褐腐菌)的抑菌率为负值.
表 2　南蛇藤内生真菌菌丝体丙酮粗提物对植物病原菌的抑菌率 (%)
菌株 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9
G1 57.3 30.7 22.3 62.8 27.3 89.2 21.0 21.6 5.2
G2 -70.1 13.6 -20.8 -356.1 0.6 9.1 13.4 — -111.4
G3 42.7 -0.9 -9.6 -163.2 9.1 4.9 18.7 — -45.0
G4 21.9 40.0 -7.2 51.8 17.5 40.2 13.9 — 1.3
G5 14.9 6.9 17.3 18.0 19.2 83.8 9.6 83.8 -17.9
G6 16.7 34.5 18.4 -272.8 29.9 38.4 5.9 — -38.9
G7 10.4 2.6 16.0 10.4 7.9 35.1 15.9 35.1 -9.1
G8 1.0 -6.4 -16.2 64.9 8.4 11.5 -2.1 — -21.4
G9 2.8 -28.2 -27.7 -5.3 2.6 -0.2 -7.0 — -17.9
G10 68.5 10.5 13.5 -162.3 18.1 11.7 16.4 21.6 -68.0
G11 -113.5 -23.6 -18.4 -202.6 -5.2 -1.8 -4.3 — -62.4
G12 2.5 8.5 2.3 51.9 7.9 -20.7 2.2 62.2 -75.7
G13 2.0 35.3 10.4 -186.3 11.2 -38.7 4.3 24.3 -75.7
G14 46.1 13.7 2.9 43.2 5.5 9.2 4.3 56.8 -35.6
G15 37.7 39.2 19.8 -273.8 6.1 -17.1 9.3 64.9 -51.8
G16 39.8 24.2 20.4 -33.3 15.8 24.3 19.5 51.4 -61.1
　　注:B1—B8代表的菌同表 1;B9为苹果轮纹菌.“ —”表示未测定.
3　结语
　　1)综合表 1 ,2的结果可以看出 ,从南蛇藤果
中分离到的 16 株内生真菌 ,有 13株的发酵产物
(发酵液或是菌丝体)对供试病原真菌有大于
50%的抑菌活性 ,其中抑菌活性最强的发酵处理
液抑菌率可达 90.5%,菌丝体粗提物抑菌率可达
230　 鲁东大学学报(自然科学版) 第 22 卷　
89.2%;其余 3 株内生真菌(G3 , G9 ,G13)的发酵
产物(发酵液和菌丝体)对供试植物病原真菌没有
明显的抑菌活性.表明南蛇藤内生真菌中存在着
广泛的抗植物病原真菌的微生物资源(活性菌株
占供试菌株总数的 81.2%).同一株内生真菌的
发酵液和菌丝粗提物在抗菌谱和抑菌率上均有差
别 ,表明发酵液和菌丝体中的抑菌活性成分可能
不是同一种或同一类化合物.南蛇藤果中的内生
真菌抗菌谱比较狭窄 ,大部分发酵液或菌丝体只
对一种病原菌具有较强的抑菌作用 ,少数发酵产
物对两种或三种病原菌具有较强的抑菌作用.南
蛇藤果中内生真菌的抑菌活性物质既有胞内代谢
产物(存在于菌丝体细胞内),也有胞外代谢产物
(存在于发酵液中).本实验只是初步筛选了南蛇
藤果中的内生真菌 ,对南蛇藤其他组织中的活性
内生真菌菌株的筛选及其抑菌活性成分的分离纯
化有待于进一步研究.
　　2)本实验对内生真菌发酵液的处理 ,直接采
取高压灭菌来除去发酵液中残余的菌丝体 ,也未
对发酵液进行浓缩 ,这种方法虽然简便易行 ,但可
能破坏或漏筛发酵液中的某些活性成分 ,在今后
的研究中可采取其他较为温和的方法 ,如冷冻干
燥 、减压浓缩等.对内生真菌发酵菌丝体的处理 ,
也仅用了丙酮一种溶剂进行提取 ,今后可多选用
几种极性不同的溶剂对菌丝体进行萃取并测定其
抑菌活性.对内生真菌的鉴定仅用了形态学方法 ,
还有待于采用分子生物学方法确证.
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Study on the Antifungal Activities of Endophytic Fungi Isolated
from the fruits of Celastrus orbiculatus Thunb
YANG　Run-ya ,CHENG　Liang ,LIU　Ke
(School of Life Science , Ludong University ,Yantai 264025 , China)
Abstract:Sixteen isolates of endophytic fungi were obtained from the fruits of Celastrus orbiculatus Thunb ,which
were cultivated in liquid media respectively.Moist-heat sterilization was used to dispose the fermentation broth , and
mycelia were extracted with acetone after desiccated and grounded.The antifungal activities of the disposed fermenta-
tion broth and the acetone extracts on several plant pathogenic fungi were measured.The results show that the fer-
mentation products of 13 strains(81.2%)exhibits more than 50%fungicidial activity.The endophytic fungi with an-
tifungal activities in C.orbiculatus are resourceful.The inhibition rate of the disposed cultural liquid with the
strongest antifungal activity is as high as 90.5%,while that of the mycelium extract is up to 89.2%and the antifun-
gal spectrum was narrow.
Key words:Celastrus orbiculatus;endophytic fungus;antifungal activity
(责任编辑　司丽琴)
　第 3期 杨润亚 ,等:南蛇藤果中内生真菌的抑菌活性研究 231