全 文 ：琼枝麒麟菜多糖对辐射损伤小鼠
细胞因子分泌的影响
吴显劲 , 孟庆勇① , 欧超伟
(广东医学院附属医院检验科 ,广东湛江 524001)
　　摘要:目的观察琼枝麒麟菜多糖(EGP)对辐射损伤小鼠细胞因子分泌的影响 ,为辐射损伤
的治疗提供依据。方法 将 50只小鼠随机分为正常对照组 、照射对照组和 3个不同剂量 EGP
〔(100 、200和 400 mg/(kg·d)〕+照射组 ,按每 10 g 体质量 0.1 mL 灌胃 ,连续 10 d;正常对照和照
射对照组均用等量生理盐水灌胃;7 d后除正常对照组外 ,均进行一次性γ射线 2 Gy 照射 , 20 h
后检测巨噬细胞产生白细胞介素-1(IL-1)活性 ,以及血清白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α
(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)水平和脾 IFN-γmRNA和蛋白表达量。结果(1)EGP 200 、400mg/kg +
照射组小鼠巨噬细胞产生 IL-1蛋白量(液闪计数 , min-1)分别为 2 347±254 、3 111±628 ,明显高
于照射对照组的1 327±729(P<0.01);(2)EGP 200 、400mg/kg 照射对照组小鼠血清 IL-2 、TNF-
α、 IFN-γ(pg/mL)分别为 31.62±1.71 、124.27±17.28 、110.57±15.71和 34.30±2.14 、136.19±
17.94 、123.57±14.47 ,明显高于照射对照组的 23.06±1.79 、99.76±9.41 、88.28±10.62 pg/mL
(P<0.05 , P <0.01);(3)EGP 200 、400 mg/kg+照射组小鼠脾细胞 IFN-γmRNA 和蛋白表达量
(灰度值)分别为0.75±0.13 、1.08±0.15 、1.21±0.13和93 247±5 627 、130 154±7 279 、17 1467±
8 678 ,明显高于照射对照组的 0.35±0.10 、50 096±4 815(P <0.01)。结论 琼枝麒麟菜多糖
(EGP)可以通过分泌上述细胞因子拮抗辐射损伤 。
　　　　关键词:　麒麟菜多糖;　细胞因子;　免疫调节;　γ射线
　　　　　中图分类号:R967 , R818.7　　文献标识码:A　　文章编号:1001-5248(2009)06-0398-04
　　海藻是海洋中的低等隐花植物 ,全球约有 3万
余种 ,被人类广为利用的海藻主要有褐藻 、红藻 、绿
藻和蓝藻等约百余种 。近年来研究表明 ,这些海藻
多糖 ,除具有传统的工业价值外 ,还具有多种生物活
性及药用功能:调节免疫 、抗病毒 、抗肿瘤 、抗突变 、
抗氧化等〔1〕 。
本实验采用 2 Gy γ射线照射小鼠为模型 ,观察
琼枝麒麟菜多糖(Eucheuma gelatinae polysaccharide ,
EGP)对照射小鼠 IL-1 、IL-2 、TNF-α和 IFN-γ的影响 ,
以探讨 EGP的抗辐射作用 ,为辐射防护剂的应用提
供科学依据。这对于保障在有福射环境中从业人员
的身体健康有重要意义。
基金项目:广东省医学科研基金课题项目(No.A2004455)
广东省湛江市科技攻关课题项目(No.208c04009)
作者简介:吴显劲(1973-),男 , 研究生 ,医学硕士 , 副主任技师。从
事药物生化研究。
①广东医学院分析中心
1　材料和方法
1.1　实验动物　昆明小鼠 50只 ,雄性 ,6 ～ 8周龄 ,
体质量(20±2)g ,由广东医学院实验动物中心提供 。
1.2　材料来源　EGP 从海南产琼枝麒麟菜中提取 ,
藻体经 95 ℃水浴提取 、醇沉淀及流水透析后真空干
燥制得 ,由红外光谱鉴定呈 β -糖苷键型特征吸收
峰 ,醋酸纤维薄膜电泳检测为电泳纯 ,硫酸-酚法测
得总糖含量为83%。
1.3　主要试剂及仪器　RPMI-1640培养液(Gibco ,
美国), 小牛血清(Hyclone ,美国), ConA 和 LPS(Sig-
ma ,美国),3H-TdR 、3H-TyR(中科院上海原子核研究
所);CO2 培养箱(150 ,丹麦),标准架液体闪烁系统
(LS-6000SC ,美国)。
1.4　照射条件　60Coγ射线一次性全身均匀照射 ,
照射距离为 80 cm ,剂量率为 0.673 Gy/min ,吸收剂
量 2 Gy 。
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DOI :10.13704/j.cnki.jyyx.2009.06.007
1.5　分组处理　小鼠随机分为正常对照组 、照射对
照组和 EGP不同剂量 100 、200和 400 mg/(kg·d)+
照射组 ,每组 10只 。按每10 g 体质量0.1 mL灌胃 ,
连续 10 d;正常对照组和照射对照组均用等量生理
盐水灌胃;停止灌胃 20 h后行一次性γ射线全身照
射(正常对照组不照射)。
1.6　细胞悬液制备
1.6.1　小鼠腹腔巨噬细胞制备　3%硫乙醇酸钠培
养基腹腔注射于照射后小鼠 ,每只 1 mL ,连续 4 d ,
第5天脱臼处死。腹部消毒后 ,用3 mL 冰冷的不完
全 RPMI-1640培养基腹腔注射 ,轻柔腹部数分钟后
解剖小鼠 。吸取腹腔液于无菌试管中 , RPMI-1640
培养基冲洗小鼠腹腔 3次 ,合并冲洗液于无菌试管
中 ,离心10 min(2 000 r/min),沉淀后去上清液 ,再用
RPMI-l640培养液洗涤 3次 ,以含有 10%FCS(小牛
血清)RPMI-1640 培养液调细胞浓度为 2×106/mL;
将该细胞加入 24 孔培养板内每孔 l mL ,或加入 96
孔培养板内每孔 0.1 mL ,37 ℃、5%CO2贴壁 3.5 h ,
倾去上清液 ,洗涤细胞 3次 ,除去非粘附细胞 ,加入
EDTA重新悬浮细胞 ,用含有 10%FCS 的 RPMI-l640
培养液调细胞质量浓度至 1×106/mL。
1.6.2　胸腺细胞悬液制备　照射后 24 h ,将小鼠断
头处死 ,无菌条件下取出胸腺置于盛有 RPMI-1640
培养液的培养皿中 ,用毛玻璃片研磨后 ,以 200目不
锈钢网滤出单细胞悬液 ,经 Hanks液洗涤 2次 ,离心
5 min(1 000 r/min);以 RPMI-1640培养液调细胞质
量浓度为 2×107/mL。
1.7　检测指标
1.7.1　巨噬细胞产生 IL-1活性测定〔2〕　(1)IL-1的
诱生:取 24孔培养板 ,每孔加入 2×l05 mL 巨噬细胞
1 mL , 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养 2 h , 用 RPMI-
1640培养液洗涤细胞 2 次 ,去除未贴壁细胞 , 每孔
加入 1 mL含 20μg/mL LPS的 RPMI-1640培养液 ,继
续培养40 h ,吸取培养液 ,离心 10 min(3000 r/min),
收集上清液 ,用于测定 IL-1 活性。(2)IL-1活性测
定:取 96孔培养板 ,每孔加入 2×107/mL 小鼠胸腺
细胞 100μL(含 ConA 5μg/mL ),然后加入 10%巨噬
细胞培养上清液 ,每份样品设 3复孔 、37 ℃、5%CO2
的培养箱中培养 72 h ,终止前 8 h加入每 30μL 18.5
kBq的3H-TdR ,多头细胞收集器收获细胞于玻璃纤
维滤纸上 ,液闪测定放射性强度(每分钟液闪计数 ,
min-1),结果代表 IL-1的生物活性。
1.7.2　血清 IL-2 、IFN-γ和 TNF-α检测 ,均按 ELISA
说明书操作 。
1.7.3　引物设计与合成从基因库中获得基因全长
后 ,运用 DNA Star 5.0软件进行引物设计。引物的
合成委托上海生工生物工程公司完成 。
1.7.4　RT-PCR和 Western-blot分别检测脾 IFN-γ
mRNA和蛋白表达 , 图像经扫描仪扫描后 ,用 Band-
scan 4.3图像分析软件扫描计算灰度值。
1.8　统计学处理 　实验数据以 x ±s 表示 , 用
SAS8.2统计软件进行单因素方差分析。
2　结果
2.1　EGP 对受照小鼠巨噬细胞分泌 IL-1的影响　
从表 1可看出 ,照射对照组小鼠巨噬细胞 IL-1分泌
功能明显低于正常对照组(P<0.01), EGP 200 、400
mg/kg+照射小鼠巨噬细胞 IL-1 分泌功能高于照射
对照组(P <0.01)。EGP 100 mg/kg 组小鼠巨噬细
胞 IL-1分泌功能也高于照射对照组 ,但差异无显著
性(P>0.05)。
表 1　EGP对受照小鼠巨噬细胞分泌
　　IL-1的影响( x ±s , n =10)
组　别　　　　　　　　 IL-1(min-1)
　正常对照 5 002±929
　照射对照 1 327±729＊＊
　EGP 100 mg/kg+照射 1 696±392
　EGP 200 mg/kg+照射 2 347±254##
　EGP 400 mg/kg+照射 3 111±628##
　与照射对照组比较:＊＊P<0.01;
与正常对照组比较:##P<0.01
2.2　EGP 对受照小鼠血清 IL-2 、TNF-α和 IFN-γ的
影响　从表 2可看出 ,照射对照组小鼠血清 IL-2 、
TNF-α、IFN-γ水平明显低于正常对照组(P <0.01)。
EGP 200 、400 mg/kg +照射组小鼠血清 IL-2 、TNF-α、
IFN-γ明显高于照射对照组(P <0.05 , P <0.01)。
EGP 100 mg/kg +照射组的小鼠血清 IL-2 、TNF-α和
IFN-γ水平与照射对照组相比 ,亦有一定的升高 ,但
差异无显著性(P>0.05)
2.3 　琼枝麒麟菜多糖对受照小鼠脾细胞 IFN-
γmRNA和蛋白表达的影响　从表 3可看出 ,照射对
照组小鼠脾细胞 IFN-γmRNA 和蛋白表达量明显低
于正常对照组(P<0.01),3个剂量 EGP+照射组小
鼠脾细胞 IFN-γmRNA和蛋白表达量均明显高于照
射对照组(P<0.01)。
·399·解放军预防医学杂志　2009 年 12 月 第 27卷 第 6 期　J Prev Med Chin PLA　December 2009　Vol.27 No.6
表 2　EGP对受照小鼠血清 IL-2 、TNF-α和 IFN-γ水平的影响( x ±s , n=10)
组　别　　　　　　　 IL-2(pg/mL) TNF-α(pg/mL) IFN-γ(pg/ mL)
　正常对照 37.77±1.10 161.06±12.18 133.62±15.55
　照射对照 23.06±1.79＊＊ 99.76±9.41＊＊ 88.28±10.62＊＊
　EGP 100 mg/kg+照射 25.77±2.04 105.55±10.90 92.51±12.54
　EGP 200 mg/kg+照射 31.62±1.71## 124.27±17.28# 110.57±15.71#
　EGP 400 mg/kg+照射 34.30±2.14## 136.19±17.94# 123.57±14.47#
　　与正常对照组比较:＊＊P <0.01;　与照射对照组比较:＊P <0.05 , 　##P<0.01
表 3　琼枝麒麟菜多糖对受照小鼠脾细胞 IFN-γmRNA和蛋白表达的影响( x ±s , n=10)
组　别　　　　　　　　　　 IFN-γmRNA/β-内参(灰度值) IFN-γ蛋白表达量/β-内参(灰度值)
　正常对照 1.41±0.21 219 251±13 995
　照射对照 0.35±0.10＊＊ 50 096±4 815＊＊
　EGP 100 mg/kg+照射 0.75±0.13## 93 247±5 627##
　EGP 200 mg/kg+照射 1.08±0.15## 130 154±7 279#
　EGP 400 mg/kg+照射 1.21±0.13## 171 467±8 678##
　　与正常对照组比较:＊＊P <0.01;　与照射对照组比较:##P <0.01
3　讨论
　　国内外研究表明 ,绝大多数海藻多糖都能促进
IL-1 、IL-2 、IFN-γ、TNF-α的生成 。Yoshizawa 等〔3〕从
海藻中分别用酸和热水提取多糖 ,体外和体内实验
均证实海藻多糖能促进巨噬细胞分泌 TNF 和 IL-1 ,
且呈剂量依赖性关系 。极大螺旋藻胞外多糖可明
显促进 IL-2产生〔4〕 。螺旋藻多糖增强 rIL-2活性同
时还可能增进抗体和干扰素分泌 ,T 细胞受到激活
也能提高 TNF-α水平 。螺旋藻多糖促进荷瘤小鼠
分泌 TN ,是提高抗肿瘤活性的基础 ,其功能除具有
直接杀伤肿瘤细胞作用外 ,也能增强NK细胞活性 ,
刺激 T淋巴细胞诱导γ-干扰素和淋巴因子分泌 ,调
节MHC型抗原的表达等功能。Shibata 等〔5〕发现 ,
墨鱼藻聚糖能激活 TNF-α的分泌 ,增加巨噬细胞和
多形核白细胞过氧化物酶的含量拮抗胃癌。
IL-1是迄今已知抗放效应较强的细胞因子 ,这
与它通过直接参与启动造血干 、祖细胞的活化过
程 ,增加骨髓中性粒细胞系和巨噬细胞系造血祖细
胞比例 ,动员骨髓造血细胞进入细胞周期中发生敏
感性相对较低的晚 S 期等有关〔6〕 。本实验发现 ,小
鼠接受2 Gy γ射线全身照射 24 h后 ,巨噬细胞分泌
IL-1显著降低 ,而200 mg/kg和 400 mg/kg的琼枝麒
麟菜多糖对受照小鼠巨噬细胞 IL-1 分泌具有明显
的促进作用 ,且 IL-1的生成量与 EGP 呈剂量依赖关
系 ,说明琼枝麒麟菜多糖不仅能提高辐射损伤小鼠
巨噬细胞的自身吞饮功能〔7〕 ,而且可通过提高细胞
因子的分泌调节免疫网络而达到抗辐射效应 。TNF
分为 TNF-α和 TNF-β ,前者主要由单核细胞和巨噬
细胞产生 ,与抗微生物活性和肿瘤杀伤活性密切相
关 ,从而更广泛地影响着机体的免疫功能 。实验结
果显示 ,200 、400 mg/kg EGP小鼠 TNF-α生成值明显
高于对照组 ,说明琼枝麒麟菜多糖对辐射照射小鼠
的TNF-α也有促进作用。据报道 , IL-1和 TNF 都是
具有辐射防护作用的细胞因子 ,但 TNF-α使用剂量
大于 IL-1。 IL-1和TNF-α联合使用对致死性辐照动
物具有明显的协同保护作用〔8〕 。
细胞因子的检测方法包括免疫学 、生物学和分
子生物学测定。由于细胞因子种类繁多 ,各因子间
存在网络调节 ,一种细胞因子往往具有多种功能 ,
而同一种功能又有可能有多种因子引起 。因此 ,在
检测细胞因子时 ,常采用多种方法综合分析 。本实
验中 ,用免疫学方法证实 ,琼枝麒麟菜多糖能显著
促进 Th 1细胞相关细胞因子 IL-2和 IFN-γ的分泌。
提示 EGP 能促进Th 1细胞的增殖和细胞因子的分
泌 ,从而抑制了 Th 2细胞的增殖 ,导致针对 TD抗原
的抗体产生受抑制。同时 , IL-2和 IFN-γ是机体免
疫调节网络中重要的调节因子 ,在抑制肿瘤细胞生
长及免疫调节方面发挥着重要的作用。本实验还
观察了 EGP 对辐射损伤小鼠脾细胞 IFN-γ转录水
平和蛋白水平的影响 。结果表明 ,对照组小鼠脾细
胞 IFN-γmRNA和蛋白表达均下调 ,而 EGP 对受照
小鼠脾细胞 IFN-γmRNA 和蛋白表达起正调控作
用。EGP 能够促进 IL-2和 IFN-γ的分泌 ,说明 EGP
·400· 解放军预防医学杂志　2009 年 12 月 第 27卷 第 6 期　J Prev Med Chin PLA　December 2009　Vol.27 No.6
可通过细胞因子调节机体的免疫功能〔9-10〕。
以上研究发现 , EGP 能促进辐射照射小鼠巨噬
细胞 IL-1 的分泌 ,也能增加血清中 IL-2 、IFN-γ和
TNF-α的水平 ,而且对脾细胞 IFN-γ转录水平和蛋
白水平也有明显提高 ,说明琼枝麒麟菜多糖可以通
过分泌上述细胞因子拮抗辐射损伤 。
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射小鼠免疫功能的影响〔J〕.中国职业医学 , 2008 , 35
(6):5
EFFECT OF EUCHEUMA GELATINAE POLYSACCHARIDE ON
CYTOKINE SECRETION IN IRRADIATED MICE
WUXian-jin , MENG Qing-yong , OU Chao-wei
(Department of Clinical Laboratory , Affiliated Hospital of Guangdong Medical College , Guangdong Zhanjiang 524001 , China)
　　ABSTRACT:Objective To investigate the effect of Eucheuma gelatinae polysaccharide(EGP)on cytokine se-
cretion in irradiated mice , so as to provide scientific basis for treatment of irradiated injury.Methods Fifty mice were
randomly divided into 5 groups , normal control group , irradiated control group , and 3 EGP treatment groups which were
treated with EGP 100 ,200 ,400 mg/(kg)respectively by intragastric injection for 10 days , and two control groups with e-
qual volume of physiological saline.On the 7th d , the animals were irradiated with γ-rays(2.0 Gy).Some cytokines
were examined 20 h after irradiation.The expression of mRNA and protein of interferon-γ(IFN-γ)in spleen cell were
detected by RT-PCR and Western blot.Results(1)The level of interleukin-1 in macroghages in 200 mg EGP , 400 mg
EGP groups(2 347±2 540 , 3 111±628 min-1 respectively)were significantly higher than that in irradiated control
group(1 327±729 ,P <0.01);(2)interleukin-2 , tumor necrosis factor-α, and interferon-γin 200 , 400 mg EGP groups
(31.62±1.71 ,124.27±17.28 ,110.57±15.71 pg/mL;34.30±2.14 ,136.19±17.94 ,123.57±14.47 pg/mL re-
spectively)were significantly higher than those in irradiated control group(23.06±1.79 ,99.76±9.41 ,88.28±10.62
pg/mL , P<0.05 , P <0.01)〕;(3)The expression of mRNA , and protein of IFN-γin 3 EGP groups indicated by gray
density (0.75±0.13 , 1.08±0.15 , 1.21±0.13;93 247±5 627 , 130 154±7 279 , 171 467±8 678 respectively)
were significantly greater than those in irradiated control group(0.35±0.10;50 096±4 815 , P <0.01).Conclusion
EGP may protect the mice against irradiation damage by enhancing the related cytokines secretion.
　　KEYWORDS:Eucheuma gelatinae polysaccharide;cytokine;immunomodulatory;γ-rays
(收稿日期:2007-12-13;修回日期:2008-03-06)
·401·解放军预防医学杂志　2009 年 12 月 第 27卷 第 6 期　J Prev Med Chin PLA　December 2009　Vol.27 No.6