全 文 ：［饮片炮制］
聚类分析和主成分分析法研究三叶青氯仿部位 HPLC指纹图谱
张煜炯1， 彭 昕1，2* ， 吉庆勇3， 郭巧生2
(1． 浙江医药高等专科学校，浙江 宁波 315100;2． 南京农业大学中药材研究所，江苏 南京 210095;3．
丽水市绿谷三叶青珍稀植物研究所，浙江 丽水 323000)
收稿日期:2015-08-30
基金项目:浙江省中医药科技计划 A 类项目 (2013ZA119) ;浙江省教育厅科研项目 (Y201432548) ;浙江省新苗人才计划项目
(2013R433007) ;浙江医药高等专科学校校级课题 (ZPCSR2014005)
作者简介:张煜炯 (1982—) ，男，硕士，实验师，研究方向为中药材质量控制。Tel:15958298818，E-mail:sshhjj23@ 163． com
* 通信作者:彭 昕 (1980—) ，女，硕士，副教授，研究方向为分子生物学。E-mail:px4142@ 163． com
摘要:目的 建立不同产地三叶青药材氯仿部位的 HPLC指纹图谱，并进行聚类分析和主成分分析。方法 分析采用
Agilent C18色谱柱;以乙腈-0. 1%磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱;体积流量 1. 0 mL /min;柱温 30 ℃;检测波长
210 nm。结果 17 批三叶青样品的 HPLC指纹图谱中有 15 个共有峰，其中 3 个峰被确认为槲皮素、山萘酚-3-O-新橙
皮糖苷和 β-谷甾醇。结论 样品产地可被聚成 5 类，并且 4 个主成分的累计方差贡献率为 85. 38%。
关键词:三叶青;氯仿部位;HPLC指纹图谱;聚类分析;主成分分析
中图分类号:R284. 1 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2016)03-0607-06
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2016. 03. 028
HPLC fingerprint of the chloroform extract of Tetrastigma hemsleyanum by clus-
ter analysis and principal component analysis
ZHANG Yu-jiong1， PENG Xin1，2 * ， JI Qing-yong3， GUO Qiao-sheng2
(1． Zhejiang Pharmaceutical College，Ningbo 315100，China;2． Department of Chinese Medicinal Materials，Nanjing Agricultural University，Nan-
jing 210095，China;3． Lishui Institute of Tetrastigma Hemsleyanum，Lishui 323000，China)
ABSTRACT:AIM To establish the HPLC fingerprint of chloroform extract of Tetrastigma hemsleyanum Diels et
Gilg from different growing areas and to make cluster analysis and principal component analysis． METHODS
The analysis was performed on Agilent C18 column，mobile phase was acetonitrile-0. 1% phosphoric acid aqueous
solution with gradient elution，flow rate was 1. 0 mL /min，column temperature was maintained at 30 ℃，and detec-
tion wavelength was set at 210 nm． RESULTS There were fifteen common peaks in the HPLC fingerprints of sev-
enteen batches of Tetrastigma hemsleyanum samples，three of which were identified as quercetin，kaempferol-3-O-
rutinoside and β-sitosterol． CONCLUSION The growing areas of samples can be classified into five groups，and
four principal components make up 85. 38% of the total variance．
KEY WORDS:Tetrastlgma hemsleyanum Diels et Gilg;chloroform extract;HPLC fingerprint;cluster analysis;
principal component analysis
三叶青 Tetrastlgma hemsleyanum Diels et Gilg 又
名有角乌蔹莓、石老鼠、金线吊葫芦等，为葡萄科
崖爬藤属植物，，可治疗高热、肝炎、风湿性关节
炎及病毒性脑膜炎等多种疾病［1-2］，也是抗肿瘤常
用药物［3-4］，含黄酮、有机酸和花青素类等多种活
性成分［5］，其块根中分离并鉴定出的化合物有 β-
谷甾醇、胡萝卜苷、山萘酚-3-O-新橙皮糖苷等［6］，
为三叶青中重要的药效成分［7-8］。本课题组前期从
中筛选出抗肝癌细胞毒活性最强的为氯仿提取部
分，呈剂量依赖性地诱导肝癌 HepG2 细胞，呈现
典型的凋亡特征性改变，并可改变其细胞周期分
布，发生 S期阻滞［9］。
706
2016 年 3 月
第 38 卷 第 3 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
March 2016
Vol． 38 No． 3
大量研究表明，不同产区、品种三叶青有效成
分的含有量及药理活性差异悬殊，如不同产地野生
及栽培三叶青中总黄酮含有量相差最多 7 倍［10］，
而个别产区几乎检测不到［11］，严重影响了临床疗
效，故建立三叶青药材质量评价体系，以确保其临
床应用显得极为迫切。目前，有关对三叶青药理作
用和药材质量的报道仅以总黄酮或其中几个黄酮成
分的定量分析为参考指标［12］，难以全面反映和区
分该药材的整体质量。近年来，HPLC 指纹图谱以
其快速准确的特点，被广泛应用于中药生产、质量
控制等方面［13］，其反映的化学成分，包括中药有
效部位及种类，成为控制中药材质量的可靠技术，
文献 ［14］对三叶青 HPLC 指纹图谱进行了初步
探索，但其取样仅局限于浙江产区，而且未对共有
化学特征峰等进行统计学分析，信息非常有限。为
更全面地控制三叶青药材的质量，本实验建立了以
其氯仿活性部位为基础的 HPLC 指纹图谱，测定
17 个不同产地的药材，并结合聚类分析和主成分
分析［15］，对其模式进行识别研究，可为更全面评
价该部位活性物质的质量提供科学依据。
1 仪器与试药
1. 1 仪器 Dionex Ultimate 3000 高效液相色谱仪，
包括四元泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、
DAD检测器;XS105DU电子分析天平 (瑞士 Mett-
ler-Toledo 公司) ;6202 高速粉碎机 (台湾欣镇企
业有限公司) ;LABOROTA 4000 旋转蒸发仪 (德
国 Heidolph 公司) ;Millipore Simplicity 超纯水机
(美国 Pall公司) ;SB-5200D 超声波清洗机 (宁波
新芝生物科技有限公司)。
1. 2 药材 三叶青药材由浙江省丽水市绿谷三叶
青珍稀植物研究所提供，并经吉庆勇高级农艺师鉴
定为三叶青 Tetrastlgma hemsleyanum Diels et Gilg 的
块茎，样本保存于丽水市绿谷三叶青珍稀植物研究
所，具体信息见表 1。
1. 3 试剂 乙腈 (美国 TEDIA 公司)、甲醇 (天
津四友精细化学品公司)为色谱纯;氯仿、磷酸、
95%乙醇为分析纯;水为超纯水。β-谷甾醇 (批
号 ZN1113BA14)、山萘酚-3-O-新橙皮糖苷 (批号
RF0228FA14)、槲皮素 (批号 TP60448FC23)对
照品，均购自上海源叶生物科技有限公司。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件 Agilent C18色谱柱 (4. 6 mm ×
250 mm，5 μm) ;流动相为乙腈 (A)-0. 1%磷酸
水溶液 (B) ，梯度洗脱 (0 ～ 10 min，20% A;
10 ～ 40 min，20 ～ 80% A;40 ～ 80 min，80 ～ 95%
A) ;体积流量 1. 0 mL /min;柱温 30 ℃;检测波长
210 nm;进样量 20 μL。
表 1 三叶青药材信息及相似度
Tab. 1 Information and similarities of T． hemsleyanum
samples
编号 采收地 纬度 经度 采收时间 相似度
S1 贵州贵阳 N26 °37 E106 °41 2013. 05 0. 816
S2 云南呈贡 N24 °51 E102 °50 2013. 09 0. 932
S3 浙江宁波 N29 °46 E121 °31 2013. 08 0. 941
S4 湖北恩施 N30 °18 E109 °30 2014. 02 0. 865
S5 福建南屏 N26 °38 E118 °30 2014. 10 0. 918
S6 浙江遂昌 N28 °26 E119 °50 2014. 08 0. 885
S7 湖北恩施 N30 °18 E109 °30 2014. 06 0. 905
S8 贵州兴义 N24 °59 E104 °50 2014. 10 0. 951
S9 浙江磐安 N29 °02 E120 °33 2014. 05 0. 897
S10 广西柳州 N24 °19 E109 °24 2014. 01 0. 884
S11 浙江莲都 N28 °26 E119 °50 2013. 06 0. 967
S12 浙江庆元 N27 °37 E119 °08 2013. 09 0. 914
S13 广西百色 N23 °53 E106 °37 2014. 01 0. 917
S14 浙江仙居 N28 °44 E120 °37 2014. 02 0. 881
S15 浙江遂昌 N28 °26 E119 °50 2013. 08 0. 985
S16 重庆垫江 N30 °15 E107 °25 2014. 07 0. 943
S17 广西玉林 N22 °38 E110 °08 2014. 03 0. 905
2. 2 供试品溶液制备 药材除去杂质，自然晾干，
高速粉碎过 60 目筛，精密称取 3. 0 g，置于 250
mL圆底烧瓶中，精密加入 95%乙醇 70 mL，超声
30 min (250 W、40 KHz) ，80 ℃水浴回流提取
1. 0 h，过滤，重复 3 次，合并滤液，浓缩挥干。
加 20 mL 水超声溶解，100 mL 石油醚 (60 ～
90 ℃)萃取 1 次，弃去石油醚部分，再用 50 mL
氯仿萃取 3 次，合并氯仿部分，浓缩挥干。甲醇定
容于 5 mL量瓶中，0. 22 μm微孔滤膜滤过，即得。
2. 3 对照品溶液制备 精密称取 β-谷甾醇 3. 06
mg、山萘酚-3-O-新橙皮糖苷 2. 95 mg、槲皮素
2. 42 mg，置于 10 mL 量瓶中，甲醇定容，超声，
0. 22 μm微孔滤膜滤过，即得。
2. 4 方法学考察
2. 4. 1 精密度试验 取湖北恩施产地 (S7)三叶
青药材，按“2. 2”项下方法制备供试品溶液，在
“2. 1”项色谱条件下进样 6 次，以第 6 次进样所
得指纹图谱为对照，导入中药色谱指纹图谱相似度
评价系统 (2004 年 A 版) ，计算相似度。结果，
相似度均不小于 0. 98，符合指纹图谱相关要求
(不小于 0. 95)［16］，表明仪器精密度良好。
2. 4. 2 稳定性试验 取湖北恩施产地 (S7)三叶
青药材，按“2. 2”项下方法制备供试品溶液，在
806
2016 年 3 月
第 38 卷 第 3 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
March 2016
Vol． 38 No． 3
“2. 1”项色谱条件于 0、2、4、8、12、24 h 检测
指纹图谱，以第 8 h进样所得指纹图谱为对照，导
入中药色谱指纹图谱相似度评价系统 (2004 年 A
版) ，计算相似度。结果，相似度均不小于 0. 98，
表明供试品溶液在 24 h内稳定。
2. 4. 3 重复性试验 取湖北恩施产地 (S7)三叶
青药材，按“2. 2”项下方法平行制备供试品溶液
6 份，在“2. 1”项色谱条件检测指纹图谱，以第
1 次进样所得指纹图谱为对照，导入中药色谱指纹
图谱相似度评价系统 (2004 年 A 版) ，计算相似
度。结果，相似度均不小于 0. 98，表明该方法重
复性良好。
2. 5 指纹图谱的建立与技术参数
2. 5. 1 指纹图谱的建立 将 17 批三叶青药材按
“2. 2”项下方法制备供试品溶液，在 “2. 1”项色
谱条件下进行测定，记录各产地三叶青的 HPLC
图。以 AIA (* cdf)格式导入中药色谱指纹图谱
相似度评价系统 (2004 年 A版) ，设定样品 S10 色
谱图为参照图谱，对保留时间的色谱峰进行多点校
正，自动匹配，时间宽度为 0. 1 min，经系统自动
匹配，生成对照指纹图谱 R，并建立 17 批次三叶
青氯仿部位的指纹图谱，见图 1。
图 1 17 批三叶青药材氯仿部位指纹图谱
Fig. 1 Fingerprints of the chloroform extract of 17
batches of T． hemsleyanum samples
2. 5. 2 共有峰的标定 根据 17 批次三叶青指纹图
谱的检测结果，利用中药色谱指纹图谱相似度评价
系统 (2004 年 A 版)的数据匹配功能，在对照指
纹图谱上标定 15 个共有指纹峰 (占总峰面积 90%
以上) ，见图 2 (A)。通过进样混合对照品，发现
β-谷甾醇、山萘酚-3-O-新橙皮糖苷、槲皮素在各
产地样品图谱中均有发现，保留时间均一致，故确
定 2 号峰为槲皮素，3 号峰为山萘酚-3-O-新橙皮糖
苷，15 号峰为 β-谷甾醇，见图 2 (B)。其中，4
号峰分离度良好，保留时间适宜，故选为参照峰，
而且各共有峰较稳定，具有指纹图谱特征，故拟定
为三叶青药材氯仿活性部位的活性成分群。各产地
药材的共有峰保留时间与相对峰面积见表 2。
2． 槲皮素 3． 山萘酚-3-O-新橙皮糖苷 15． β-谷甾醇
2． quercetin 3． kaempferol-3-O-rutinoside 15． β-sitosterol
图 2 样品和混合对照品的 HPLC色谱图
Fig. 2 HPLC chromatograms of samples and mixed refer-
ence substances
2. 5. 3 相似度评价 采用中药色谱指纹图谱相似
度评价系统 (2004 年 A 版) ，计算 17 批三叶青药
材氯仿活性部位 HPLC指纹图谱的相似度，以生成
的共有模式为对照，相似度在 0. 816 ～ 0. 985 之间，
表明各产地药材氯仿部位均有良好的相似性。
2. 5. 4 三叶青药材聚类分析 以不同产地三叶青
药材的 15 个共有峰峰面积为原始数据，SPSS19. 0
软件对药材进行系统聚类分析，采用组间平均数联
结，以夹角余弦为样品相似度的距离公式，聚类分
析结果见图 3。由图可知，三叶青药材被分为 5 大
类，Ⅰ类包括 S3、S11、S12、S15;Ⅱ类包括 S2、
S10;Ⅲ类包括 S4、S14;Ⅳ类包括 S5、S6、S7、
S13、S9、S8、S16、S17;Ⅴ类包括 S1。以各共有
峰为变量，得到指纹图谱得分图，可见 5 类样品紧
密地聚集在一起，而且各自分散在不同区域 (图
4) ，使不同产地三叶青药材之间得到了一定区分。
同时，通过聚类分析发现，各产地三叶青药材之间
的相关性与相似度分析结果较为一致。
2. 5. 5 三叶青药材共有峰主成分分析 主成分分
析法是一种应用广泛的多元统计方法，用于简化数
据，快速实现模式或关系的可视化识别［17］。SPSS
19. 0 软件对原始数据进行标准化处理，以主成分
的特征值及贡献率为依据，对 17 个不同产地三叶
青药材的 15 个共有峰 (变量)进行主成分分析，
结果见表 3。
906
2016 年 3 月
第 38 卷 第 3 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
March 2016
Vol． 38 No． 3
表 2 共有峰的相对峰面积
Tab. 2 Relative peak areas of common peaks
峰号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
tR /min 17. 93 21. 26 23. 33 25. 14 31. 90 38. 23 40. 25 41. 39 41. 91 42. 99 46. 67 46. 99 51. 75 55. 70 72. 19
S1 0. 911 0. 511 0. 422 1. 000 6. 575 0. 418 0. 632 1. 055 3. 144 0. 208 1. 325 0. 734 1. 123 0. 194 0. 323
S2 1. 496 0. 684 0. 695 1. 000 0. 961 0. 774 0. 612 0. 662 1. 883 0. 982 0. 070 1. 059 1. 320 0. 209 0. 203
S3 1. 327 1. 049 1. 006 1. 000 1. 779 0. 320 0. 008 0. 486 6. 464 0. 277 0. 053 1. 006 1. 881 0. 015 0. 495
S4 0. 122 0. 010 0. 061 1. 000 0. 124 0. 030 0. 059 0. 032 0. 573 0. 004 0. 032 0. 040 0. 087 0. 019 0. 022
S5 0. 966 0. 125 0. 142 1. 000 0. 561 0. 210 0. 033 0. 243 4. 046 0. 007 0. 043 0. 722 1. 182 0. 006 1. 232
S6 1. 581 0. 276 0. 134 1. 000 0. 635 0. 475 0. 033 0. 236 4. 248 0. 020 0. 052 0. 619 1. 053 0. 017 0. 197
S7 4. 693 0. 409 0. 854 1. 000 2. 495 0. 741 0. 482 0. 782 12. 002 0. 059 1. 029 1. 309 1. 614 0. 194 0. 639
S8 10. 688 3. 081 1. 610 1. 000 3. 299 0. 374 0. 257 0. 386 6. 917 0. 099 0. 511 0. 672 0. 709 0. 126 0. 267
S9 0. 452 0. 032 0. 176 1. 000 0. 798 0. 141 0. 178 0. 129 1. 817 0. 122 0. 166 0. 179 0. 193 0. 046 0. 129
S10 1. 752 0. 464 0. 887 1. 000 1. 953 1. 939 0. 503 0. 450 6. 718 0. 692 0. 057 2. 768 3. 319 0. 091 0. 255
S11 4. 303 1. 212 0. 963 1. 000 0. 102 0. 076 0. 068 0. 189 2. 533 0. 015 0. 035 0. 132 0. 225 0. 014 0. 682
S12 0. 851 1. 889 2. 745 1. 000 2. 801 0. 635 0. 126 0. 863 12. 772 0. 049 0. 342 0. 844 1. 234 0. 029 0. 750
S13 1. 949 0. 021 1. 290 1. 000 0. 655 0. 196 0. 057 0. 216 2. 846 0. 083 0. 130 0. 188 0. 415 0. 018 0. 512
S14 0. 080 0. 010 0. 028 1. 000 0. 003 0. 033 0. 022 0. 042 0. 438 0. 040 0. 031 0. 056 0. 065 0. 008 0. 438
S15 1. 255 0. 584 0. 806 1. 000 1. 117 0. 288 0. 206 0. 183 2. 325 0. 453 0. 018 0. 532 0. 493 0. 015 0. 916
S16 1. 268 1. 050 1. 113 1. 000 3. 141 0. 523 0. 372 0. 194 4. 933 0. 682 0. 139 2. 116 2. 144 0. 164 0. 744
S17 0. 867 0. 437 0. 249 1. 000 0. 823 0. 340 0. 263 0. 307 5. 487 0. 028 0. 062 1. 114 1. 495 0. 147 0. 127
平均值 2. 033 0. 697 0. 775 1. 000 1. 637 0. 442 0. 230 0. 380 4. 656 0. 225 0. 241 0. 829 1. 091 0. 077 0. 467
RSD /% 125. 72 114. 70 89. 56 0. 00 101. 51 101. 47 93. 33 78. 66 75. 85 132. 39 157. 06 88. 10 78. 67 99. 91 69. 87
图 3 聚类分析树状图
Fig. 3 Dendrogram of cluster analysis
图 4 HPLC指纹图谱得分图
Fig. 4 Score plots of HPLC fingerprint
表 3 特征值表
Tab. 3 Table of characteristic values
主成分 特征值 贡献率 /% 累积贡献率 /%
A1 5. 897 39. 311 39. 311
A2 3. 321 22. 138 61. 449
A3 2. 009 13. 394 74. 843
A4 1. 581 10. 537 85. 380
A5 0. 794 5. 293 90. 673
A6 0. 609 4. 058 94. 731
A7 0. 331 2. 205 96. 936
A8 0. 182 1. 214 98. 150
A9 0. 130 0. 864 99. 014
A10 0. 077 0. 516 99. 530
A11 0. 029 0. 196 99. 726
A12 0. 027 0. 183 99. 909
A13 0. 007 0. 046 99. 955
A14 0. 006 0. 040 99. 995
A15 0. 001 0. 005 100. 000
由表可知，主成分个数的提取原则为其对应的
特征值大于 1，故取前 4 个 (A1 ～ A4)作为主成
分，其累计贡献率达到 85. 38%。其中，第一主成
分特征值为 5. 897，贡献率为 39. 311%;第二主成
分特征值为 3. 321，贡献率为 22. 138%;第三主成
分特征值为 2. 009，贡献率为 13. 394%;第四主成
分特征值为 1. 581，贡献率为 10. 537%。
旋转后的公共因子载荷矩阵见表 4，可知每个
载荷量表示主成分与对应变量的相关系数。4 个主
成分与 15 个共有峰指标的线性组合模型如下，计
算综合得分。
016
2016 年 3 月
第 38 卷 第 3 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
March 2016
Vol． 38 No． 3
表 4 旋转后的公共因子载荷矩阵表
Tab. 4 Load matrixes of postrotational common factors
峰号
成分值
1 2 3 4
p1 － 0. 049 0. 843 － 0. 012 0. 170
p10 0. 911 0. 127 0. 053 0. 214
p11 － 0. 094 － 0. 124 0. 964 0. 002
p12 0. 934 0. 054 － 0. 092 － 0. 250
p13 0. 891 0. 060 － 0. 076 － 0. 327
p14 0. 791 － 0. 077 0. 384 0. 292
p15 － 0. 067 0. 583 － 0. 134 0. 528
p2 0. 120 0. 943 0. 076 0. 030
p3 0. 175 0. 920 0. 011 0. 031
p4 0. 015 0. 032 － 0. 111 0. 829
p5 0. 250 0. 022 0. 874 － 0. 210
p6 0. 940 0. 070 － 0. 045 － 0. 143
p7 0. 851 0. 037 0. 373 0. 314
p8 0. 720 0. 308 0. 546 0. 028
p9 0. 113 0. 720 － 0. 125 － 0. 404
A1 = － 0． 019 8P1 － 0． 011 5P2 － 0． 004P3 +
0. 010 3P4 － 0． 031P5 + 0． 080 7P6 + 0． 061 0P7 +
0. 035 8P8 － 0． 002 9P9 + 0． 075 8P10 － 0． 041 6P11 +
0. 081 5P12 + 0． 185 0P13 + 0． 057 7P14 － 0. 009 1P15
A2 = 0． 137 7P1 － 0． 007 7P2 + 0． 148 2P3 －
0. 016 5P4 + 0． 015 4P5 － 0． 011 0P6 － 0． 018 7P7 +
0. 040 1P8 + 0． 124 6P9 － 0． 007 7P10 － 0． 003 3P11 －
0. 011 5P12 － 0． 007 1P13 － 0． 035 1P14 + 0. 084 5P15
A3 = 0． 014 8P1 + 0． 036 0P2 + 0． 010 6P3 －
0. 043 7P4 + 0． 273 0P5 － 0． 072 0P6 + 0． 065 6P7 +
0. 139 0P8 + － 0． 030 3P9 － 0． 040 2P10 + 0． 319 6P11 －
0． 086 8P12 － 0． 077 6P13 + 0． 071 3P14 － 0. 032 5P15
A4 = 0． 054 1P1 － 0． 016 7P2 － 0． 014 3P3 +
0. 410 4P4 － 0． 109 8P5 － 0． 060 4P6 + 0． 161 4P7 +
0. 007 2P8 － 0． 222 7P9 + 0． 112 9P10 － 0． 005 6P11 －
0. 112 1P12 － 0． 151 9P13 + 0． 153 5P14 + 0. 241 8P15
以第一、第二主成分为变量，得到二维投影
图，见图 5。以 X轴为例，在投影图中选取距离原
点较远的几个点，得到第一主成分中变量的权重
值，权重值越大，该化合物在三叶青药材中的作用
越大。其中，前 5 名变量的权重值分别为 0. 940、
0. 934、0. 911、0. 891、0. 851，对应 6、12、10、
13 和 7 号峰。从对照品色谱图可知，此 5 个峰为
未知成分，需要进一步的分析确认。
3 讨论与分析
3. 1 实验条件的优化 本实验考察了超声提取、
冷浸提取、加热回流以及超声加热回流 4 种提取方
式，同时比较了 60%、80%和 95%乙醇的提取溶
图 5 HPLC指纹图谱的二维投影图
Fig. 5 2D projection map of HPLC fingerprint
剂，发现以 95%乙醇为提取溶剂，超声加热回流
提取的效果最佳。再对甲醇-水、甲醇-0. 1%磷酸
水、乙腈-水和乙腈-0. 1%磷酸水溶液 4 组流动相
系统进行筛选，发现乙腈-0. 1%水溶液的梯度洗脱
效果最佳，得到的色谱峰最多，峰型和分离度较
好，基线平稳。在氯仿萃取之前，先用 100 mL 石
油醚萃取 1 次，可有效去除三叶青醇提物中色素的
干扰。同时，为尽可能多得到可供分析的色谱峰，
应用紫外光谱对样品进行 190 ～ 400 nm的全波长扫
描，发现 200 ～ 230 nm 波段处有较大吸收，结合
DAD检测器，对 200、210、218、230 nm 的波长
进行考察，发现在 210 nm 处色谱峰信息较多，基
线较平稳，色谱峰响应值相当。因此，选择检测波
长为 210 nm。
3. 2 指纹图谱结果差异分析 建立全面、系统、
特征性的指纹图谱，是三叶青质量评价的有效办
法。通过建立 17 个不同产地三叶青氯仿部位
HPLC指纹图谱，确定 15 个共有峰，以共有模式
为对照，相似度在 0. 816 ～ 0. 985 之间，表现出良
好的相似性，各色谱峰相对保留时间基本一致，符
合指纹图谱要求，所含化学成分基本相同。但由表
2 可知，各成分的色谱峰有较大差异，说明有效成
分含有量差别较大，各产地三叶青药材因品种资
源、生态环境、生长年限、地域性等条件，均可能
影响药材的品质，这为该药材的质量控制提供了
参考。
3. 3 聚类分析和主成分结果分析 由于相似度计
算无法准确鉴定三叶青药材的产地来源，同时考虑
各共有峰之间的差异，本实验再通过聚类分析和主
成分进行统计学分析。其中，聚类分析能将不同基
源的三叶青药材进行分类鉴定，结果分为 5 大类，
116
2016 年 3 月
第 38 卷 第 3 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
March 2016
Vol． 38 No． 3
如宁波鄞州、丽水莲都、遂昌和庆元产地的三叶青
药材聚在一起，说明这 4 个产地三叶青的品种、生
长环境、生长年限相当，同时其指纹图谱相似度接
近。而且，它与相似度分析结果较为一致，得到了
相互验证。
利用主成分分析，得到了 4 个主成分，累计方
差贡献率为 85. 38%，说明这 4 个主成分可表达全
部三叶青药材化学成分的 85. 38%，只有 14. 62%
的信息丢失。其中，第一主成分方差贡献率最大，
为 39. 31%，是三叶青药材最重要的成分群，它所
包含的化学成分基本反映出各产地三叶青药材化学
成分之间的相似性。另外，由于药材受生长环境、
种质资源、经纬度等各因素的影响，其质量存在较
大的差异，反映在色谱图上，就是在同一保留时间
处有不同的峰面积。主成分分析能筛选出共有的特
征成分，并指导发现决定性作用的化学成分，但本
实验筛选出的特征成分未知，故需要结合质谱等手
段作进一步确定。综上所述，运用聚类分析和主成
分分析，可实现快速分析，发挥各自优势，互相验
证和补充，多角度综合评判三叶青药材的质量。
4 结论
有关三叶青药材的指纹图谱研究较少，本实验
建立了不同产地三叶青药材氯仿活性部位的 HPLC
指纹图谱，并对其化学模式进行识别。结果，样品
的出峰数目、分离度均较理想，并标定出 15 个共
有峰，对其中 3 个峰进行了确认，通过相似度计
算、聚类分析和主成分分析，对药材进行综合评
价，得到较理想的结果。同时，进行了 HPLC 方法
学考察，发现精密度、稳定性、重复性都符合指纹
图谱的要求，为三叶青药材的质量控制提供了更全
面的参考。今后，本课题组将通过谱效学实验，进
一步寻找三叶青药材 “化学谱-药效”之间的对应
关系，确定其质量控制的关键成分，构建三叶青抗
肿瘤谱-效关系方程及生物活性指纹图谱。
参考文献:
［1］ 陈丽芸，郭素华． 三叶青的化学成分及药理作用研究进展
［J］． 浙江中医药大学学报，2012，36(12) :1368-1370．
［2］ 杨雄志，巫 军． 三叶青提取物对抗乙肝病毒活性的研究
［J］． 南京中医药大学学报，2009，25(4) :294-296．
［3］ 王小莉，曾 娟，周 辉． 三叶青提取物对肺癌细胞株
A549 的影响［J］． 肿瘤药学，2012，2(5) :347-350．
［4］ Xu C J，Ding G Q，Fu J Y，et al． Immunoregulatory effects of
ethyl-acetate fraction of extracts from Tetrastigma hemsleyanum
Diels et． Gilg on immune functions of ICR mice［J］． Biomed
Environ Sci，2008，21(4) :325-331．
［5］ 彭 昕，汪荣斌，何军邀，等． 三叶青颗粒愈伤组织悬浮
培养系的建立及培养条件的优化［J］． 中成药，2012，34
(5) :961-965．
［6］ 李瑛琦，陆文超，于治国． 三叶青的化学成分研究［J］．
中草药，2003，34(11) :982-983．
［7］ 彭 昕，吉庆勇，张煜炯，等． 濒临药用植物三叶青 ISSR
分子标记的建立［J］． 中成药，2015，37(7) :1507-1513．
［8］ 丁 丽，纪其雄，吕雯婷，等． 三叶青水提物体内、体外
抗肿 瘤 作 用 的 研 究［J］． 中 成 药， 2013， 35 (5) :
1076-1078．
［9］ Peng X，Zhuang D D，Guo Q S． Induction of S phase arrest
and apoptosis by ethyl acetate extract from Tetrastigma hemsleya-
nu in human hepatoma HepG2 cells［J］． Tumor Biol，2015，
36(4) :2541-2540．
［10］ 范世明，许 文，林 婧，等． 不同产地三叶青中总黄酮
含量的比较［J］． 福建中医药大学学报，2013，23(3) :
44-45．
［11］ 许 文，傅志勤，林 婧，等． UPLC-MS /MS 法同时测定
三叶青中 10 种黄酮类成分［J］． 药学学报，2014，49
(12) :1711-1717．
［12］ 许 文，傅志勤，林 婧，等． HPLC-Q-TOF-MS 和 UPLC-
QqQ-MS的三叶青主要成分定性与定量研究［J］． 中国中药
杂志，2014，39(22) :4465-4371．
［13］ 刘潇潇，周颍仪，杨立伟，等． 清开灵系列制剂的氨基酸
色谱指纹图谱［J］． 中成药，2014，36(12) :2537-2542．
［14］ 程 林，胡轶娟，浦锦宝，等． 三叶青的高效液相色谱指
纹图谱研究［J］． 浙江中医杂志，2013，48(4) :296-298．
［15］ 吴伟建，王 燕，王 斌，等． 基于聚类、主成分和判别
分析的海龙红外指纹图谱研究［J］． 中国药学杂志，2013，
48(18) :1540-1545．
［16］ 杨素德，王 伟，李家春，等． 苁蓉总苷胶囊 HPLC 指纹
图谱 研 究［J］． 中 国 中 药 杂 志， 2014， 39 (20) :
3955-3957．
［17］ 李效贤，熊耀康，余陈欢，等． 高效液相色谱指纹图谱法
分析南方红豆杉药材的氯仿提取物［J］． 色谱，2010，28
(11) :1067-1070．
216
2016 年 3 月
第 38 卷 第 3 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
March 2016
Vol． 38 No． 3