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外源NO对花楸树胚胎萌发和幼苗发育初期活性氧积累的影响



全 文 :第 49 卷 第 6 期
2 0 1 3 年 6 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 49,No. 6
Jun.,2 0 1 3
doi:10.11707 / j.1001-7488.20130609
收稿日期:2012 - 08 - 14;修回日期:2013 - 01 - 23。
基金项目:黑龙江省教育厅科学技术指导项目(11553034) ;中央高校基本科研业务费专项资金(DL10BA04)。
* 沈海龙为通讯作者。
外源 NO对花楸树胚胎萌发和幼苗发育初期
活性氧积累的影响*
杨 玲 王佳男 边 磊 沈海龙
(东北林业大学林学院 林木遗传育种国家重点实验室 哈尔滨 150040)
摘 要: 以花楸树成熟合子胚胎为材料,利用室内培养皿发芽法研究外源 NO 供体(SNP)、NO 合成抑制剂
(PTIO)、脱落酸(ABA)以及乙烯受体抑制剂(NBD)对花楸树胚胎萌发和幼苗发育初期活性氧(ROS)积累的影响。
结果表明:光照条件下 SNP预处理可减弱 PTIO或 ABA对胚胎萌发的抑制作用,但不能减弱 NBD处理对胚胎萌发
的抑制作用。SNP预处理显著增加幼苗叶片中叶绿素含量,但这种增加效应不能被 PTIO解除。PTIO抑制 SNP预
处理引起的幼苗叶片中过氧化氢(H2O2)含量和超氧阴离子含量的增加。SNP 预处理解除 PTIO 对根部超氧阴离
子含量的抑制作用。研究结果为阐明胚胎萌发过程中反应氮调节的(NO 依赖型)休眠解除和 ROS 积累的关系奠
定基础。
关键词: 花楸树;胚胎萌发;一氧化氮;脱落酸;乙烯
中图分类号:S718. 43 文献标识码:A 文章编号:1001 - 7488(2013)06 - 0060 - 08
Effects of Exogenous Nitric Oxide on Embryo Germination and ROS Accumulation
in Seedling Growth Initial Stage of Sorbus pohuashanensis
Yang Ling Wang Jianan Bian Lei Shen Hailong
(School of Forestry,Northeast Forestry University State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding Harbin 150040)
Abstract: In this paper,mature zygotic embryo of Sorbus pohuashanensis were used to study effects of an exogenous
nitric oxide donor (sodium nitroprusside,SNP) ,NO scavenger 2-phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide
(PTIO) ,abscisic acid (ABA)and 2,5-norbornadiene (NBD)—an inhibitor of the ethylene receptor on the embryo
germination and reactive oxygen species (ROS)accumulation at early stage of the seedling development by the petri dish
germination method indoors. The results showed that the inhibitory effect of PTIO or ABA on the embryo germination was
relieved by the SNP pretreatment under light. However,the SNP pretreatment did not influence the inhibitory action of
NBD to embryo germination. The SNP pretreatment increased the chlorophyll content in leaves of seedlings,which was not
removed by PTIO treatment. The contents of hydrogen peroxide (H2O2)and superoxide anion in seedling leaves were
increased by SNP pretreatment,which was cancelled by PTIO treatment. The PTIO treatment reduced the superoxide
anion content in seedling roots,which was removed by SNP pretreatment. The results would lay the foundation for
interpreting the relationships between reactive nitrogen species (RNS)mediated (NO-dependent)dormancy removal and
ROS (H2O2 and superoxide anion)accumulation in the embryo germination.
Key words: Sorbus pohuashanensis;embryo germination;nitric oxide;abscisic acid;ethylene
花楸树(Sorbus pohuashanensis) ,又名百花花楸、
臭山槐、山槐树、臭檀木、绒花树等,为蔷薇科
(Rosaceae)苹果亚科(Maloideae)花楸属(Sorbus)落
叶小乔木 (Yang et al.,2011;2012)。花楸树具有
较强的耐性,可在冷(云)杉林中弱光下的腐殖土中
萌发,同时它具有很高的观赏价值和木材使用价值。
花楸树春季满树银花,夏季羽叶秀丽,秋冬季红果满
枝,冬季果实可宿存(Yang et al.,2011)。在一些含
有长寿命树种的稠密树林中,花楸树的遗传多样性
可能受到威胁。花楸树为生长在小分裂群体中的伴
第 6 期 杨 玲等:外源 NO对花楸树胚胎萌发和幼苗发育初期活性氧积累的影响
生树种,对高强度的种间竞争比较敏感。该树种的
更新能力较弱,最终可能局部消失(郑健等,2007;
许建伟等,2010)。因此,需要采取有效措施以保存
花楸树的种质资源。
目前关于花楸树繁殖研究的报道以有性繁殖为
主,组织培养(杨玲等,2010;Yang 等,2012)、扦插
(苏喜廷等,2005)、嫁接(刘玮等,2006)方面的研
究较少。生产实践中多以播种育苗的方式繁殖花楸
树苗木。花楸树种子的深休眠特性增加了其播种育
苗的难度(沈海龙等,2006;杨玲等,2008a)。花楸
树种子经过 2 ~ 5 ℃低温层积 105 天(低温密封贮藏
的种子)至 120 天(新采收成熟种子)才能萌发(杨
玲等,2008a)。在 2 ~ 5 ℃低温层积过程中,花楸树
种皮内 ABA含量显著降低,种皮和胚胎内各种生长
促进物质的相对含量显著增加(杨玲等,2008b)。
将花楸树种子用 200 mg·L -1 6-BA溶液浸泡 2 天后
在 25 ℃和 5 ℃变温条件下萌发,可缩短种子萌发起
始时间,提高种子发芽率和发芽势(杨玲等,2009)。
关于 NO调节种子休眠打破和萌发的研究已有
报道 (Bethke et al., 2004; Giba et al., 2007;
Gniazdowska et al.,2007)。人们认为 NO 可能是由
亚硝酸盐和硝酸盐分解产生的(Renata et al.,
2006)。已有报道证明外源含氮化合物处理可以代
替植物生长调节剂促进种子萌发和幼苗生长。如大
麦(Hordeum vulgare)谷粒、拟南芥 (Arabidopsis
thaliana)种子和一些树木种子经过外源含氮化合物
处理后,种子生活力和萌发率均可得到提高(Beligni
et al.,2000;Bethke et al.,2004;Gniazdowska et al.,
2010)。更多关于 NO功能的研究来自 NO供体、NO
抑制剂和特殊的抑制物的药理学研究。最常用到的
NO供体是硝普钠(SNP)。SNP 可以促进许多植物
种子萌发(Gniazdowska et al.,2010)。SNP 对光下
吸胀的种子萌发的促进效应可以被 NO 抑制剂
(PTIO 或 cPTIO)解除 (Bethke et al., 2004)。
Gniazdowska等(2007)认为 NO 打破休眠与乙烯合
成的增强相关,即 NO 作为一种调控因子通过调节
乙烯生物合成解除苹果(Malus domestica)胚休眠。
进一步的研究表明:NO 和氢氰酸(HCN)对休眠的
苹果胚萌发的促进效应与胚中和萌发各个阶段中
H2O2 和超氧阴离子含量的增加相关(Gniazdowska
et al.,2010)。推测活性氧和 NO在种子萌发中与传
统的 植 物 激 素 一 起 作 为 第 二 信 使 起 作 用
(Gniazdowska et al.,2010)。
本文以我国东北地区野生花楸树成熟合子胚胎
为材料,利用室内培养皿发芽法研究外源 NO 供体
(SNP)、NO合成抑制剂(PTIO)、脱落酸(ABA)以及
乙烯受体抑制剂(NBD)对花楸树胚胎萌发和幼苗
发育初期活性氧(ROS)积累的影响。研究结果为了
解 NO在花楸树种子休眠解除和幼苗初期发育过程
中的调控作用及其与植物内源激素的关系奠定基
础,为生产中改进花楸树播种育苗方法、提高苗木产
量提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 材料来源
试验材料于 2011 年 9 月下旬采自黑龙江省山
河屯林业局凤凰山林场,选取 1 株生长良好的野生
成年母树采集成熟果实,采回后调制出种子。种子
调制方法同沈海龙等(2006)。
1. 2 方法
1. 2. 1 种子前期处理 试验前选取籽粒饱满、质地
均匀的休眠种子(平均千粒质量为 1. 95 g,平均含水
量为 8. 39%,平均生活力为 99. 0%) ,在 20 ℃ ± 5
℃下的蒸馏水中吸胀 48 h。将吸胀后的种子用
0. 2%(V /V)NaClO溶液搅拌浸泡 10 ~ 15 min 后用
清水冲洗干净。在冰上剥除种皮,用裸胚进行试验。
1. 2. 2 NO对胚萌发的效应试验 1)SNP 预处理
试验 参照 Gniazdowska 等(2010)的方法。在 500
mL烧杯中放置一张用 5 mL 0. 05 mol·L -1 Hepes-
KOH(pH值 7. 0)充分浸湿的滤纸,上面放 90 个剥
离的胚胎。然后在同一烧杯里面再放置一个内含 5
mL 5 mmol·L -1 SNP 溶液(现用现配)的小烧杯,最
后用保鲜膜将 500 mL 烧杯的口封好。气态 NO 可
以直接从 SNP 溶液中释放出来。胚胎暴露在 25
℃、光下(光照强度为 60 μmol·m -2s - 1)SNP溶液的
蒸汽中 3 h。处理后,用蒸馏水冲洗胚胎并放置在被
蒸馏水浸湿的滤纸上。对照为不经过 SNP 预处理
的裸胚。对照和预处理的胚胎在直径 9 cm 的培养
皿中(每皿 30 个胚)在培养室内的光照条件下萌
发。萌发培养条件同前述预处理过程。对照和处理
均设置 3 个重复。
2)SNP 与 PTIO 组合处理试验 胚胎在 5
mmol·L -1 SNP溶液的蒸汽中处理(预处理过程同
上)3 h后,在被 3 mL 300 μmol·L -1 PTIO溶液浸湿
的滤纸上吸胀。对照胚胎为不经过 SNP 预处理,直
接在含有 3 mL 300 μmol·L -1 PTIO溶液的滤纸上吸
胀。萌发培养条件同上。对照和处理均设置 3 个
重复。
3)SNP 与 ABA 组合处理试验 胚胎在 5
mmol·L -1 SNP溶液的蒸汽中处理(预处理过程同
16
林 业 科 学 49 卷
上)3 h 后,在含有 3 mL 不同浓度 ABA(0. 1,0. 3,
1. 0,3. 0 μmol·L -1)溶液浸湿的滤纸上吸胀。对照
胚胎为不经过 SNP预处理,直接在含有上述不同浓
度 ABA溶液的滤纸上吸胀。萌发培养条件同上。
对照和处理均设置 3 个重复。
4)SNP 与 NBD 组合处理试验 胚胎在 5
mmol·L -1 SNP溶液的蒸汽中处理(预处理过程同
上)3 h后,在含有 3 mL 1 mmol·L -1 NBD 溶液浸湿
的滤纸上吸胀。对照胚胎为不经过 SNP 预处理,直
接在含有 3 mL 1 mmol·L -1 NBD 溶液的滤纸上吸
胀。萌发培养条件同上。对照和处理均设置 3 个
重复。
5)观察和试验记录 每天观察并记录。以 2
片子叶均变绿、胚轴和胚根均伸长为种子正常萌发
的标志。统计不同处理后的胚胎萌发起始时间;萌
发试验第 1,2,3,4,5,6,7,8 天…,直到萌发结束时
的每天的发芽率和各处理的最终发芽率。
1. 2. 3 幼苗活性氧(ROS)积累的检测 试验 1:
胚胎在 5 mmol·L - 1 SNP 溶液的蒸汽中处理(预处
理过程同上)3,27,51,75 h 后,在含有 3 mL 蒸馏
水的滤纸上吸胀。对照胚胎为不经过 SNP 预处
理,直接在含有 3 mL蒸馏水的滤纸上吸胀。萌发
培养方法和条件同上。对照和处理均设置 3 个
重复。
试验 2:胚胎在 5 mmol·L -1 SNP溶液的蒸汽中
处理(预处理过程同上)3 h 后,在含有 3 mL 300
μmol·L -1 PTIO 溶液浸湿的滤纸上吸胀。对照胚胎
为不经过 SNP预处理,直接在含有 3 mL 300 μmol·
L -1 PTIO溶液的滤纸上吸胀。萌发培养方法和条
件同上。对照和处理均设置 3 个重复。
分别在试验 1 和试验 2 的第 8 天时取萌发形成
的幼苗进行生理分析。将发芽测定结束后各处理胚
胎萌发形成的叶片与初生根分别剪开,分成上部叶
片(不接触发芽床的子叶萌发形成的叶片)、下部叶
片(接触发芽床的子叶萌发形成的叶片)和根(初生
根)3 部份。然后各部分等量分成 3 份并称量,用于
下列指标的测定。
1)叶绿素含量的测定 将约 0. 05 g 的叶片用
2∶ 1体积比的丙酮乙醇混合液在 25 ℃下暗中浸提 8
h,然后用 3 层滤纸过滤,测 652 nm 下滤液的吸光
值。结果用每 g 鲜质量材料在 652 nm 下的吸光度
值表示。用 U 表示一个 OD 值,叶绿素含量以
U·g -1mL -1作单位。
2)H2O2 含量的测定 称取约 0. 05 g的叶片用
2 mL 0. 1% (W/V)冷 TCA在冰上匀浆。浸提液在
4 ℃下15 000 g离心 15 min。取上清液 0. 5 mL,加
入 0. 5 mL 10 mmol·L -1磷酸钾缓冲液(pH值 7. 0) ,
在 390 nm下测定吸收值。H2O2 含量用每 g 鲜质量
材料在 390 nm下的吸光度值表示。用 U 表示一个
OD值,H2O2 含量以 U·g
-1mL -1作单位。
3)超氧阴离子的含量 提取材料分别为胚胎
萌发后形成的上部叶片、下部叶片和初生根。提取
方法同上。将 1. 5 mL上清液在 1 mL 1 mmol·L -1盐
酸羟胺(配制在 50 mmol·L -1磷酸钾缓冲液中,pH
值 7. 8)溶液中、25 ℃暗中孵化 30 min。取混合液
0. 5 mL,连同 0. 5 mL 17 mmol·L -1磺胺,0. 5 mL 7
mmol·L -1甲萘胺溶液一起在 25 ℃暗中孵化 30
min。将混合液在14 000 g离心 10 min后,在 540 nm
下测定吸光值。用 NaNO2 溶液制作标准曲线。利
用标准曲线方程,将 OD 值转换成 NO2
-1浓度,用 U
表示一个 NO2
-1值,超氧阴离子含量以 U·g -1mL -1
为单位。
1. 2. 4 数据处理和分析 采用 Excel 2003 软件进
行数据处理和绘图,采用 DPS(唐启义等,2002)数
据处理系统进行方差分析、Duncan 多重比较和相关
性分析。百分数在统计分析前进行反正弦转换。图
表中数据均为 3 次重复平均值,“ ±”之后为标
准差。
2 结果与分析
2. 1 NO对胚胎萌发的影响
2. 1. 1 SNP和 PTIO对胚胎萌发的影响 SNP预处
理对花楸树胚胎萌发的影响如图 1 所示,各处理对
胚胎萌发影响的差异达到显著水平(P < 0. 05)。萌
发培养的第 1 天和第 2 天为子叶张开、子叶扩展和
子叶变绿的过程。从第 3 天开始,部分胚胎的胚轴
开始伸长。随着萌发培养时间延长,正常萌发的胚
胎比例增加。培养第 8 天时,SNP + PTIO 处理的胚
胎萌发率最高为 86. 67%(与对照的萌发率 70. 09%
差异不显著) ,其次是 PTIO 处理 (萌发率为
75. 17%,与对照差异不显著)。而 SNP + H2O 处理
的胚胎萌发率最低(为 56. 67%,与对照差异不显
著)。从图 1 可知,SNP + PTIO 组合处理的胚胎萌
发速度较快,在培养的第 3 天胚胎萌发率即可达到
51. 11%(约达到最终萌发率的 60%) ,而其他处理
的胚胎萌发速度与对照基本一致。SNP + PTIO 组
合处理的胚胎最终萌发率分别高于 SNP 或 PTIO 单
独处理的萌发率。说明 NO的短期预处理可以影响
花楸树的胚胎萌发,过多的外源 NO 抑制了胚胎的
萌发。SNP预处理可以逆转 NO 清除剂 PTIO 对胚
26
第 6 期 杨 玲等:外源 NO对花楸树胚胎萌发和幼苗发育初期活性氧积累的影响
胎萌发的抑制作用。
图 1 SNP预处理对花楸树胚胎萌发的影响
Fig. 1 Effects of SNP pretreatment on embryo germination
of S. pohuashanensis
Duncan多重比较结果如图所示,数据点上不同小写字母表示
种子萌发率在 0. 05 水平上差异显著. Means within a data point
of germination percantge followed by different lowercase letters are
significantly different from each other at P = 0. 05 level of
significance using the Duncans Multiple Range Test.
2. 1. 2 SNP和 ABA对胚胎萌发的影响 ABA处理
对花楸树胚胎萌发的影响见图 2。培养第 8 天时,
不同浓度 ABA处理对胚胎萌发的影响达到极显著
水平(P < 0. 01)。较高浓度的 ABA 处理抑制花楸
树的胚胎萌发。培养第 8 天时,3. 0 μmol·L -1 ABA
处理的胚胎萌发率最低(为 4. 00%,与对照差异极
显著,P < 0. 01) ,其次是 1. 0 μmol·L -1 ABA(为
34. 32%,与对照差异显著,P < 0. 05)。0. 1 μmol·
L -1 ABA和 0. 3 μmol·L -1 ABA 处理的胚胎萌发率
分别为 63. 47%和 86. 96%(二者与对照差异不显
著,P > 0. 05)。
SNP与不同浓度(0. 1,0. 3,1. 0,3. 0 μmol·L -1)
ABA组合处理对花楸树胚胎萌发的影响见图 3。胚
胎从第 3 天开始萌发。培养第 8 天时,与对照相比,
各处理对胚胎萌发的影响差异不显著(P > 0. 05)。
SNP +0. 1 μmol·L -1 ABA 处理的胚胎萌发率略高
于对照(70. 47%) ,SNP + 0. 3 μmol·L -1 ABA,
SNP +1. 0 μmol·L -1 ABA,SNP +3. 0 μmol·L -1 ABA
处理的胚胎萌发率略低于对照(分别为 58. 38%,
57. 89%和 46. 66%)。比较图 2 和图 3 可知,SNP
预处理削弱 ABA 对胚胎萌发的抑制作用。推测
SNP预处理可能减小胚胎对 ABA的敏感性,从而削
弱 ABA对胚胎萌发的抑制作用,并且 SNP 的作用
位点可能在 ABA作用位点的上游。
图 2 ABA处理对花楸树胚胎萌发的影响
Fig. 2 Effects of ABA treatment on embryo germination
of S. pohuashanensis
Duncan多重比较结果如图所示,数据点上不同大写字母表示
种子萌发率在 0. 01 水平上差异显著. Means within a data point
of germination percentage followed by different capitals are
significantly different from each other at P = 0. 01 level of
significance using the Duncans Multiple Range Test.
图 3 SNP和 ABA组合处理对花楸树胚胎萌发的影响
Fig. 3 Effects of treatment of SNP and ABA combination
on embryo germination of S. pohuashanensis
2. 1. 3 SNP和 NBD对胚胎萌发的影响 NBD,SNP
与 NBD组合处理对花楸树胚胎萌发的影响见图 4。
胚胎从第 3 天开始萌发。培养第 8 天时,与对照相
比,各处理对胚胎萌发影响的差异不显著(P >
0. 05)。NBD单独处理、SNP + NBD 处理的胚胎萌
发率均低于对照(分别为 45. 46%和 42. 18%)。由
图 4 可知,NBD 处理抑制花楸树胚胎萌发,SNP 预
处理不能削弱 NBD 对胚胎萌发的抑制作用。说明
花楸树胚胎休眠的解除与乙烯具有密切的相关性。
SNP与 NBD组合处理不能提高胚胎发芽率,推测是
由于 SNP 的作用位点处于 NBD 作用位点下游的
原因。
36
林 业 科 学 49 卷
图 4 SNP和 NBD组合处理对花楸树胚胎萌发的影响
Fig. 4 Effects of treatment of SNP and NBD combination
on embryo germination of S. pohuashanensis
2. 2 NO对活性氧(ROS)积累的影响
2. 2. 1 NO对叶绿素含量的影响 1)SNP 预处理
对叶绿素含量的影响 方差分析结果表明:SNP 预
处理对胚胎上下部叶片的叶绿素含量和总叶绿素含
量的影响均达到极显著水平(P < 0. 01)。多重比较
结果表明:不同 SNP处理时间对上下部叶片中叶绿
素含量和总叶绿素含量的影响均达到极显著水平
(P < 0. 01) (表 1)。相关分析结果表明:上下部叶
片中的叶绿素含量呈极显著的正相关关系(r =
0. 99) ,但与 SNP 处理时间的负相关关系不显著
(r = - 0. 26)。各处理中,上下部叶片中叶绿素含量
最多的均是 SNP 处理 3 h。与对照相比,SNP 处理
3 h的上部叶片中叶绿素含量增加 8. 88%,下部叶片
中的叶绿素含量增加 24. 51%。这些差异均达到极
显著水平(P < 0. 01)。说明 SNP 短时间(3 h)预处
理胚胎可以显著增加幼苗叶片中叶绿素含量。
表 1 SNP预处理对花楸树幼苗叶片中叶绿素含量的影响①
Tab. 1 Effects of SNP pretreatment on chlorophyll
contents of seedling leaves of S. pohuashanensis
时间
Time /h
叶绿素含量 Chlorophyll contents /(U·g - 1mL -1)
上部叶片
Upper leaf
下部叶片
Lower leaf
总含量
Total content
0(CK) 7. 77 ± 0. 00 B 6. 57 ± 0. 24 BC 14. 33 ± 0. 24 B
3 8. 46 ± 0. 05 A 8. 18 ± 0. 52 A 16. 62 ± 0. 60 A
27 1. 62 ± 0. 12 E 2. 29 ± 0. 02 D 3. 92 ± 0. 14 E
51 6. 30 ± 0. 03 C 6. 66 ± 0. 15 B 12. 96 ± 0. 12 C
75 4. 64 ± 0. 12 D 5. 50 ± 0. 17 C 10. 14 ± 0. 05 D
① 数据后面相同大写字母表示叶绿素含量在 0. 01 水平上差异
不显著。Means within the same column followed by the same capital are
not significantly different at P = 0. 01 (Duncans multiple range test).下
同。The same below.
2)SNP与 PTIO组合处理对叶绿素含量的影响
方差分析结果表明:SNP 与 PTIO 组合处理对胚胎
上、下部叶片的叶绿素含量和叶绿素总含量的影响
均达到极显著水平(P < 0. 01)。各种处理间的多重
比较结果见表 2。与 SNP 单独处理相比,SNP 与
PTIO组合处理对上部叶片中叶绿素含量影响不显
著(P > 0. 05) ,但极显著增加下部叶片中的叶绿素
含量和总叶绿素含量(与对照的差异也达到极显著
水平,P < 0. 01)。与 SNP + PTIO 组合处理相比,
PTIO单独处理的胚胎萌发后其上部叶片中的叶绿
素含量显著增加(21. 14%) (P < 0. 01) ,但下部叶片
中的叶绿素含量则显著减小(约减小 35. 01%)
(P < 0. 01) ,二者的总叶绿素含量差异不显著
(P > 0. 05)。说明 SNP预处理使幼苗叶片中总叶绿
素含量增加的效应不能被 NO清除剂 PTIO所削弱。
NO清除剂 PTIO 同样可以增加幼苗叶片中总叶绿
素含量。推测胚胎萌发形成幼苗后,叶片中叶绿素
含量与 NO含量相关不密切。
表 2 SNP与 PTIO组合处理对花楸树幼苗
叶片中叶绿素含量的影响
Tab. 2 Effects of treatment of SNP and PTIO
combination on chlorophyll contents of seedling
leaves of S. pohuashanensis
处理
Treatment
叶绿素含量 Chlorophyll contents /(U·g - 1mL -1)
上部叶片
Upper leaf
下部叶片
Lower leaf
总含量
Total content
CK(H2O) 7. 77 ± 0. 00 B 6. 57 ± 0. 24 B 14. 33 ± 0. 24 C
SNP + H2O 8. 46 ± 0. 05 B 8. 18 ± 0. 52 B 16. 64 ± 0. 57 BC
SNP + PTIO 8. 42 ± 0. 40 B 11. 31 ± 0. 02 A 19. 73 ± 0. 37 A
PTIO 10. 20 ± 0. 26 A 7. 35 ± 0. 54 B 17. 59 ± 0. 86 AB
2. 2. 2 NO对 H2O2 含量的影响 1)SNP预处理对
H2O2 含量的影响 方差分析结果表明:SNP 预处
理对胚胎上部叶片 H2O2 含量的影响不显著(P >
0. 05) ,对下部叶片细胞中的 H2O2 含量和总 H2O2
含量的影响均极显著(P < 0. 01)。多重比较结果见
表 3。相关分析结果表明:上、下部叶片中的 H2O2
含量不相关,二者与 SNP处理时间的正相关关系不
显著(r = 0. 48)。各处理中,SNP处理 75 h 的上、下
部叶片中 H2O2 含量均为最多。与对照相比,SNP
处理 75 h的上部叶片中 H2O2 含量增加 0. 45%,下
部叶片中的 H2O2 含量增加1 260. 75%。SNP 处理
75 h 的上下部叶片中差异达到极显著水平(P <
0. 01)。说明 SNP预处理可以显著引起幼苗叶片中
H2O2 含量增加。
2)SNP与 PTIO组合处理对 H2O2 含量的影响
方差分析结果表明:SNP 与 PTIO 组合处理对胚胎
上下部叶片的 H2O2 含量和总 H2O2 含量的影响差
异不显著(P > 0. 05) (表 4)。与 SNP 单独处理相
比,SNP 预处理后的 PTIO 处理减少上、下部叶片中
46
第 6 期 杨 玲等:外源 NO对花楸树胚胎萌发和幼苗发育初期活性氧积累的影响
表 3 SNP预处理对花楸树幼苗叶片中 H2O2 含量的影响
Tab. 3 Effects of SNP pretreatment on H2O2
contents of seedling leaves of S. pohuashanensis
时间
Time /h
H2O2 含量 H2O2 contents /(U·g - 1mL -1)
上部叶片
Upper leaf
下部叶片
Lower leaf
总含量
Total content
0(CK) 4. 45 ± 0. 59 1. 07 ± 0. 64 C 5. 52 ± 0. 04 C
3 4. 00 ± 0. 94 13. 58 ± 3. 03AB 17. 58 ± 2. 09 A
27 0. 63 ± 0. 23 5. 76 ± 0. 68 C 6. 39 ± 0. 91 BC
51 3. 52 ± 0. 12 7. 33 ± 0. 38 BC 10. 85 ± 0. 26 B
75 4. 47 ± 2. 59 14. 56 ± 1. 60 A 19. 04 ± 0. 98 A
表 4 SNP与 PTIO组合处理对花楸树
幼苗叶片中 H2O2 含量的影响
Tab. 4 Effects of treatment of SNP and PTIO
combination on H2O2 contents of seedling
leaves of S. pohuashanensis
处理
Treatment
H2O2 含量 H2O2 contents /(U·g - 1mL -1)
上部叶片
Upper leaf
下部叶片
Lower leaf
总含量
Total content
CK(H2O) 4. 45 ± 0. 59 1. 07 ± 0. 64 5. 52 ± 0. 04
SNP + H2O 4. 00 ± 0. 94 13. 58 ± 3. 03 17. 58 ± 2. 09
SNP + PTIO 1. 41 ± 0. 04 7. 97 ± 8. 95 9. 38 ± 8. 99
PTIO 1. 89 ± 1. 45 3. 83 ± 2. 85 5. 72 ± 1. 39
H2O2 含量,总 H2O2 含量相应减少。与 SNP + PTIO
组合处理相比,胚胎一直在 PTIO中吸胀的处理,使上
部叶片细胞中的 H2O2 含量增加 34. 04%,但显著减
小下部叶片中的 H2O2 含量(约 51. 94%) ,总 H2O2 含
量也被减小。说明 SNP 预处理引起的幼苗叶片中
H2O2 含量增加可以被 NO清除剂 PTIO所减少。
2. 2. 3 NO对超氧阴离子含量的影响 1)SNP 预
处理对超氧阴离子含量的影响 方差分析结果表
明:SNP预处理对胚胎上部叶片超氧阴离子含量的
影响不显著(P > 0. 05) ,下部叶片及根系中超氧阴
离子含量的影响均极显著(P < 0. 01) ,对总超氧阴
离子含量的影响极显著(P < 0. 01)。多重比较结果
见表 5。相关分析结果表明:上、下部叶片、上部叶
片与根系中超氧阴离子含量的正相关关系显著
(P > 0. 05) ,下部叶片与根系中超氧阴离子含量的
正相关关系极显著(r = 0. 94) ,根系中超氧阴离子含
量与 SNP 处理时间的负相关关系显著 (r =
- 0. 84) ,但上、下部叶片中超氧阴离子含量与 SNP
处理时间不相关。各处理中,SNP处理 3 h 的上、下
部叶片及根系中超氧阴离子含量均为最多。与对照
相比,SNP 处理 3 h 的上部叶片中超氧阴离子含量
增加 0. 41%,下部叶片中的超氧阴离子含量增加
19. 57%,根系中超氧阴离子含量减少 22. 26%。说
明 SNP短时间预处理可以增加幼苗下部叶片中超
氧阴离子含量,随着处理时间延长,则使幼苗各部分
构件中的超氧阴离子含量以及总超氧阴离子含量
减少。
表 5 SNP预处理对花楸树幼苗叶片和根中超氧阴离子含量的影响
Tab. 5 Effects of SNP pretreatment on superoxide anion contents of leaves and root of seedling of S. pohuashanensis
时间
Time /h
超氧阴离子含量 Superoxide anion contents /(NO2 -1·g - 1mL -1)
上部叶片 Upper leaf 下部叶片 Lower leaf 根部 Root 总含量 Total content
0(CK) 7. 27 ± 2. 95 10. 73 ± 1. 97 A 14. 15 ± 1. 69 A 32. 15 ± 3. 24 A
3 7. 30 ± 3. 10 12. 83 ± 2. 84 A 11. 00 ± 5. 84 AB 31. 12 ± 5. 58 A
27 1. 47 ± 0. 00 2. 46 ± 0. 21 B 1. 28 ± 0. 00 B 5. 12 ± 0. 34 B
51 0. 96 ± 0. 00 2. 50 ± 2. 15 B 1. 62 ± 0. 56 B 5. 40 ± 1. 34 B
75 5. 02 ± 0. 00 3. 76 ± 0. 52 B 1. 19 ± 0. 13 B 8. 03 ± 2. 09 B
数据后面相同大写字母表示超氧阴离子含量在 0. 01 水平上差异不显著。Means within the same column followed by the same capital are not
significantly different at P = 0. 01 (Duncans multiple range test).
2)SNP与 PTIO组合处理对超氧阴离子含量的
影响 方差分析结果表明:SNP 与 PTIO 组合处理
对胚胎上、下部叶片及根系的超氧阴离子含量以及
超氧阴离子总含量的影响均不显著(P > 0. 05) (表
6)。与 SNP 单独处理相比,SNP 预处理后的 PTIO
处理增加上部叶片及根系中超氧阴离子含量,但使
下部叶片中的超氧阴离子含量减少。与 SNP + PTIO
组合处理相比,胚胎一直在 PTIO 中吸胀的处理,使
上部叶片细胞中的超氧阴离子含量增加 4. 01%,下
部叶片中的超氧阴离子含量增加 21. 86%,使根系
中的超氧阴离子含量下降 34. 71%。说明 PTIO 处
理可抑制 SNP 预处理引起的下部叶片中超氧阴离
子含量增加。PTIO 对根部超氧阴离子含量的抑制
作用可以被 SNP预处理削弱。
3 结论与讨论
本研究结果表明,SNP 短时间预处理可以影响
花楸树胚胎萌发。NO清除剂(PTIO)具有抑制胚胎
的萌发作用,这种抑制效应可以被 SNP 预处理逆
转。研究结果支持 NO能够影响种子休眠解除的结
论。NO抑制剂的试验说明 NO 是一种种子休眠的
内源性调节阀。NO 能够促进许多植物种子的萌
发,特别是光敏感种子的萌发 (Giba et al.,2007)。
NO对植物种子萌发的作用具有浓度效应,低浓度
56
林 业 科 学 49 卷
表 6 SNP与 PTIO组合处理对花楸树幼苗叶片和根中超氧阴离子含量的影响
Tab. 6 Effects of treatment of SNP and PTIO combination on superoxide
anion contents of leaves and root of seedling of S. pohuashanensis
处理
Treatment
超氧阴离子含量 Superoxide anion contents /(NO2 -1·g - 1mL -1)
上部叶片 Upper leaf 下部叶片 Lower leaf 根 Root 总含量 Total content
CK(H2O) 7. 27 ± 2. 95 10. 73 ± 1. 97 14. 15 ± 1. 69 32. 16 ± 3. 24
SNP + H2O 7. 30 ± 3. 10 12. 83 ± 2. 84 11. 00 ± 5. 84 31. 12 ± 5. 58
SNP + PTIO 7. 73 ± 0. 00 9. 70 ± 1. 25 13. 34 ± 3. 26 30. 78 ± 2. 01
PTIO 8. 04 ± 2. 86 11. 82 ± 0. 08 8. 71 ± 4. 75 28. 57 ± 7. 53
的 NO 对种子萌发有促进作用,高浓度 NO 则抑制
种子萌发(Giba et al.,2007)。本研究中使用 5
mmol·L -1 SNP 预处理 3 h 的试验方法是参考
Gniazdowska等(2007)报道的用于苹果胚胎萌发研
究所使用的浓度。在培养第 8 天时统计胚胎萌发
率,结果发现 SNP + PTIO处理的花楸树胚胎萌发率
最高(86. 67%,高于对照) ,而 SNP + H2O 处理的胚
胎萌发率最低(56. 67%,低于对照)。说明 5 mmol·
L -1 SNP预处理 3 h 对于花楸树裸胚来说处理浓度
过高,因此当使用 PTIO 清除掉多余的 NO 后,胚胎
萌发率得到提高。这提示在今后进一步的研究中应
该适当降低 SNP处理浓度或是减少 SNP处理时间。
同时,本研究结果也间接证明了 NO 对植物种子萌
发具有浓度效应的结论。
较高的 ABA含量是维持花楸树种子休眠的重
要调控因子(杨玲等,2008b)。花楸树新采收并调
制干燥后的种子中含有较高的 ABA 含量,在 2 ~ 5
℃低温层积过程中花楸树种皮内 ABA 含量显著降
低(杨玲等,2008b)。本研究发现,较高浓度外源
ABA抑制花楸树胚胎萌发,SNP 预处理可以削弱
ABA对胚胎萌发的抑制作用。推测 SNP 预处理可
能减小胚胎对 ABA 的敏感性,从而削弱 ABA 对胚
胎萌发的抑制作用,并且 SNP 的作用位点可能在
ABA作用位点的上游。该研究结果提示可在苗木
培育中用 SNP 作为花楸树种子催芽处理的预处理
剂,以使种子提早萌发,提高苗木产量。
Gniazdowska等(2007)认为 NO 打破种子休眠
与乙烯的产生具有密切的相关性,乙烯合成抑制剂
AOA可以逆转 NO对胚胎萌发的促进效果。本研究
发现,乙烯受体抑制剂(NBD)可以抑制花楸树胚胎
萌发。说明花楸树胚胎休眠的解除与乙烯具有密切
的相关性。SNP 预处理不能削弱 NBD 对胚胎萌发
的抑制作用。推测是由于 SNP 的作用位点处于
NBD作用位点下游的原因。
Gniazdowska等(2010)认为 NO 和 HCN 对休眠
的苹果胚萌发的有益影响是与胚中和萌发的各个阶
段中 H2O2 和超氧阴离子含量增加相关。本文的研
究结果支持了这个结论。SNP 短时间(3 h)预处理
胚胎可以显著增加花楸树幼苗叶片中叶绿素含量。
这种增加效应不能被 PTIO削弱。PTIO同样可以增
加幼苗叶片中总叶绿素含量。推测胚胎萌发形成幼
苗后,叶片中叶绿素含量与 NO 含量相关不密切。
SNP预处理可以显著引起花楸树幼苗叶片中 H2O2
含量增加。这种增加效应可以被 PTIO 削弱。同样
的,SNP短时间(3 h)预处理可以增加花楸树幼苗下
部叶片中超氧阴离子含量,但随着处理时间延长,则
使幼苗各部分构件中的超氧阴离子含量以及总超氧
阴离子含量减少。PTIO 处理抑制 SNP 预处理引起
的下部叶片中超氧阴离子含量增加。PTIO 对根部
超氧阴离子含量的抑制作用可以被 SNP 预处理削
弱。说明 NO可以对花楸树胚胎中和萌发各个阶段
中的叶绿素合成、H2O2 和超氧阴离子的代谢起到一
定调节作用。SNP短时间预处理对花楸树胚胎萌发
的影响可能与胚胎中和萌发各个阶段中的 H2O2 和
超氧阴离子含量的增加存在密切的相关性。
本文的研究结果不仅揭示了 NO在花楸树胚胎
休眠解除和幼苗初期发育过程中的调控作用及其与
植物内源激素的关系,而且为生产中改进花楸树播
种育苗方法、提高苗木产量提供了理论依据。
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(责任编辑 郭广荣)
更 正
本刊 2013 年第 49 卷第 3 期“不同抚育模式对侧柏游憩林风景质量的影响”一文(作者:汪平,等) ,图 1
更正如下。
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