全 文 ：signaling by increasing the phosphorylation of TrkA fol-
lowing the increased phosphorylation of c-Ｒaf，EＲK1 /
2 and downstream effector CＲEB after MEM treatment．
Conclusion MEM treatment may activate the NGF /
TrkA signaling in APP /PS1 mice to reduce amyloidosis
and cognitive deficits．
Key words:memantine;NGF;TrkA;cognitive deficits;
Alzheimers disease;Aβ
网络出版时间:2016 － 3 － 18 11:22 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /34． 1086． Ｒ． 20160318． 1122． 016． html
三叶青黄酮抗肺癌作用研究
钟良瑞1，林 霜1，魏克民2
(1．浙江中医药大学附属省立同德医院，浙江 杭州 310012;2．浙江省中医药研究院，浙江 杭州 310007)
doi:10． 3969 / j． issn． 1001 － 1978． 2016． 04． 008
文献标志码:A 文章编号:1001 － 1978(2016)04 － 0480 － 04
中国图书分类号:Ｒ284． 1;Ｒ329． 24;Ｒ734． 202． 2;Ｒ979. 1;
Ｒ977. 6
摘要:目的 研究三叶青黄酮对肺癌 A549 细胞增殖抑制和
侵袭转移作用及其机制。方法 采用 MTT 法检测三叶青黄
酮对 A549 细胞增殖的抑制作用;集落形成试验检测三叶青
黄酮对 A549 细胞抗癌活性的影响;划痕试验检测三叶青黄
酮对细胞迁移力的影响;Transwell 实验检测三叶青黄酮对
A549 细胞侵袭力变化;Western blot 法检测 MMP-2、MMP-9、
TIMP-2 等侵袭转移相关蛋白表达水平。结果 三叶青黄酮
抑制 A549 细胞增殖程度与用药浓度、时间呈正相关;随着药
物浓度的增高，细胞集落形成的数量明显减少，细胞向划痕
区的迁移速度不断减慢;穿过 Transwell 小室的侵袭细胞亦
明显减少;MMP-2、MMP-9 蛋白表达逐渐降低，TIMP-2 蛋白
表达升高，呈浓度依赖性。结论 三叶青黄酮能够抑制肺癌
A549 细胞的侵袭转移，可能与降低 MMP-2、MMP-9 蛋白表
达有关。
关键词:三叶青;抑制;A549 细胞;增殖;侵袭转移;MMP
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类
的健康。尽管相关临床治疗方面研究取得重大进
展，但其预后仍不理想。肿瘤转移是治疗失败的主
要原因之一，临床上近一半患者在确诊时已是晚期，
并发生远处转移［1］。因此，抑制转移的新药开发具
有重要意义。
三叶青为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤
收稿日期:2015 － 12 － 20，修回日期:2016 － 02 － 12
基金项目:国家自然科学基金资助项目(No 81541084) ;浙江省自然
科学基金资助项目(No LQ15H290006)
作者简介:钟良瑞(1982 －) ，男，博士，主治医师，肿瘤学，E-mail:ju-
lary@ 163． com;
魏克民(1938 －) ，男，研究员，教授，博士生导师，通讯作
者，E-mail:wkmcyzy@ 163． com
(Tetrastigma hemsleyanum Dielset) ，又名蛇附子、三
叶对、金丝吊葫芦等。块根或全草入药，可清热解
毒、祛风化痰、活血止痛，用于高热惊厥、肺炎、哮喘、
咽痛、肝炎、风湿等症［2 － 3］。抗肿瘤方面的作用也越
来越受关注。三叶青对肿瘤细胞的凋亡作用有较多
前期研究［4 － 5］，但其对肿瘤侵袭转移方面的研究尚
未见报道。本研究探讨三叶青黄酮(radix tetrastig-
ma hemsleyani flavone，ＲTHF)对肺癌 A549 细胞侵
袭转移的抑制作用，为三叶青进一步开发和临床应
用提供依据。
1 材料
1． 1 细胞株 A549 细胞株由浙江省医学科学院提
供，由浙江中医药大学实验室培养传代，实验中所用
为生长状况良好的细胞。
1． 2 药品与试剂 三叶青购自浙江省中医药研究
院，由浙江省中药新药研发重点实验室提取制备。
Hyclone胎牛血清;ＲPMI 1640 培养液:杭州吉诺生
物医药技术有限公司。Transwell小室:美国 Corning
公司;Matrigel 胶:美国 BD 公司。MMP-2、MMP-9、
TIMP-2:美国 CST公司。
1． 3 仪器 3111 型 CO2 细胞培养箱:美国 Thermo
公司;3001 型酶标仪:美国 Thermo 公司;蛋白印记
检测系统:美国 Bio-Ｒad 公司;IX71 型倒置显微镜:
日本 OLYMPUS公司。
2 方法
2． 1 细胞培养 培养液均为含 10%胎牛血清的
ＲPMI 1640 培养液，培养条件为 37℃、含 5% CO2 的
细胞培养箱内。待细胞长满瓶底后，胰酶消化，分瓶
培养，取对数生长期细胞用于实验。
2． 2 MTT 检测抑制率 取对数生长期的 A549 细
胞，计数细胞密度为 5 × 107·L －1的细胞悬液，每孔
100 μL细胞悬液接种于 96 孔板，贴壁后更换培养
液并加不同浓度三叶青黄酮(0、0. 5、1、5、10 g·
·084· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2016 Apr;32(4) :480 ～ 3
L －1)分 5 组，每组 6 复孔;分别在 24、48、72 h 检测，
570 nm为检测波长，统计每组各孔吸光度 OD 值。
根据公式:抑制率 /% =(1 －加药组 OD 值 /对照组
OD值)× 100%，计算三叶青黄酮对 A549 细胞的抑
制率。
2． 3 集落形成实验 A549 细胞以1 000个 /孔密度
接种于 6 孔板内，贴壁后加不同浓度三叶青黄酮
(0、1、5、10 g·L －1) ，于 37℃培养箱内培养 10 d。
经多聚甲醛固定，结晶紫染色 10 min，蒸馏水充分清
洗，在显微镜下对含 50 个细胞以上的克隆进行计
数，并用相机对 6 孔板拍照。
2． 4 划痕试验检测细胞迁移力 将 A549 细胞接
种于 6 孔板内培养，待细胞基本长满，用 200 μL 枪
头于细胞层中纵向划痕，造成培养细胞缺损区域带，
加入不同浓度的三叶青黄酮(0、1、5、10 g·L －1)继
续培养 24 h，倒置显微镜下观察划痕处细胞的覆盖
情况。
2． 5 Transwell侵袭实验检测 A549 细胞的侵袭力
将 Matrigel 胶铺到 transwell 上室。A549 细胞(2
× 104 个细胞 /孔)悬浮于含不同浓度三叶青黄酮
(0、1、5、10 g·L －1)的无血清培养基中并接种在上
室;下室中加含 10%胎牛血清的培养基作为趋化，
5% CO2、37℃孵育 16 h，培养结束时，用棉签擦去上
室上面的非侵袭细胞和 Matrigel 胶，经多聚甲醛固
定，0. 1%结晶紫染色。显微镜下计数细胞，取均值。
2． 6 Western blot 检测侵袭转移相关蛋白 冰上
操作，快速刮下细胞，移至 1. 5 mL 离心管。每瓶细
胞加 250 ～ 500 μL ＲIPA 裂解液，1 200 r·min －1离
心 5 min，收获蛋白，测定蛋白浓度。用 SDS-PAGE
电泳分离蛋白，将蛋白转移至 PVDF膜上。5%脱脂
奶粉室温下封闭 1 h，一抗室温孵育 2 ～ 3 h，二抗室
温孵育 1 h。室温下，ECL 混合液滴加在 PVDF 膜
上，避光反应 3 ～ 5 min，放入蛋白印记检测系统的暗
箱内，在暗室中，曝光、显影，以 β-actin 作为内参进
行分析。
2． 7 统计学方法 用 SPSS 13. 0 统计软件分析处
理。统计描述:计量资料数据用 珋x ± s 表示。组间比
较采用方差分析。
3 结果
3． 1 三叶青黄酮对 A549 细胞增殖的影响 不同
浓度三叶青黄酮作用不同时间后，A549 细胞的增殖
抑制率见 Tab 1，各浓度对 A549 细胞有明显的抑制
作用，随着药物浓度的增加、时间延长，其抑制作用
逐步增强，呈明显的浓度、时间 －效应关系。各组间
差异有统计学意义(P ＜ 0. 01)。
3． 2 三叶青黄酮对 A549 细胞生长影响 与空白
对照组比较，随药物浓度增加，细胞集落数量明显减
少，与 MTT结果相符(Fig 1)。
Fig 1 Effects of ＲTHF on colone formation of A549 cells
a:Control group;b:1 g·L －1;c:5 g·L －1;d:10 g·L －1
3． 3 三叶青黄酮对 A549 细胞迁移力的影响 与
对照组比较，24 h时各组划痕区均出现不同程度的
变窄;随着药物浓度的增高，A549 细胞向划痕区的
迁移速度不断减慢，10 g·L －1组细胞划痕区变窄不
明显。可见三叶青黄酮抑制 A549 细胞的迁移存在
一定的剂量依赖性(Fig 2)。
3． 4 三叶青黄酮对 A549 细胞侵袭力的影响 随
三叶青黄酮浓度增加，侵袭的细胞明显减少，呈一定
浓度依赖性。与对照组比较，三叶青黄酮 1 g·L －1
时侵袭 A549 细胞减少到 65%，10 g·L －1时细胞减
少到 39%，差异有显著性(Fig 3)。结果表明，三叶
青黄酮可明显抑制 A549 细胞侵袭转移。
Tab 1 Effects of ＲTHF on cell proliferation ability in A549 cells
Time /h
Concentrations of ＲTHF /g·L －1
0． 5 1 5 10
24 4． 45 ± 0． 52＊＊ 8． 12 ± 2． 18＊＊ 25． 60 ± 3． 18＊＊ 57． 42 ± 2． 03＊＊
48 8． 97 ± 1． 05＊＊ 24． 91 ± 1． 17＊＊ 44． 80 ± 0． 66＊＊ 67． 60 ± 1． 23＊＊
72 25． 95 ± 0． 90＊＊ 46． 32 ± 0． 94＊＊ 68． 55 ± 0． 28＊＊ 72． 04 ± 0． 82＊＊
＊＊P ＜ 0. 01 vs control goup
·184·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2016 Apr;32(4)
Fig 2 Effects of ＲTHF on migration of A549 cells(40 ×)
Fig 3 Effects of ＲTHF on invasion of A549 cells(200 ×)
A:Control group;B:1 g·L －1;C:5 g·L －1;D:10 g·L －1
3． 5 三叶青黄酮对 A549 细胞 MMP-2、MMP-9 和
TIMP-2 蛋白表达水平的影响 不同浓度三叶青黄
酮处理 A549 细胞 48 h后，与空白对照组相比，随着
药物剂量增加，MMP-2、MMP-9 蛋白表达逐渐降低;
TIMP-2 蛋白逐渐升高，差异明显(Fig 4)。
Fig 4 Effects of ＲTHF on expressions
of MMP-2，MMP-9，and TIMP-2 in A549 cells
A:Control group;B:1 g·L －1;C:5 g·L －1;D:10 g·L －1
4 讨论
肿瘤治疗失败的主要原因之一是转移，控制转
移是决定患者预后的关键因素之一。肿瘤转移的发
生包括细胞增殖、黏附、侵袭等方面，机制复杂［6］。
目前中药的抗癌机制研究受到关注，在促进凋亡、抑
制增殖、侵袭转移等方面已取得突破。三叶青具有
清热解毒、祛风化痰、活血化瘀、抗炎镇痛等作用;抗
肿瘤方面亦具有良好治疗效果。因此，本实验深入
研究三叶青抗肺癌的机制具有重要意义。
本实验通过体外实验 MTT证实:三叶青黄酮能
抑制人肺癌细胞株 A549 的增殖，且具有浓度、时间
依赖性。药物浓度为 10 g·L －1、作用时间 72 h 时，
对细胞的抑制率最高，表明三叶青黄酮能够明显抑
制肺癌细胞的增殖。肿瘤转移过程中，肿瘤细胞穿
过细胞外基质是肿瘤细胞发生侵袭转移的重要环
节［7］;肿瘤细胞的侵袭有赖于细胞迁移能力的强
弱。本研究通过划痕实验，显示三叶青黄酮能够抑
制肺癌 A549 细胞的迁移，且与浓度呈正相关性。
在显微镜下观察经结晶紫染色后穿透 Transwell 小
室的 A549 细胞数量，随着三叶青黄酮浓度增加，细
胞数量明显减少，差异有显著性。本研究证实三叶
青黄酮可以明显抑制 A549 细胞的增殖和侵袭转
移。
肿瘤细胞中存在多种蛋白水解酶降解细胞外基
质(ECM)［8］，金属蛋白酶家族(MMPs)在细胞外基
质降解，促进肿瘤细胞迁移和转移等过程中发挥了
关键作用［9］，其中 MMP-2 和 MMP-9 是肿瘤细胞分
泌的两个主要的蛋白酶［10］。有研究证实，抑制
MMP-2 可明显抑制胃癌细胞侵袭和转移［11］。MMP-
9 可特异性降解细胞外基质中的 IV 型胶原，在细胞
侵袭和迁移中起到重要作用。TIMPs是内源性抑制
剂，能阻断 MMPs 的活性。MMPs 和 TIMPs 之间的
平衡决定 MMP 总体活性。TIMPs 的过表达被证实
可减少转移，TIMP-1 和 TIMP-2 分别与 MMP-9 和
MMP-2 有很高的亲和力［12］。研究发现，TIMP-2 的
高表达能抑制体内和体外内皮细胞和肿瘤细胞的侵
袭［13 － 14］。本实验通过 Western blot 检测结果显示，
与对照组相比，随三叶青黄酮浓度增加，MMP-2 和
MMP-9 蛋白表达降低，TIMP-2 蛋白表达增加，提示
三叶青黄酮通过调节 MMPs 抑制 A549 细胞侵袭转
移。
综上所述，三叶青黄酮对肺癌 A549 细胞具有
抑制增殖和侵袭转移作用。通过降低 MMP-2 和
MMP-9 蛋白，增强 TIMP-2 蛋白表达可能是其调节
机制之一。
·284· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2016 Apr;32(4)
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Inhibitory effects of Ｒadix Tetrastigma Hemsleyani Flavone
on growth and invasion of lung carcinoma cells
ZHONG Liang-rui1，LIN Shuang1，WEI Ke-min2
(1． TongDe Hospital of Zhejiang Province，Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310012，China;
2． Zhejiang Academy of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou 310007，China)
Abstract:Aim To study the effect of Ｒadix Tetrastig-
ma Hemsleyani Flavone(ＲTHF)on the proliferation
and invasion in lung carcinoma A549 cells as well as
the possible mechanisms underlying these processes．
Methods A549 cells were treated with different con-
centrations of ＲTHF for different time． MTT assay and
colone formation assay were used to detect the ability of
cell proliferation． Wound healing methods and tran-
swell chamber assay were adopted to determine cell mi-
gration and invasion． Western blotting assay was used
to detect the expression of metastasis-related proteins
MMP-2，MMP-9，and TIMP-2． Ｒesults ＲTHF obvi-
ously suppressed the proliferation of A549 cells in a
dose-and time-dependent manner． Microscope found an
apparent decrease of cells in the denude zone of cell
migration and transwell testing results show that the
treatment of invasion was significantly lower than the
proportion in the control group(P ＜ 0. 01)． The pro-
tein expressions of MMP-2 and MMP-9 were down-reg-
ulated and that of TIMP-2 was up-regulated in a dose-
dependent manner． Conclusion ＲTHF inhibits the
growth and invasion of lung carcinoma A549 cells，
which might be achieved by down-regulating the ex-
pressions of MMP-2 and MMP-9 protein．
Key words:Ｒadix Tetrastigma Hemsleyani; inhibi-
tion;A549 cell;proliferation;metastasis;MMP
·384·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2016 Apr;32(4)