全 文 ：牛角七的体外抑菌作用研究
但飞君 ,蔡正军 ,李海龙 ,孙 利 ,褚立军　(三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室 ,湖北宜昌 443002)
摘要　[目的 ]对牛角七乙醇提取物及其 5个萃取部位进行体外抑菌活性研究。 [方法]牛角七经乙醇提取 ,系统溶剂萃取分离得到 5个
部位。以注射用头孢曲松钠为对照 ,采用管碟法测定提取物及萃取部位对受试菌的抑菌活性 ,并测定其相应最小抑菌浓度(MIC)。[结
果]牛角七提取物和乙酸乙酯部位对受试菌均有较强的抑菌活性 ,抑菌圈直径均大于 15.00 mm,尤其提取物 、乙酸乙酯和正丁醇部位对
绿脓杆菌(临床株)具有较强的抑菌活性 ,抑菌圈直径分别达 19.31、19.67和 17.69mm,其MIC均为 0.625 0mg/ml。 [结论]牛角七提取
物及其萃取部位对受试菌种抑制作用不同 ,少数抑菌活性与对照药相当甚至更强。
关键词　牛角七;抑菌活性;活性部位
中图分类号　S567.23+9　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)10-04491-02
AntibacterialActioninvitroofRodgersiaaesculifoliaBatal.
DANFei-junetal　(HubeiKeyLaboratoryofNaturalProductsResearchandDevelopment, ChinaThreeGorgesUniversity, Yichang, Hubei
443002)
Abstract　[ Objective] Thestudyaimstoresearchtheanti-bacterialactivityinvitrooftheextractanditsextractivefractionsinRodgersiaaes-
culifoliaBatal..[ Method] RodgersiaaesculifoliaBatal.isextractedbyethanol.Fivefractionsareobtainedbysystematicallyseparatingthe
extracts.Ceftriaxonesodiumispositivecontrol, theantibacterialactivitiesinvitroonbacterialspeciesaredeterminedbycylinder-platemethod
anddeterminingtheircorrespondingminimuminhibitionconcentration(MIC).[ Result] Theextractandethylacetatefractionsshowthatal
strainshavehighanti-bacterialactivities, thediameterisbiggerthan15.00mm.Especialytheextract, ethylacetateandn-butanolfractions
onPseudomonasaeruginosa(clinicbacterial)reachto19.31, 19.67and17.69mm, theMICare0.625 0 mg/ml.[ Conclusion] Theextract
anditsfivefractionsofRodgersiaaesculifoliaBatal.havediferentanti-bacterialactivitiestodiferentstrains.Afewofthemhavethesame
bacteriostasisasCeftriaxonesodiumforinjectionorevenmore.
Keywords　RodgersiaaesculifoliaBatal.;Anti-bacterialactivity;Activityfraction
作者简介　但飞君(1972-),女 ,湖北荆门人 , 博士 ,副教授 ,从事天然
产物的活性成分开发与研究。
收稿日期　 2009-01-19
　　牛角七 (RodgersiaaesculifoliaBatal.),为虎耳草科多年
生草本植物 [ 1] ,又名厚朴七 、接骨丹 ,以根茎入药 ,具有清热
解毒 、止血生肌 、止泻等功用 ,主治湿热下痢 、久泻 、白浊 、带
下 、崩漏 、便血 、疮毒 、金疮等症 [ 2] 。广泛分布于湖北 、陕西 、
甘肃 、河南 、四川等地区 ,其主要有效成分为岩白菜素(Berge-
nin)[ 3] 。文献报道牛角七具有抗菌 、免疫增强和广谱的抗病
毒作用 [ 4-6] ,笔者在上述研究的基础上 ,对牛角七进一步进
行体外抗菌实验研究 ,发现牛角七乙醇提取物及其不同萃取
部位具有较好的抗菌活性。为进一步活性追踪其化学成分
提供依据和导向 ,为开发成植物源抗菌剂提供实验基础 ,为
三峡库区牛角七的进一步开发利用提供理论基础。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　仪器。低温冷冻干燥仪(美国 LABCONCO公司), N-
1001型旋转蒸发器(日本 EYELA), YXQ-LSⅡ全自动立式压
力蒸气灭菌锅 (上海博讯实业有限公司), HPX-9052MBE数
显电热培养箱(上海博讯实业有限公司), AL204型电子天平
(METTLWRTOLEDO), SW-CJ-1F型超净工作台(苏州净化
设备有限公司)等。
1.1.2　药材。自采药材 , 2007年 9月采于湖北长阳土家族
自治区 ,经三峡大学汪鋆植教授鉴定为牛角七的根。
1.1.3　试剂。注射用头孢曲松钠 [中诺药业(石家庄)有限
公司 ] , 95%乙醇(化学纯),石油醚 ,三氯甲烷 ,乙酸乙酯 ,丙
酮 ,正丁醇等(分析纯)。
1.1.4　培养基。牛肉膏蛋白胨培养基(北京双旋微生物培
养基制品厂), 琼脂粉(上海惠兴生化试剂有限公司)。
1.1.5　菌种。临床菌株:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus
aureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)和绿脓杆菌(Pseudomonas
aeruginosa)由湖北省宜昌市中心医院从临床分离所得耐药
菌株;标准菌株:金黄色葡萄球菌 、大肠杆菌 、绿脓杆菌和枯
草芽孢杆菌(Bacilussubtilis)由三峡大学化生学院微生物实
验中心提供。
1.2　方法
1.2.1　抗菌剂制备。干燥的牛角七根 2.0kg,粉碎 ,过 20目
筛。 95%乙醇回流提取 ,减压浓缩得总浸膏为 847.8 g。总
浸膏用适量水溶解 ,依次用石油醚 、氯仿 、乙酸乙酯 、正丁醇
萃取。各萃取液及水相减压浓缩回收溶剂 ,得不同极性部位
浸膏 ,石油醚部位 68.3 g、氯仿部位 47.8 g、乙酸乙酯部位
63.2 g、正丁醇部位 84.5 g、水部位 243.2 g。精密称取所得
各部位浸膏 100mg,配制成 10 ml得 10mg/ml药液;对照药:
注射用头孢曲松钠配制成 1mg/ml,备用。
1.2.2　固体培养基的制备。称取营养琼脂置于三角烧瓶
中 ,用去离子水溶解 , 121 ℃高压灭菌 15 min,待冷却至 60 ℃
后取出 ,备用 。
1.2.3　菌悬液的制备。取 7只试管 ,分别加入等量生理盐
水至试管的 1/3处 ,紫外灭菌 20 min,无菌棉签蘸取新鲜菌
种少量(4 ～5个菌落)于生理盐水中充分搅动使细菌分散均
匀。校正菌液浓度与标准比浊管相同 , 即达 015号麦氏比浊
管浊度 。所有步骤均在无菌条件下完成 。
1.2.4　抑菌活性的测定 [ 7] 。采用管碟法 [ 8] ,吸取菌悬液 0.2
ml均匀涂布于平板(内径 90mm)表面 ,等距离放入 4个灭菌
的牛津杯(规格 10.0 mm×8.0mm×6.0 mm),逐一加入抗
菌剂 200 μl,以 1 mg/ml的注射用头孢曲松钠作阳性对照。
37 ℃恒温培养 24 h,观察抑菌情况 ,游标卡尺测量抑菌圈直
径 ,各菌重复实验 6次。采用软件 SPSS进行均值分析 ,评价
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2009, 37(10):4491-4492, 4502 责任编辑　孙红忠　责任校对　施倩倩
抑菌活性。
最低抑菌浓度(MIC)的测定:以无菌水为空白对照 ,采
用平板二倍稀释法测定各样品对不同细菌的 MIC。按 2倍
比稀释法配成浓度梯度的抗菌剂:5.000 000、2.500 000、
1.250 000、0.625 000、0.321 500、 0.156 250、0.078 125 mg/ml。
分别吸取各浓度的抗菌剂 2 ml,与 15 ml无菌培养基(低于
45℃)充分混匀 ,并冷却制成含抗菌剂平板 。编号 ,吸取供
试菌悬液 0.1 ml均匀涂布于平板 , 37 ℃恒温培养 24 h,观察
各菌生长情况 ,以完全无菌生长的平板所对应的抗菌剂浓度
作为最低抑菌浓度 ,各菌实验重复 3次。
1.2.5　数据处理。采用 SPSS13.0 forWindows(One-Way
ANOVA)软件对多次抑菌测试结果进行均值分析 , 实验数据
以 x±s表示。
2　结果与分析
2.1　牛角七提取物及不同萃取部位抑菌效果　表 1显示 ,
牛角七提取物及其各萃取部位对不同受试菌株具有一定的
抗菌活性 ,但不同成分对各菌的抗菌活性有所不同。牛角七
乙醇提取物和乙酸乙酯部位对受试菌均有较强的抑菌活性 ,
抑菌圈直径均大于 15.00 mm,尤其是乙酸乙酯部位对金黄
色葡萄球菌抑菌圈达 20.81mm。甚至对对照药不起作用的
致病性绿脓杆菌(临床株)也具有较强的抑菌活性 ,抑菌圈直
径分别为 19.31、19.67和 17.69mm。
另外 ,牛角七各萃取部位(除水部位外)对受试菌都具有
一定的抑菌活性 ,表明牛角七具有较广谱的抑菌活性 ,其中
抑菌活性成分主要集中于中等极性的乙酸乙酯部位和正丁
醇部位 。
表 1　牛角七提取物及不同萃取部位抑菌效果
Table1　AntibacterialeffectofextractsanditsdifferentextractivefractionsinRodgersiaaesculifoliaBatal.
菌种
Strains
抑菌圈直径∥mmAntibacterialcirclediameter
注射用头孢曲松钠
Ceftriaxonesodium
乙醇提取物
Ethanolextract
石油醚部位
Petroleumfraction
氯仿部位
Chloroformfraction
乙酸乙酯部位
Ethylacetatefraction
正丁醇部位
N-butanolfraction
水部位
Waterfraction
金黄色葡萄球菌 22.64±1.32 18.24±0.87 11.32±0.54 13.47±0.39 20.81±1.05 13.73±0.59 -
Staphylococcusaureus
大肠杆菌 23.07±0.95 16.59±0.36 10.56±0.35 - 17.24±0.91 17.45±0.69 -
E.coli
绿脓杆菌 21.69±0.68 17.72±0.65 11.58±0.76 - 15.72±0.83 13.43±0.27 -
Pseudomonasaeruginosa
枯草芽孢杆菌 20.49±1.26 18.06±0.59 12.35±1.21 10.56±0.91 15.48±0.83 12.53±0.85 -
Bacilussubtilis
金黄色葡萄球菌(临床株) 21.36±0.72 16.71±1.15 - 12.56±0.81 15.43±0.74 11.73±0.52 -
Staphylococcusaureus
(clinicalstrain)
大肠杆菌(临床株) 29.85±1.03 17.46±0.61 9.59±0.34 - 15.15±0.53 12.61±0.54 -
E.coli(clinicalstrain)
绿脓杆菌(临床株) - 19.31±0.95 - - 19.67±0.73 17.69±1.13 -
Pseudomonasaeruginosa
(clinicalstrain)
2.2　牛角七提取物及其不同萃取部位的 MIC　结果见表 2。
空白组各菌长势旺盛 ,总提取物对金黄色葡萄球菌 、枯草芽
孢杆菌 、大肠杆菌(临床株)和金黄色葡萄球菌(临床株)的
MIC均为 0.625 0mg/ml;乙酸乙酯部位对金黄色葡萄球菌的
MIC最小 ,为 0.312 5 mg/ml,对大肠杆菌和绿脓杆菌(临床
株)抑制较强 ,其 MIC均为 0.625 0 mg/ml;正丁醇部位对大
肠杆菌和绿脓杆菌(临床株)的 MIC均为 0.625 0 mg/ml;其
余各样品对不同菌的 MIC值均大于 1.000 0 mg/ml。
表 2　牛角七提取物及不同萃取部位的 MIC
Table2　MICofextractsanditsdifferentextractivefractionsinRodgersiaaesculifoliaBatal. mg/ml　
菌种
Strains
乙醇提取物
Ethanolextract
石油醚部位
Petroleumfraction
氯仿部位
Chloroformfraction
乙酸乙酯部位
Ethylacetatefraction
正丁醇部位
N-butanolfraction
水部位
Waterfraction
金黄色葡萄球菌 0.625 0 2.500 0 1.250 0 0.312 5 1.250 0 -
Staphylococcusaureus
大肠杆菌E.coli 1.250 0 2.500 0 - 0.625 0 0.625 0 -
绿脓杆菌 1.250 0 2.500 0 - 1.250 0 2.500 0 -
Pseudomonasaeruginosa
枯草芽孢杆菌 Bacilussubtilis 0.625 0 1.250 0 2.500 0 2.500 0 2.500 0 -
金黄色葡萄球菌(临床株) 1.250 0 - 1.250 0 1.250 0 2.500 0 -
Staphylococcusaureus(clinicalstrain)
大肠杆菌(临床株) 0.625 0 5.000 0 - 1.250 0 2.500 0 -
E.coli(clinicalstrain)
绿脓杆菌(临床株) 0.625 0 - - 0.625 0 0.625 0 -
Pseudomonasaeruginosa(clinicalstrain)
3　讨论
牛角七提取物及其萃取部位对供试菌的抑菌活性因菌
种不同而存在差异 ,在测定浓度范围 0.078 125 ～10.000 000
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液 OD值)×100%。
1.2.4　数据统计。试验数据采用 SPSS12.0统计软件进行
处理。
2　结果与分析
由表 1可知 ,不同浓度(50、100、200 μg/ml)PGBL对 HL-60
细胞的增殖均有不同程度的抑制作用 ,且随着药物浓度和作
用时间的增加 ,其抑制作用增强 , PGBL对 HL- 60细胞增殖
的抑制作用存在一定的剂量 -时间依赖性。方差分析结果
表明 , PGBL对 HL-60细胞增殖的抑制作用显著高于对照(P
<0.05)。
表 1　不同浓度 PGBL对 HL-60细胞增殖的影响
Table1　EfectsofPGBLwithdifferentconcentrationsonHL-60celproliferation
组别
Groups
PGBL浓度
μg/ml
PGBLdose
24h
OD值
ODvalue
抑制率∥%
Inhibitionrate
48h
OD值
ODvalue
抑制率∥%
Inhibitionrate
72h
OD值
ODvalue
抑制率∥%
Inhibitionrate
CK 0 0.785±0.060 - 0.968±0.034 - 1.136±0.059 -
① 50 0.701±0.067 10.70 0.775±0.032＊ 19.94 0.813±0.088＊ 28.44
② 100 0.605±0.034＊ 22.93 0.692±0.073＊ 28.53 0.722±0.063＊＊ 36.44
③ 200 0.551±0.059＊ 29.81 0.606±0.049＊＊ 37.40 0.610±0.076＊＊ 46.30
注:＊、＊＊分别表示与对照组差异显著和极显著。
Note:ComparingwithCK, ＊, ＊＊meanthediferencesaresignificantandextremelysignificant.
3　结论与讨论
多糖广泛存在于动植物和微生物中 ,是由醛基和酮基通
过糖苷键连接的高分子聚合物 ,也是构成生命的 4大基本物
质之一。大量试验表明 ,天然多糖具有抗肿瘤活性 ,且无骨
髓抑制等不良反应 ,部分多糖类化合物已应用于临床 ,并取
得良好的治疗效果 [ 5] 。
银杏叶多糖(PGBL)是从银杏叶中提取的一种无毒成
分 ,可作为新一代的抗肿瘤药物 [ 6-7] 。据报道 ,银杏叶多糖
可抑制 S180实体瘤和腹水瘤生长 ,延长荷瘤小鼠的存活时间 ,
且银杏叶多糖与放疗联合使用时 ,可增加肿瘤细胞的放射敏
感性 ,强化 γ-射线杀灭肿瘤细胞的效应 [ 7-8] 。该研究通过体
外培养人急性早幼粒白血病 HL-60细胞 ,检测了不同浓度银
杏叶多糖对 HL-60细胞增殖的影响 。结果表明 50、100、 200
μg/ml银杏叶多糖对 HL-60细胞增殖均有抑制作用 ,且其抑
制作用具有浓度 -时间依赖性。综上所述 ,银杏叶多糖可抑
制 HL-60细胞增殖 ,在白血病的辅助治疗方面具有良好的
应用前景 ,但其在临床中的应用有待于进一步研究。
参考文献
[ 1] 仰榴青 ,徐佐旗.银杏多糖的研究进展 [ J].食品科学, 2004, 25(11):372
-375.[ 2] 许爱华 ,陈华圣 ,褚澄,等.银杏外种皮多糖对人癌细胞株的抑制作用
及与阿霉素的协同效应 [ J] .中国新药杂志 , 2000, 9(11):753-755.
[ 3] 许爱华 ,陈华圣 ,孙步蟾.银杏外种皮多糖对 HL-60细胞的体外实验研
究 [ J].中药材, 2004, 27(5):361-363.
[ 4] 靳菊情 ,丁东宁 ,边晓丽,等.银杏叶多糖的化学及清除羟自由基作用
[ J].西安医科大学学报, 2000, 21(5):417-419.
[ 5] 姜建芳 ,王思平 ,何新军.中药多糖抗肿瘤作用研究进展[ J] .中国现代
应用药学杂志, 2008, 25(7):616-618.
[ 6] 刘新,申丰 ,杨晓临.银杏叶多糖对小鼠免疫细胞活性的影响 [ J] .沈阳
医学院学报 , 1999, 1(3):140-142.[ 7] 陈群,刘天骄.银杏叶多糖的抗肿瘤和免疫调节作用 [ J] .中药药理与
临床, 2003, 19(5):18-19.
[ 8] 侯华新 ,黎丹戎 ,黄桂宽 ,等.银杏叶多糖在肿瘤放射、化学治疗中的增
敏作用研究 [ J].广西医科大学学报, 2005, 22(1):29-31.
(上接第 4492页)
mg/ml内 ,金黄色葡萄球菌 、金黄色葡萄球菌(临床株)和绿
脓杆菌(临床株)等供试菌对牛角七成分更敏感 。由于金黄
色葡萄球菌是引起细菌性食物中毒和医院院内感染的一种
重要病原菌 ,且是最易产生耐药性的致病菌之一 ,牛角七活
性成分对金黄色葡萄球菌较强的抑菌作用预示着开发牛角
七活性成分作为植物源抗菌剂的可能性。
另外 ,实验结果得出 ,牛角七乙醇提取物及其乙酸乙酯 、
正丁醇部位对受试菌都具有较强的抑制活性 ,尤其对阳性药
无作用的绿脓杆菌(临床株)具有很强的抑制活性 ,表明牛角
七乙醇提取物及其乙酸乙酯 、正丁醇部位的抗菌谱较广 ,并
且中等极性的乙酸乙酯部位和较大极性的正丁醇部位为牛
角七的抗菌活性主要部位。笔者将对牛角七乙酸乙酯和正
丁醇萃取部位的活性成分作进一步的研究 , 再进行抗菌活
性的评价 ,最终分离出具有抗菌活性的单体成分。同时 , 该
实验为抗菌药物的筛选 、抗菌谱的测定 、药价测定 、提取过程
的追踪等提供了可供参考的数据资料 ,为牛角七的进一步开
发利用提供了一些基础资料 。
参考文献
[ 1] 《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编:上册 [ M].北京:人民卫
生出版社, 1976.
[ 2] 江苏新医学院.中药大辞典:下册 [ M].上海:上海科学技术出版社,
2005.[ 3] 国家医药管理局中草药情报中心.植物药有效成分手册 [ M].北京:人
民卫生出版社, 1986.
[ 4] 《湖北恩施药用植物志》编写组.湖北恩施药用植物志:上册 [ M].武
汉:湖北科学技术出版社 , 2006.
[ 5] 胡风莲 ,刘宏.中药材鬼灯檠的研究现状[ J] .陕西农业科学 , 2008(3):
144-145.
[ 6] 张东佳 ,杨永建 , 史彦斌,等.鬼灯檠的体外抑菌及急性毒性试验[ J].
中成药 , 2005, 27(5):604-605.
[ 7] 陈奇.中药药理研究方法学[ M].北京:人民卫生出版社 , 1993.
[ 8] 徐叔云 ,卞如濂 ,陈修.药理实验方法学[ M].3版.北京:人民卫生出版社, 2002.
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