全 文 ：微生物学通报 AUG 20, 2008, 35(8): 1171~1175
Microbiology © 2008 by Institute of Microbiology, CAS
tongbao@im.ac.cn


* 通讯作者：Tel: 0835-8525525; : yanbenju@sicau.edu.cn
收稿日期：2007-12-22; 接受日期：2008-02-19
研究报告
低乙醇脱氢酶Ⅱ活性的抗老化啤酒
酵母工程菌的构建
蔡 勇 1 母 茜 1 王肇悦 2 张博润 2 晏本菊 1*
(1. 四川农业大学生命科学与理学院 雅安 625014)
(2. 中国科学院微生物研究所 北京 100101)


摘 要: 采用自克隆技术, 破坏啤酒酵母工业菌株 YSF31 的 ADH2 基因, 在 ADH2 基因位点插入
来源于 YSF31 的编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的 GSH1 基因和铜抗性筛选标记 CUP1 基因。通
过铜抗性筛选转化子, 经 PCR 和乙醇脱氢酶Ⅱ (ADHⅡ) 活性测定验证, 获得了 1 株啤酒酵母工
程菌。10°P 麦芽汁发酵实验显示, 自克隆菌株的乙醇脱氢酶Ⅱ活性是受体菌的 65%, 谷胱甘肽含
量比受体菌 YSF31 的高 34%。其他发酵指标并没有发生明显改变。由于 DNA 操作过程中没有外
源基因介入, 因此啤酒酵母工程菌为生物安全的自克隆菌株, 具有重要的应用价值。
关键词: 啤酒酵母工业菌株, 谷胱甘肽, 乙醇脱氢酶Ⅱ, 自克隆
Construction of Self-cloning Industrial Brewing
Yeast with High-glutathione Production and
Low-ADH II Enzyme Activity
CAI Yong1 MU Qian1 WANG Zhao-Yue2 ZHANG Bo-Run2 YAN Ben-Ju1*
(1. College of Life Sciences, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014)
(2. Institute of Microbiology, Chinese Academy of Science, Beijing 100101)
Abstract: Self-cloning strains of industrial brewing yeast were constructed by integrating Saccharomyces
cerevisiae genes, γ-glutamylcysteine synthetase gene (GSH1) and copper resistant gene (CUP1) into the lo-
cus of alcohol dehydrogenase II (ADH II) gene (ADH2). The self-cloning strains were selected for their re-
sistance to CuSO4 and identified by PCR amplification. The results of ADH II and glutathione (GSH) assay
from fermentation with the self-cloning strains in 500ml conical flask showed that ADH II activity decreased
to 65% and GSH content was 1.3 fold compared with that of host yeasts. The self-cloning strains do not
contain any heterologous DNA; they may be more acceptable to the public.
Keywords: Industrial brewing yeast, Glutathione, Alcohol dehydrogenase II, Self-cloning
乙醛 (CH3 CHO)是啤酒中主要的风味物质之
一[1]。一般啤酒中的含量为 5 mg/L~12 mg/L。国外
优质啤酒的乙醛含量多在 3 mg/L以下。低浓度的乙
醛使啤酒具有芳香味, 高浓度则产生像青草或者苹果
DOI:10.13344/j.microbiol.china.2008.08.015
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腐烂的味道[2]。乙醛含量已成为国内啤酒风味改良
的瓶颈。降低啤酒中乙醛的含量, 主要有两种手段：
一是通过对发酵工艺的改进降低乙醛含量; 二是通
过代谢工程, 修饰工业菌株的代谢途径达到降低乙
醛含量的目的。关于前者有大量的文献报道, 但由
于啤酒生产对发酵条件要求严格, 使此类工艺改进
很难在生产中应用。国内外对啤酒酵母 (Saccha-
romyces cerevisiae)开展的代谢工程有大量报道, 但
针对乙醛含量开展的代谢工程研究报道很少。随着
对啤酒酵母中乙醛代谢途径的揭示, 以及相关基因
的克隆, 利用基因工程的手段对乙醛代谢过程进行
修饰已成为可能。
谷胱甘肽是三肽小分子 , 具有抗氧化的功能 ,
对细胞有保护作用。增加谷胱甘肽的含量可以提高
啤酒的抗老化能力 [3]。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基
因 GSH1 所编码的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶是谷胱
甘肽合成途径中的限速步骤, 增强γ-谷氨酰半胱氨
酸合成酶的活性可以达到增加谷胱甘肽含量的目
的[4]。
在发酵后期, 发酵液中的葡萄糖不足的情况下,
啤酒酵母 ADH2基因编码的 ADH II (alcohol dehy-
drogenase II)催化乙醇脱氢生成乙醛, 乙醛氧化生成
乙酸盐进入三羧酸循环, 为酵母生长提供物质和能
量[5]。ADH2基因在这个代谢途径中是个关键基因。
将基因 GSH1 通过同源重组插入到啤酒酵母的
ADH2 基因位点, 成功构建了 1 株低乙醇脱氢酶Ⅱ
活性的抗老化啤酒酵母工程菌, 为构建低乙醛的啤
酒酵母工程菌提供一定的依据和基础。
1 材料与方法
1.1 菌株和质粒
大肠杆菌 (Escherichia coli)DH5α 用于克隆实
验。啤酒酵母 YSF31 由青岛啤酒集团提供。质粒
YEp352(ampR URA3)是大肠杆菌/酵母菌穿梭载体。
含有 CUP1基因的质粒 pYCUP和含有 GSH1的质粒
pGF-2均由实验室保存。
1.2 培养基和工具酶
大肠杆菌培养及所用培养基参照常规方法[6]。
培养酵母菌用 YEPD 培养基按常规配制[7]。限制性
内切酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶均购自宝生
物工程(大连)有限公司。
1.3 遗传操作
大肠杆菌转化按氯化钙法进行[6]。啤酒酵母总
DNA 的提取按文献[7]的方法进行, 啤酒酵母的遗
传转化按文献[8]的方法进行。
1.4 引物合成与 PCR 扩增
根据文献报道的 ADH2 基因序列[9]设计引物：
P1：5′-CAAGAATTCAGCACAACAATACCAGTCC
G-3′和 P2：5′-GGCAAGCTTAACATTGATGATACC
CTGGG-3′。划线部分为 EcoRⅠ和 HindⅢ的识别位
点。以 YSF31的总 DNA为模板, 进行高保真的 PCR
扩增。PCR 反应参数为：94℃变性 40 s; 56℃退火
1 min, 72℃延伸 2 min, 30个循环; 72℃延伸 15 min。
1.5 自克隆菌株的构建
1.5.1 酵母菌转化：采用完整细胞转化法 , 在含
6 mmol/L CuSO4的 YEPD平板上筛选转化子。
1.5.2 PCR 验证自克隆菌株：用于 PCR 扩增的引
物见表 1。PCR 反应体系为 25 µL, 2 µL 10×PCR
buffer, 1.2 mmol/L MgCl2, 200 µmol/L dNTP, 400 ng
模板 DNA, 0.2 µmol/L 引物, 和 1.5 U Taq聚合酶。
反应参数：94℃预变性 5 min; 94℃变性 40 s, 55℃
退火 1 min, 72℃延伸 3 min, 30个循环; 72℃延伸
15 min。

表 1 引物列表
Table 1 List of primers
Primers Sequence 5′→3′
CUP1-1 CGCTATACGTGCATATGTTC
CUP1-2 ATCTGTTGTACTATCCGCTT
GSH1-1 ATCTCATATTGACTTCCTT
GSH1-2 TACAAGATCTAACAGGAGCA

1.6 遗传稳定性分析
将待测菌在 YEPD斜面上活化, 然后转到 5 mL
YEPD培养基中(没有选择压力), 28℃培养, 每 24 h
转接 1 次, 共转接 5 次后, 取菌液涂布 YEPD 平皿,
28℃培养至长出单菌落。分别挑取 100 个单菌落于
无菌水中, 饥饿 4 h 后, 分别接种在 YEPD 及含
6 mmol/L CuSO4 的 YEPD培养基平皿上, 28℃培养
48 h, 测定单菌落对 CuSO4的抗性。
1.7 谷胱甘肽含量测定
参照文献[10]测定 GSH含量。
1.8 乙醇脱氢酶Ⅱ活性测定
参考文献[11]。
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1.9 小试发酵实验
将酵母菌接入 5 mL 麦芽汁培养基, 25℃培养
12 h, 以 10％ 的接种量接种于 10 mL麦芽汁培养基,
25℃培养 36 h, 培养液全部接于 270 mL麦芽汁中,
12℃ 静置培养 20 d。
2 结果
2.1 重组质粒的构建
重组质粒 pACG 的构建：以 YSF31 的总 DNA
为模板, PCR扩增出大小 1.7 kb的 ADH2基因。用
EcoRⅠ和 HindⅢ酶切 PCR产物, 插入质粒 YEp352
的 EcoRⅠ和 HindⅢ位点。获得质粒 pYA。用
SacⅠ和 SalⅠ酶切质粒 pYCUP得到 CUP1基因, 用
SalⅠ和 SphⅠ酶切质粒 pGF-2得到GSH1, 上述两基
因插入到质粒 pYA 的 SacⅠ和 SphⅠ位点。获得质
粒 Pacg (图 1)。 酶切分析表明重组质粒 pACG构建
正确 (图 2)。该重组质粒中 ADH2基因内部约 0.5 kb
的 DNA片段被 CUP1和 GSH1替换。



图 1 重组质粒 pACG 的构建
Fig. 1 Construction of recombinant plasmid pACG

2.2 酵母菌的转化与筛选
用 PvuⅡ酶切重组质粒 pACG 得到 1 个 6.2 kb
大小的 DNA 片段。此片段含有铜抗性基因 CUP1
和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因 GSH1, 两端含有
克隆的 ADH2 基因的 5′端和 3′端序列。用此 DNA
片段转化啤酒酵母 YSF31, 使该片段与染色体在
ADH2 位点发生同源重组。通过细胞对硫酸铜的抗
性筛选到转化子。
2.3 转化子的验证
2.3.1 PCR 扩增验证：自克隆菌株的 1个 ADH2基
因位点的部分序列被 CUP1基因和 GSH1基因替代,
而受体菌的该位点是完整的 ADH2 基因序列。以受
体菌和自克隆菌株的总 DNA 为模板, 用引物组合
CUP1-1/CUP1-2, GSH1-1/GSH1-2, CUP1-1/GSH1-1
进行 PCR扩增。结果显示, 受体菌和自克隆菌株都
扩增出分别代表 CUP1 基因和 GSH1 基因的 1.1 kb
和 4.2 kb的条带, 另外自克隆菌株的 CUP1-1/GSH1-1
引物组合还扩增出 1 条大约 5.3 kb 的条带, 而受体
菌没有扩增出该条带(图 3)。说明CUP1基因和GSH1
基因被连接整合到了自克隆菌株的染色体上。
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图 2 质粒 pACG 的酶切验证图
Fig. 2 Digestion patterns of plasmid pACG
M: DNA marker; 1: EcoRⅤ酶切 ; 2: ScaⅠ酶切 ; 3: SalⅠ酶切 ;
4: NcoⅠ酶切; 5: EcoRⅠ酶切
M: DNA marker; 1: EcoR ;Ⅴ 2: Sca ;Ⅰ 3: Sal ;Ⅰ 4: Nco ;Ⅰ
5: EcoRⅠ



图 3 受体菌和转化子的 PCR 分析
Fig. 3 PCR analysis of self-cloning strains and their
hosts
M: DNA marker; 1,2,5,6所用引物为: CUP1-1/ CUP1-2; 3,7所用引物
为: GSH1-1/ GSH1-2; 4,8, CUP1-1/ GSH1-1; 1,5所用模板为: 阴性对
照; 2~4所用模板为: YSF31总 DNA; 6~8所用模板为: 自克隆菌株总
DNA
M: DNA marker; Primers for lane 1,2,5,6: CUP1-1/CUP1-2; Primers for
lane 3,7: GSH1-1/GSH1-2; lane 4,8, CUP1-1/GSH1-1; DNA templates
for lane 1,5: Negative control; DNA templates for lane 2-4, DNA of
YSF31; DNA templates for lane 6-8: DNA of self-cloning strain

2.3.2 ADHⅡ酶活测定：按参考文献[10], 对受体
菌和自克隆菌株进行培养并诱导酶活。酶活测定结
果显示, 自克隆菌株的乙醇脱氢酶Ⅱ活性是受体菌
的 65％。说明自克隆菌株染色体上的 ADH2基因至
少有一个被插入破坏。
2.4 遗传稳定性分析
按方法所述, 分别挑选受体菌和自克隆菌株的
单菌落各 100 个, 进行遗传稳定性分析。结果显示,
受体菌的 100个单菌落在 YEPD培养基上都能生长,
而在含有 6 mmol/L CuSO4的YEPD培养基上不能生
长。自克隆菌株的 100 个单菌落在 YEPD培养基和
含有 6 mmol/L CuSO4的 YEPD培养基上均能生长。
结果说明, 自克隆菌株有很强的遗传稳定性。
2.5 自克隆菌株的小型发酵实验
按方法所述进行小试实验, 每 4 天取样检测,
结果显示(图 4), 第 8天自克隆菌株的谷胱甘肽含量
比受体菌 YSF31的高 34％。可见 GSH1基因拷贝数
的增加使谷胱甘肽合成提高。而 ADH2基因的破坏,
使ADH II酶活性明显降低, 自克隆菌株的酶活是受
体菌的 65％。自克隆菌株的其他发酵指标如α-N氨
基酸同化率、真正发酵度等与受体菌基本相同(表
2)。由 CO2减重实验和真正发酵度的检测结果可以
看出, 自克隆菌株的发酵速度和发酵度基本没有发
生变化, 说明遗传修饰没有影响酵母的发酵能力。



图 4 自克隆菌株和受体菌的谷胱甘肽含量和 ADHⅡ酶
活比较
Fig. 4 GSH content and ADH II activity of the self-cloning
strain and host

表 2 发酵指标的检测
Table 2 Fermentation profiles
Profiles YSF31 Self-cloning strain
CO2 weight reducing (g/L) 11.84 10.32
Flocculation (%) 88.66 88.70
α-N-amino acid assimilation (%) 53.60 53.12
Real degree fermentation (%) 67.30 66.90

3 讨论
本研究通过同源重组, 使酵母染色体上 ADH2
基因内部 DNA片段被 CUP1基因和 GSH1基因所取
代, 获得 1株低 ADHⅡ酶活, 高 GSH含量的啤酒酵
母工程菌, 并初步测定了工程菌的生理生化指标。
在 ADH2 基因内部插入的 GSH1 基因, 使啤酒酵母
工程菌的 GSH 含量增加。由于 GSH 是水溶性的小
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分子多肽, 在啤酒发酵期间, 酵母细胞生成的部分
GSH 能分泌到发酵液。在发酵后期, 部分酵母细胞
发生自溶, 这也能使部分 GSH 释放到发酵液中, 因
此在成品啤酒中的 GSH含量也就相应增加, 提高啤
酒的抗老化能力。ADH2基因被破坏, ADHⅡ酶活降
低, 理论上将使酵母在发酵后期氧化乙醇的能力变
弱, 减少后期乙醛生成的量。同时菌株的发酵能力
并没有明显的变化, 这为下一步低乙醛含量工程菌
的获得提供了实验依据和基础。
经过遗传修饰的啤酒酵母用来发酵生产啤酒 ,
其生物安全性是个重要的问题。本研究利用自克隆
技术, 有针对地对啤酒酵母进行遗传修饰。而且整
个遗传操作过程中涉及到的铜抗性筛选标记基因
CUP1 和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因 GSH1 均来
源于啤酒酵母 YSF31 本身, 没有任何外源基因的参
与, 所以具有生物安全性。获得的基因工程菌具有
重要的应用价值。
参 考 文 献
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稿件书写规范

论文中有关正、斜体的约定

物种的学名：菌株的属名、种名(包括亚种、变种)用拉丁文斜体。属的首字母大写, 其余小写, 属以上
用拉丁文正体。病毒一律用正体, 首字母大写。
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MspⅠ、Sau3AⅠ等。
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基因符号用小写斜体, 蛋白质符号首字母大写, 用正体。