全 文 ：大青叶中靛玉红的提取工艺研究
余陈欢 ,吴巧凤＊ ,盛振华 ,曾晓艳 ,刘丹华
(浙江中医学院药学系 ,浙江杭州 310053)
　　摘要　目的:优选大青叶中靛玉红的最佳提取工艺条件。方法:以靛玉红含量为指标 ,采用正交实验设计法 ,
考察超声法 、回流法不同因素和水平对其提取条件的影响 , 优选最佳提取工艺。并比较超声法 、回流法与传统工艺
对靛玉红提取率的影响 。结果:三种提取方法中 ,超声法提取率最高且方法简便。其最佳工艺条件为 A
1
B
1
C
2
D
3
。
即加 10倍量 60%的乙醇 、超声提取 3次 , 每次 20 min。结论:超声法具有时间短 、收率高 、耗能小 、无需加热等优
点 , 应用前景广阔。
关键词　大青叶;靛玉红;提取工艺;正交实验
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2006)07-0721-03
基金项目:浙江省分析测试基金项目
　　＊通讯作者:吴巧凤(1963-),教授 ,硕士生导师 ,主要从事中药有效成分和质量标准研究 , Email:wqfyjm@sina.com。
　　大青叶为十字花科植物菘蓝 Isatisindigotica
Fort的干燥叶 ,具有清热解毒 ,凉血消斑的功能 ,主
要含靛蓝 、靛玉红等吲哚类成分 ,其生理活性成分靛
玉红具有抗菌抗炎 、抗肿瘤 、增强免疫功能等作
用 〔1、 2〕。其传统提取工艺多为水提醇沉法 ,有效成
分损失较大 〔3〕。为减少有效成分的损失 ,本文采用
正交实验设计 ,以靛玉红含量为考察指标 ,考察醇提
浓度 、溶剂倍量 、提取时间 、提取次数等因素对提取
工艺的影响 ,优选最佳提取工艺条件。并比较了超
声法 、回流法与传统工艺对靛玉红提取率的影响 ,确
定最佳提取方法 。现报道如下 。
1 　仪器与试药
高效液相色谱仪:岛津 LC-10AD液相色谱仪 ,
SPD-10A紫外检测器;METTLERTOLEDOAG135电
子天平(上海天平仪器厂);微量移液器(上海求精
生化试剂仪器有限公司)。
靛玉红对照品(由中国药品生物制品检验所提
供 ,批号为 717-200204),除高效液相用色谱纯外 ,
其余均为分析纯 ,色谱用水为超纯水。大青叶购于
浙江中医学院实验药厂并经植物教研室姚振生教授
鉴定为 IsatisindigoticaFort.的干燥叶 。
2 　方法与结果
2.1 　靛玉红含量测定
2.1.1　色谱条件:ODS-C18 (250 mm×4.6 mm, 5
μm);流动相:甲醇-0.1%醋酸溶液(72∶28);流速:
1.0 ml/min;柱温:28.0℃;检测波长 290 nm(t=
8.720)。
2.1.2　对照品溶液制备:精密称量靛玉红对照品
1.2mg,置 50 ml量瓶中 ,加甲醇-氯仿(80∶20)稀释
至刻度 ,取溶液 2 ml至 10 ml容量瓶中 ,加甲醇 -氯
仿液(80∶20)至刻度 ,摇匀 ,作为对照品溶液 。
2.1.3 　标准曲线的制作:用微量移液器精密吸取
对照品液 500 μl,置 2 ml微量离心管中 ,加甲醇-氯
仿液(80∶20)500 μl稀释 ,摇匀 ,对半稀释后制成若
干份 ,经 0.45 μm微孔滤膜滤过 ,注入液相色谱仪
20 μl,以浓度为横坐标 ,峰面积值为纵坐标 ,进行线
性回归 , 求得回归方程:Y=163728X+26562 , r=
0.9997。结果表明靛玉红在 0.15 ～ 4.8 μg/ml浓度
范围内 ,与峰面积呈良好的线性关系。
2.1.4 　精密度试验:取同一样品溶液 ,连续进样 5
次 ,测定峰面积 ,结果 RSD为 2.46%。
2.1.5 　重现性试验:取同一样品溶液 5份 ,分别按
样品测定条件测定 , 测定峰面积 , 结果 RSD为
2.02%。
2.1.6　稳定性试验:精密吸取对照品溶液 ,分别在
0, 0.5, 1, 2, 4h,测定峰面积 ,结果 RSD为 0.65%。
2.1.7 　加样回收试验:精密吸取已知靛玉红含量
的样品溶液 0.5ml,平行 9份 ,分别精密添加已知浓
度靛玉红对照品适量。依法测定 ,计算回收率 ,结果
平均回收率为 98.14%, RSD为 2.89%。
2.1.8 　含量测定:取 1 ml样品溶液置 25 ml量瓶
中 ,加甲醇 -氯仿液(80∶20)稀释至刻度 , 0.45 μm微
孔滤膜滤过〔4〕。按试验号分别吸取正交实验供试
品溶液 20 μl,注入液相色谱仪中测定含量 。
2.2　提取工艺的研究
2.2.1 　超声提取工艺的研究:平行称取大青叶药
材粉末 5.0 g9份 ,按正交实验表 1选择的因素和水
平超声提取 ,合并提取液 ,过滤 ,定容于 100 ml容量
瓶 ,作为样品溶液 ,备用。依 “2.1.8”项测定靛玉红
含量 ,超声提取正交实验结果及方差分析分别见表
2、表 3。由表 2,表 3可知 ,采用超声提取法 ,以靛玉
红含量为考察指标时 ,各因对大青叶提取工艺影响
·721·中药材第 29卷第 7期 2006年 7月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2006.07.034
的大小为:C>D>B,其中超声时间 ,超声次数对靛
玉红的提取影响有显著差异。而溶剂倍量无显著统
计学意义 ,醇提浓度影响较小 ,当作误差。因而在实
验范围内 ,考虑实际生产成本 ,最佳优选条件组合是
A1B1C2D3 ,即 60%乙醇 、超声 20 min,用 10倍量的
溶剂 ,提取 3次。
2.2.2　回流提取工艺的研究:平行称取大青叶药
材粉末 5.0g9份 ,按正交实验表 4选择的因素和水
平回流提取 ,合并提取液 ,过滤 ,定容于 100 ml容量
瓶 ,作为样品溶液 ,备用 。依 “ 2.1.8”项测定靛玉红
　表 1 　正交实验因素水平表
因素水平 A醇提浓度(%) B溶剂倍量 C超声时间(min) D提取次数(n)
1 60 10 20 1
2 70 15 30 2
3 80 20 40 3
　表 2 　正交实验结果
试验号 A B C D 靛玉红含量(mg/g)
1 1 1 1 1 0.717
2 1 2 2 3 0.890
3 1 3 3 3 0.785
4 2 1 2 3 1.139
5 2 2 3 1 0.751
6 2 3 1 2 0.595
7 3 1 3 2 0.750
8 3 2 2 3 0.823
9 3 3 1 1 0.827
K1 0.797 0.869 0.712 0.765
K2 0.828 0.821 0.952 0.745
K3 0.800 0.736 0.762 0.916
R 0.031 0.133 0.240 0.171
　表 3 　方差分析结果
方差来源 离均差平均方 自由度 均方 F P
A(误差) 0.002 2 0.001 1.000
B 0.027 2 0.014 13.500 >0.05
C 0.097 2 0.049 48.500 <0.05
D 0.052 2 0.026 26.000 <0.05
　　F0.05 =19.00, F0.01 =99.00
　表 4 　正交实验因素水平表
因素水平 A醇提浓度(%) B溶剂倍量 C回流时间(h) D提取次数(n)
1 60 10 1.0 1
2 70 15 1.5 2
3 80 20 2.0 3
含量 ,回流提取正交实验结果及方差分析分别见表
5、表 6。
　表 5 　正交实验结果
试验号 A B C D 靛玉红含量(mg/g)
1 1 1 1 1 0.359
2 1 2 2 2 0.687
3 1 3 3 3 1.072
4 2 1 2 3 0.673
5 2 2 3 1 0.760
6 2 3 1 2 0.639
7 3 1 3 2 0.468
8 3 2 2 3 1.046
9 3 3 1 1 0.481
K1 0.706 0.500 0.681 0.533
K2 0.690 0.831 0.613 0.598
K3 0.665 0.730 0.766 0.930
R 0.041 0.331 0.153 0.397
　表 6 　方差分析结果
方差来源 离均差平均方 自由度 均方 F P
A(误差) 0.002 2 0.001 1.000
B 0.027 2 0.014 13.500 >0.05
C 0.097 2 0.049 48.500 <0.05
D 0.052 2 0.026 26.000 <0.05
　　F
0.05 =19.00, F0.01 =99.00
　　由表 5,表 6可知 ,采用回流提取法 ,以靛玉红
含量为考察指标时 ,各因素对大青叶提取工艺影响
的大小为:D>B>C,其中溶济倍量 ,回流次数对靛
玉红的提取影响有显著差异 。而回流时间无显著统
计学意义 ,醇提浓度影响较小 ,当作误差 。因而在实
验范围内 ,考虑实际生产成本 ,最佳优选条件组合是
A1B1C2D3 ,即 15倍 60%乙醇 、回流 1.0h,提取 3次。
2.3　不同提取方法提取效果比较
2.3.1　超声提取法 、乙醇回流法:称取大青叶药材
粉末 5.0g,按超声 、回流最佳优选条件提取 ,合并煎
液 ,过滤 ,定容于 25ml容量瓶 ,取 1ml溶液置 25ml
量瓶中 ,加甲醇-氯仿 (80∶20)稀释至刻度 ,摇匀 ,
0.45 μm微孔滤膜滤过 ,备用。
2.3.2　传统提取工艺:取大青叶 5.0 g,加 10倍量
水煎煮 2次 , 1.5 h/次 ,合并煎液 ,滤过 ,浓缩至药
材:水 =1∶1,冷却至室温 ,加等量乙醇使沉淀 ,加水
1倍量 ,搅拌 〔5〕 ,在 4000r/min下离心 5min,取上清
液 ,过滤 ,定容于 25 ml容量瓶 ,取 1 ml溶液置 5 ml
量瓶中 ,加甲醇 -氯仿液(80∶20)稀释至刻度 ,摇匀 ,
0.45 μm微孔滤膜滤过 ,备用。
2.3.3 　提取效果比较:取上述溶液各 20 μl注入
·722· 中药材第 29卷第 7期 2006年 7月
液相色谱仪 ,测定结果见表 7。
　表 7 　不同提取方法比较(n=5)
提取方法 靛玉红含量(mg/g) 提取时间(h) 提取速率(mg/h)
超声提取 1.142 1.0 1.142
回流提取 1.030 3.0 0.343
传统提法 0.211 4.0 0.053
3 　讨论
3.1 　试验结果表明 ,超声时间 ,超声次数是超声提
取工艺的主要影响因素 ,对靛玉红的提取影响有显
著差异 。在实验范围内 ,考虑实际生产成本 ,最佳优
选条件组合是 A1B1C2D3 ,即 10倍量的 60%乙醇 、超
声 20 min,提取 3次 ,而溶剂倍量 ,回流次数是回流
提取工艺的主要影响因素 ,对靛玉红的提取影响有
显著差异。因而在实验范围内 ,考虑实际生产成本 ,
最佳优选条件组合是 A1B1C2D3 ,即 15倍量 60%乙
醇 ,回流 1.0 h,提取 3次。
3.2 　本实验过程中曾按上述正交实验选择的因素
和水平 ,考察不同提取因素对大青叶干浸膏得率的
影响 ,但无论超声法还是回流法 ,经方差分析无统计
学意义 ,直观分析仅醇提浓度略有明显差异 ,且与
“3.1”项分析结果相一致 ,其它因素影响极小 ,可作
误差考虑。
3.3 　由表 7可见 ,超声提取法的提取率明显高于
乙醇回流法 、传统提取工艺 。当以靛玉红含量为分
析指标时 ,超声提取法与乙醇回流法在提取效果上
差别不大 ,而两者明显高于传统提取工艺 。在提取
速率方面 ,超声提取要明显高于其它提取方法 ,若以
提取靛玉红含量和提取时间的比值作为提取速率的
表示方法 ,超声提取法是乙醇回流法的 3.35倍 ,是
传统提取工艺的 22.8倍。
与传统方法比较 ,溶剂提取法需要加热 、费时 ,
而超声提取法利用超声振动来提高提取效率 ,具有
操作简单 、省时高效 、污染小 、适用范围广等特点 ,达
到强化与优化传热传质的目的 〔6〕。由于提取时间
短 ,目标组分提取效率比较高 ,并且克服了药材容易
凝聚 、焦化等弊病。作为中药提取的新工艺 ,具有良
好的应用前景 。但超声过程中会产生热量 ,故应注
意超声器内水溶液的温度 ,以免影响提率。
参 考 文 献
[ 1] 肖珊珊 , 金郁 .板蓝根化学成分 、药理及质量控制研究
进展 .沈阳药科大学学报 , 2003, 20(6):455-456.
[ 2] 孙建宇 .大青叶的研究进展 .中国药业 , 2004, 13(8):
79.
[ 3] 李影 .板蓝根冲剂生产过程中的含量变化及工艺改进
设想 .中成药 , 1990, 12(9):8.
[ 4] 徐德然 , 刘学华 ,黄罗生 .板蓝根提取纯化及浓缩干燥
的研究 .海峡药学 , 2004, 16(6):67-69.
[ 5] 中华人民共和国药典委员会 .中国药典 .一部.北京:
化学工业出版社 , 2000:619.
[ 6] 郭锦棠 .微波提取山楂中总黄酮的正交实验研究 .中
国药学杂志 , 2005, 40(2):112.
(2005-12-14收稿)
StudyontheExtractionofIndirubinfromIsatisindigoticaFort
YUChen-huan, WUQiao-feng, SHENGZhen-hua, ZENGXiao-yan, LIUDan-hua
(DepartmentofPharmacy, ZhejiangCollegeofTraditionalChineseMedicine, Hangzhou310053, China)
Abstract　Objective:TostudytheoptimalprocessoftheextractionofindirubinfromIsatisindigoticaFort.Methods:Theprocess
wasstudiedbysupersonicextraction, refluxingandorthogonaldesignwiththecontentofindirubinasthedetectivemarker.Thenthe
extractionofindirubinwithsupersonicextractionandothermethodswerecomparedbasingontheyieldofextracts.Results:Among
them, thesupersonicextractionwasthesimplestandthemostrapidandthemostcompleteinextraction.Andtheoptimalconditions
wereA1B1C2D3:supersonicextractionwith60% ethanol, 1 hour, 10-foldsolventand3 times.Conclusion:Thesupersonicextraction
canextractmoreindirubinfromIsatisindigoticaFortinshortertimewithlessenergy.Italsoshowsapromisingprospectforleachingthe
effectiveconstituentsfromChineseherbalmedicinebysupersonicextraction.
Keywords　IsatisindigoticaFort;Indirubin;Extraction;Orthogonalexperiment
·723·中药材第 29卷第 7期 2006年 7月