全 文 ：罗汉果蛋白酶对酒糟中蛋白质的水解作用研究
苏小建 ,秦少艳 ,李 敏 ,黄世好 ,谢丽霞 ,黄继来　(广西师范大学 ,广西桂林 541004)
摘要　[目的]为酒糟中蛋白质的水解提供新方法。 [方法]采用酶解法 ,用罗汉果蛋白酶提取酒糟中的蛋白质 , 测定酶解酒糟上清液中
蛋白质的含量 ,计算单位体积蛋白质增量。在加酶量 、酶解温度 、酶解时间、pH值单因子试验的基础上 ,采用正交试验确定酒糟中蛋白
质的最佳提取条件。 [结果 ]各因素对单位体积蛋白质增量的影响依次为:pH值>水解时间>加酶量>水解温度。酶解酒糟的最佳条
件为:pH值 8.0,水解时间 10min,加酶量 0.75ml/100g湿酒糟 , 温度 65 ℃。在最佳条件下 ,单位体积蛋白质增量可达 98.78%。 [结
论]该研究确定了酶解法提取酒糟中蛋白质的最优条件 ,使酶解上清液中蛋白质含量增加了近 1倍。
关键词　酒糟;罗汉果蛋白酶;单位体积蛋白质增量;正交试验
中图分类号　S567　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2010)36-20743-03
ResearchontheHydrolysisofProteasefromGrosvenormomordicaFruitonProteininLees
SUXiao-jianetal　(GuangxiNormalUniversity, Guilin, Guangxi541004)
Abstract　[Objective] Thepurposeoftheresearchwastoprovidenewmethodforhydrolysisofproteininlees.[ Method] TheproteasefromGros-
venormomordicafruitwasusedinenzymolysismethodforextractingproteinfromlees, theproteincontentinsupernatantofhydrolyzedleeswas
determinedandtheproteinincrementperunitvolumewascalculated.Basedonsinglefactorexperimentsonenzymedosage, enzymolysistempera-
ture, enzymolysistimeandpHvalue, theoptimumextractionconditionforproteininleeswasconfirmedthroughorthogonaltest.[Result] Thein-
fluenceofvariousfactorsonproteinincrementperunitvolumewasasfolows:pHvalue>hydrolysistime>enzymedosage>hydrolysistempera-
ture.Theoptimumconditionsforenzymolysisofleeswereasfolows:thepHvaluewas8.0, thehydrolysistimewas10min, theenzymedosage
was0.75ml/100gwetleesandthetemperaturewas65℃.Underoptimumconditions, theproteinincrementperunitvolumecouldreach98.
78%.[ Conclusion] Theoptimumconditionsforextractingproteinfromleesbyusingenzymolysismethodwereconfirmedinthisresearchandthe
proteincontentinhydrolyzedsupernatantwasincreasedforabout1multiple.
Keywords　Lees;ProteasefromGrosvenormomordicafruit;Proteinincrementperunitvolume;Orthogonaltest
作者简介　苏小建(1957-),男 , 广西桂林人 , 高级工程师 ,从事天
然产物研究与开发工作。
收稿日期　2010-09-19
　　酒糟是制酒工业的主要副产物 ,其中含有比较丰富的蛋
白质。酒糟中蛋白质的提取方法有 3种:醇 -碱法 [ 1] 、碱
法 [ 2]和酶解法 [ 3] ,前 2种方法反应条件剧烈;酶解法简便易
行 ,成本低 ,不需要特殊设备 ,污染少 ,反应条件温和 ,对蛋白
质的影响小。笔者采用酶解法研究罗汉果蛋白酶酶解酒槽
的最佳条件。
1　材料与方法
1.1　材料　酒糟 ,桂林三花酒股份公司提供;罗汉果蛋白酶
(存放于冰箱的冷冻层中),桂林思特新技术公司提供 。
1.2　方法
1.2.1　酒糟含水量测定 。取洁净的称量瓶置于 105 ℃干燥
箱中加热 1.0h,取出盖好 ,置干燥器内冷却 0.5 h,称量 ,并
重复干燥至恒重。称取一定质量的米酒酒糟放入称量瓶中 ,
加盖 ,精密称量后置于 105 ℃干燥箱中 ,瓶盖斜支于瓶边 ,干
燥 4.0 h后盖好取出 ,放入干燥器内冷却 0.5 h后称量。再
放入 105℃干燥箱中干燥 1.0h,取出 ,放干燥器内冷却 0.5h
后再称量 。
酒糟含水量(%)=(m终 -m1)/(m1 -m0)×100
表 1　含水量测定结果
Table1　Moisturecontentdeterminationresult
试验号
TestNo. m0∥g m1∥g m终∥g
含水量∥%
Water
content
平均值∥%
Mean
1 17.806 27.373 18.574 91.970
2 28.356 40.177 29.315 91.890 91.93
　　由表 1可知 ,酒糟中固体含量为 8.07%。
1.2.2　酶解酒糟上清液中蛋白质含量测定。采用凯氏定氮
法 [ 4]测定干酒糟蛋白质含量为 16.44 g/100 g,罗汉果蛋白酶
蛋白质含量为 4.325 g/100 g。考马斯亮蓝染色法 [ 4]测定酶
解酒糟上清液蛋白质含量 ,进而计算单位体积蛋白质增量。
(1)标准曲线的绘制:称取 10 mg牛血清白蛋白于
100 ml蒸馏水中 ,至标准蛋白质浓度为 0.1 mg/ml,按表 2依
次加入各试剂。
表 2　标准曲线溶剂配加量
Table2　Solventwithadditionofstandardcurve
试剂 Reagent 0 1 2 3 4 5
0.1mg/ml牛白蛋白溶液 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0.1mg/mlbovinealbumensolution
蒸馏水∥mlDistiledwater 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
考马斯亮蓝∥ml 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
Coomassiebriliantblue
　　按表 2加入试剂后 ,加入考马斯亮蓝 G-250,摇匀 ,放置 2
min后在 595nm处比色测定 A595 ,以蛋白质含量(mg)为横坐
标 , A595为纵坐标 ,绘制标准曲线。
(2)样品测定:在试管中加入蛋白质样品 1.0 ml,然后加
入 5.0ml考马斯亮蓝 G-250并混匀 ,放置 5min后于 595 nm
处比色 ,记录 A595 ,根据所测 A595从标准曲线上查得蛋白质的
量 ,计算单位体积蛋白质增量 。
单位体积蛋白质增量(%)=(m-m酶 -m0 )/m0 ×100
式中 , m为 1.0ml酶解液中蛋白质的总量;m酶为 1.0ml酶解
液中蛋白酶所带入的蛋白质量;m0为水解前原酒糟 1.0 ml
上清液中蛋白质的总量 。
1.2.3　单因子试验。
1.2.3.1　最适加酶量的确定。称取罗汉果蛋白酶 200mg溶
于 200ml容量瓶中 ,即酶浓度为 1 mg/ml。
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2010, 38(36):20743-20745 责任编辑　常俊香　责任校对　况玲玲
取 20 g湿酒糟 ,加入 10ml蒸馏水 ,然后加入 2 ml缓冲
液 ,调节 pH值为 7,反应温度为 60℃,水解时间为 10min,加
酶量依次为:0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 ml,考察加酶量对单
位体积蛋白质增量的影响。
1.2.3.2　最适酶解温度的确定。取 20g湿酒糟 ,加入 10 ml
蒸馏水和 2ml缓冲液 ,调节 pH值为 7,加酶量为 0.10 ml,水
解时间为 10 min,调节温度依次为:55、60、65、70、75 ℃,考察
温度对单位体积蛋白质增量的影响。
图 1　牛白蛋白标准曲线
Fig.1　Standardcurveofbovinealbumin
1.2.3.3　最适 pH值的确定。取 20g湿酒糟 ,加入 10 ml蒸
馏水和 2ml缓冲液 ,加酶量为 0.10ml,调节温度为 60 ℃,水
解时间为 10 min,调节 pH值依次为:6.0、7.0、7.5、8.0、8.5,
考察 pH值对单位体积蛋白质增量的影响。
1.2.3.4　最适水解时间的确定。取 20g湿酒糟 ,加入 10 ml
蒸馏水和 2ml缓冲液 ,加酶量为 0.10 ml,调节温度为 60℃,
pH值为 7.0,水解时间分别为 5、10、15、20、25 min,考察水解
时间对单位体积蛋白质增量的影响。
1.2.4　正交试验。采用正交试验对影响罗汉果蛋白酶酶解
米蛋白的主要因素进行优化 ,试验拟定加酶量 [ ml/100g(湿
酒糟)] 、温度(℃)、pH值 、水解时间(min)4个因素 ,每因素
各设置 3个水平(表 3),依据正交表 L9(34)进行试验 。
表 3　正交试验 L9(34)因素及水平
Table3　FactorsandlevelsoforthogonalL9(34)
水平Level
因素 Factors
温度(A)℃Temperature
pH值(B)pHvalue
加酶量(C)ml/100g(湿酒糟)Enzymeaddedamount
水解时间(D)minHydrolysistime
1 60 7.0 0.75 5
2 65 7.5 1.00 10
3 70 8.0 1.25 15
2　结果与分析
2.1　单因子试验结果
2.1.1　最适加酶量。由图 2可知 ,罗汉果蛋白酶的最适加
酶量为 0.20ml,即 1.00 ml/100 g(湿酒糟)。单位体积蛋白
质增量随加酶量的增加而增大 ,当加酶量大于 0.20ml时 ,单
位体积蛋白质增量趋于稳定。
2.1.2　最适酶解温度。由图 3可知 ,单位体积蛋白质增量
随温度的升高呈抛物线形变化 ,罗汉果蛋白酶的最适酶解温
度为 65℃左右。温度升高水解速度加快 ,但温度过高罗汉
果蛋白酶会发生变性 ,酶活力迅速下降。温度影响酶的稳定
性 、酶蛋白的热变性 、酶和底物的结合 [ 5] 。
图 2　加酶量对单位体积蛋白质增量的影响
Fig.2　Theinfluenceofaddingenzymequantitytotheunitvol-
umeincrementofprotein
图 3　温度对单位体积蛋白质增量的影响
Fig.3　Theinfluenceoftemperaturetotheunitvolumeincre-
mentofprotein
2.1.3　最适 pH值。由图 4可知 ,罗汉果蛋白酶水解酒糟的
最佳 pH值为 8.0左右 。罗汉果蛋白酶是一种蛋白质 ,其在
水解体系中的解离状态和行为均受 pH值的影响。在水解过
程中 ,要适当控制水解体系的 pH值 ,使蛋白酶表现出最大
活力 [ 6] 。
图 4　pH值对单位体积蛋白质增量的影响
Fig.4　TheinfluenceofpHvaluetotheunitvolumeincrementof
protein
2.1.4　最适水解时间。由图 5可知 ,罗汉果蛋白酶水解酒
糟的最佳时间为 10min。当反应时间超过 10min后 ,单位体
积蛋白质增量上升趋势平缓。
2.2　正交试验结果　由表 4可知 ,各因素对罗汉果蛋白酶
水解酒糟的影响依次为:pH值 >水解时间 >加酶量 >温度。
20744 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2010年
以单位体积蛋白质增量为主要考核指标进行极差分析 ,得最
佳组合为 A2 B3C1D2 ,即罗汉果蛋白酶水解米酒糟的最佳条
件为:pH值 8.0,水解时间 10 min,加酶量 0.75 ml/100g(湿
酒糟),温度 65 ℃。
3　结论
水解工艺对单位体积蛋白质增量的影响依次为:pH值 >
水解时间 >加酶量 >温度 ,罗汉果蛋白酶水解米酒糟的最佳
条件为:pH值 8.0,水解时间 10 min,加酶量 0.75 ml/100g
(湿酒糟),温度 65℃。得最佳条件下 ,单位体积蛋白质增量
为 98.78%,酶解上清液中的蛋白质含量增加了接近 1倍。
该工艺在制酒工业中具有很大的发展空间 ,可实现经济的最
优化。
图 5　水解时间对单位体积蛋白质增量的影响
Fig.5　Theinfluenceofhydrolisistimetotheunitvolumeincre-
mentofprotein
表 4　正交试验L9(34)结果
Table4　ResultoforthogonaltestL9(34)
水平
Levels
因素 Factors
温度(A)∥℃
Temperature
pH值(B)
pHvalue
加酶量(C)∥ml/100g(湿酒糟)
Enzymeaddedamount
水解时间(D)∥min
Hydrolysistime
单位体积蛋白质增量∥%
Unitvolumeincrementofprotein
1 60 7.0 0.15 5 53.66
2 60 7.5 0.20 10 78.05
3 60 8.0 0.25 15 82.93
4 65 7.0 0.20 15 59.76
5 65 7.5 0.25 5 68.34
6 65 8.0 0.15 10 98.78
7 70 7.0 0.25 10 62.20
8 70 7.5 0.15 15 84.99
9 70 8.0 0.20 5 79.37K1 71.55 58.54 79.14 67.12K2 75.63 77.13 72.39 79.68K3 75.52 87.03 71.16 75.89R 4.08 28.49 7.98 12.56
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(上接第 20734页)
　　由表 3的极差分析可知 ,影响香蕉菠萝复合果酒发酵工
艺的主次因素顺序为:初始含糖量 >发酵温度 >NaHSO3用
量 >发酵 pH值。理论上最佳组合应为 A2B3 C2 D3 ,即初始含
糖量 30%、发酵温度 25 ℃、NaHSO3用量 100 mg/L、发酵 pH
值 4.5。然而 ,表 3中的均值显示 , 3种水平的发酵 pH值对
香蕉菠萝复合果酒的综合评价指标影响极小 ,从简化工艺程
序考虑 ,发酵 pH值宜选择与果汁酸度较接近的 4.0;此外 ,
表 3中的均值显示 , 3种水平的 NaHSO3用量对香蕉菠萝复合
果酒的酒度生成影响不大 ,而且 NaHSO3加入过多会造成果酒
的风味及口感变差 [ 4] ,因此 , NaHSO3用量宜选择 80 mg/L。最
终确定优化的发酵工艺条件的最佳组合为 A2 B3 C1D2 ,即初
始含糖量 30%、发酵温度 25 ℃、NaHSO3用量 80 mg/L、发酵
pH值 4.0。
3　结论　
(1)在固定化酵母发酵条件下 ,采用 1∶1的香蕉与菠萝
的原料配比来发酵酿制的香蕉菠萝复合果酒的品质最佳。
(2)在固定化酵母发酵条件下 ,影响香蕉菠萝复合果酒
酒度生成的主次因素顺序为:初始含糖量 >发酵温度 >
NaHSO3用量 >发酵 pH值。
(3)利用固定化酵母酿造香蕉菠萝复合果酒的最佳发酵
工艺条件为:初始含糖量 30%、发酵温度 25℃、NaHSO3用量
80mg/L、发酵 pH值 4.0,在此条件下生产的果酒色泽美观 、
香气突出 、口感醇厚 ,具有典型的香蕉 、菠萝果酒风格。
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2074538卷 36期　　　　　　　　　　　　　　　　苏小建等　罗汉果蛋白酶对酒糟中蛋白质的水解作用研究