全 文 ：华北农学报·2014，29 ( 2 ) : 98 -103
收稿日期:2013 － 10 － 12
基金项目:内蒙古农业大学博士科研启动基金(BJ07-50) ;内蒙古自治区高等学校创新团队发展计划项目 (NMGIＲT1106)
作者简介:苏 蕊(1980 －) ，女，内蒙古巴彦淖尔人，讲师，博士，主要从事动物遗传育种研究。
通讯作者:武瑞兵(1982 －) ，男，内蒙古呼和浩特人，讲师，博士，主要从事分子遗传学研究。
李金泉(1957 －) ，男，内蒙古呼和浩特人，教授，博士生导师，主要从事绒山羊遗传育种研究。
日粮中添加小黑麦干酒糟对肉牛瘤胃
5 种代表性菌比例的影响
苏 蕊1，杨 钟2，丽 春3，张 岩4，赵鹏伟4，武瑞兵5，李金泉1
(1．内蒙古农业大学 动物科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018;2．呼和浩特疾病预防控制中心，内蒙古 呼和浩特 010070;
3．内蒙古民族大学 动物科学技术学院，内蒙古 通辽 028000;4．内蒙古医科大学 基础医学院，内蒙古 呼和浩特 010110;
5．内蒙古医科大学 生物化学与分子生物学教研室，内蒙古 呼和浩特 010110)
摘要:旨在检测以小黑麦干酒糟及其可溶物(TDDGS)替代肉牛日粮中的所有粗料和部分精料对 5 种瘤胃代表性
菌(Fibrobacter succinogenes、Succinovibrio dextrinosolvens、Selenomonas ruminantium、Megasphaera elsdenii 和 Prevotella ru-
minicola)比例的影响。利用 Ｒeal-time PCＲ法检测了饲喂 TDDGS前后 5 种瘤胃代表性菌数量百分比的变化。结果表
明，30% TDDGS组与对照组相比，瘤胃中 F． succinogenes、S． ruminantium和 M． elsdenii菌数量百分比均有升高，分别显
著升高 3 倍(P﹤ 0． 05)、10 倍(P﹤ 0． 05)和 2 倍(P﹤ 0． 05)，而 S． dextrinosolvens和 P． ruminicola菌数量百分比却都
降低了，但差异均不显著。
关键词:肉牛;Ｒeal-time PCＲ;瘤胃微生物;小黑麦;干酒糟;可溶物
中图分类号:S858． 23 文献标识码:A 文章编号:1000 － 7091(2014)02 － 0098 － 06
Quantitative Analysis of Five Selected Ｒumen Bacteria upon Incorporation
Triticale Dried Distillers Grains with Solubles in Beef Cattle Diets
SU Ｒui1，YANG Zhong2，LI Chun3，ZHANG Yan4，
ZHAO Peng-wei4，WU Ｒui-bing5，LI Jin-quan1
(1． College of Animal Science，Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010018，China;
2． Huhhot Center for Control and Prevention，Huhhot 010070，China;
3． College of Animal Science and Technology，Inner Mongolia University for the Nationalities，
Tongliao 028000，China;4． School of Preclinical Medicine，Inner Mongolia Medical University，
Huhhot 010110，China;5． Department of Biochemistry and Molecular Biology，
Inner Mongolia Medical University，Huhhot 010110，China)
Abstract:The aim of this study was to explore the effects of triticale dried distillers grains with solubles (TD-
DGS)incorporation in beef cattle diets on the relative abundance of five rumen bacteria viz．，Fibrobacter succino-
genes，Succinovibrio dextrinosolvens，Selenomonas ruminantium，Megasphaera elsdenii and Prevotella ruminicola． Ｒeal-
time PCＲ was used to detect the gene expression of these five rumen bacteria． As compared with control group，the
results showed that the relative abundance of F． succinogenes，S． ruminantium and M． elsdenii in 30% TDDGS group
increased，and a 3-fold (P ＜ 0． 05)，a 10-fold (P ＜ 0． 05)and a 2-fold (P ＜ 0． 05)significant increase were ob-
served respectively，however，the relative abundance of S． dextrinosolvens and P． ruminicola decreased in 30% TD-
DGS group but no significant differences were found．
Key words:Cattle;Ｒeal-time PCＲ;Ｒumen microorganisms;Triticale;Dried distillers grains;Solubles
瘤胃内具有非常复杂共生的微生物区系，可将 饲料发酵分解成挥发性脂肪酸(VFA)的混合物，而
2 期 苏 蕊等: 日粮中添加小黑麦干酒糟对肉牛瘤胃 5 种代表性菌比例的影响 99
这是反刍动物主要的能量来源。另一方面，瘤胃当
中的微生物组成、菌群结构、菌群数量等均受诸多因
素影响，包括日粮组成及结构、饲养环境等，其中日
粮组成是最重要的因素［1 － 3］。基于此，探讨不同日
粮条件下瘤胃微生物的数量变化将为研究瘤胃微生
态研究及发酵等研究提供试验依据。小黑麦是一种
具有高适应能力和耐寒的植物，是由小麦和黑麦杂交
培育而成，其谷粒的淀粉含量达到 63%［4］。因此，小
黑麦被视作一种潜在的酒精工业碳水化合物来源，而
发酵的副产物小黑麦干酒糟及其可溶物(TDDGS)可
被用作一种新的动物饲料。另据文献报道，谷物中的
淀粉经发酵后，其发酵副产品酒糟及包括蛋白质、中
性洗涤纤维(NDF)和脂肪等在内的可溶物(DGS)中
的含量较发酵之前均提高了 3倍左右［5］。
通常，DGS 作为纤维和蛋白来源，被用作动物
饲料精料的替代料［6 － 8］。有研究表明，日粮中添加
TDDGS作为蛋白和纤维来源，对动物的生长和生产
性能均没有负面影响［9］。此外，Fron等［10］报道了日
粮中添加玉米 DGS 增加了淀粉和乳酸利用菌数量，
但降低了瘤胃中总的原虫数量。同时，已有的研究
表明，日粮中添加 DGS 增加了淀粉和乳酸利用菌数
量，提高了瘤胃发酵［8］。但是，目前关于 TDDGS 对
瘤胃微生物菌群数量影响的研究非常少，尤其是关
于目标菌数量占瘤胃总细菌数量百分比的研究鲜有
报道。本研究以 TDDGS 作为纤维和蛋白来源替代
肉牛日粮中的所有粗料和部分精料，以检测对肉牛
瘤胃中 5 种代表性菌(Fibrobacter succinogenes、Succi-
novibrio dextrinosolvens、Selenomonas ruminantium、Me-
gasphaera elsdenii 和 Prevotella ruminicola)含量的影
响，旨在为揭示反刍动物瘤胃发酵机制奠定一定的
理论和试验基础。
1 材料和方法
1． 1 试验动物、日粮及管理
本试验选取 8 头装有永久性瘤胃瘘管且体重为
(457 ± 36)kg的健康肉牛(加拿大农业食品部列桥
研究中心试验牛场)，自由饮水，每天 8:00 时饲喂 1
次。8 头牛随机被分成 2 组，分别饲喂不同的 2 种
日粮(表 1) :①对照组(0% TDDGS) :85%干轧大麦
全混合日粮，5%矿物质维生素添加剂，10%大麦青
贮;②试验组(30% TDDGS):65%干轧大麦全混合
日粮，30% TDDGS和 5%矿物质维生素添加剂。试
验周期为 28 d。
1． 2 瘤胃微生物宏基因组 DNA的提取
1． 2． 1 瘤胃液及其内容物的采集 肉牛饲喂 28 d
表 1 日粮组成和营养水平
Tab． 1 Ingredients and nutrient composition
of beef cattle diets
项目
Item
主要成分
Main ingredients
对照组
Control
试验组
Case
原料
Ingredients
营养成分
Nutrient
composition
干轧大麦全混合日粮 85 65
大麦青贮 10 0
矿物质和维生素 5 5
粗蛋白 /% 13． 4 19． 7
中性洗涤纤维 /% 23． 6 22． 2
酸性洗涤纤维 /% 8． 0 7． 9
淀粉 /% 51． 4 44． 0
Ca /% 0． 78 0． 87
P /% 0． 41 0． 58
后，晨饲前采集对照组和试验组瘤胃背囊、腹囊以及
中间随机 2 点瘤胃液和内容物的混合物各 250 mL，
并迅速置于冰上。然后将这 4 点采集到的瘤胃液及
内容物混入同一灭菌塑料袋中，在 4 ℃条件下于高
效自动均质器 Stomacher中充分混匀，接着弃上清将
沉淀另装入无菌塑料管中 － 80 ℃保存，以备提取
DNA［11］。以上操作均在无菌条件下完成，并且采样
过程中每次更换动物时都更换一次无菌手套。
1． 2． 2 瘤胃微生物宏基因组 DNA提取 按照土壤
宏基因组 DNA 提取试剂盒(Power Soil DNA Kit)的
说明书，称取所收集的瘤胃液及瘤胃内容物混合物
沉淀 0． 5 g，提取宏基因组 DNA［12］。
1． 3 PCＲ扩增
1． 3． 1 引物设计 Fibrobacter succinogenes 和 Sele-
nomonas ruminantium菌的特异性引物由查阅文献所
得［13］，Succinovibrio dextrinosolvens、Megasphaera elsde-
nii和 Prevotella ruminicola菌以及 Domain bacteria的
特异性引物［14］见表 2。
1． 3． 2 16S rＲNA 基因的 PCＲ 扩增 用普通 PCＲ
检测引物的特异性，PCＲ 扩增体系为 25 μL，其中
上、下游引物各为 2，2. 5 μL，1 倍 PCＲ反应缓冲液，
dNTP 0. 5 μL，Ex Taq DNA 聚合酶 0. 5 μL，模板
DNA 1 μL。剩余体积用灭菌 ddH2O补足至 25 μL。
扩增参数为:95 ℃，变性 2 min;95 ℃，1 min，不同退
火温度 (表 2)，30 s;72 ℃延伸 1 min;35 个循环。
1． 3． 3 Ｒeal-time PCＲ检测 目标菌的 PCＲ 产物经
纯化后与 pDrive载体(QIAGEN，Canada)连接，转化至
感受态细胞 DH5α，进行克隆培养，随机挑选白斑菌落。
按质粒 DNA提取试剂盒说明书提取重组质粒(QIA-
GEN，Canada)。PCＲ鉴定阳性克隆，引物详见表 2。5
种菌的阳性克隆进行测序，在 GenBank 上进行序列的
BLAST同源性分析，将所测序列与标准菌株同源性大
于 99%的视作这段序列为目标菌的特异序列。
100 华 北 农 学 报 29 卷
表 2 瘤胃细菌 PCＲ反应的引物及 Tm值
Tab． 2 PCＲ primers and Tm values for detection of rumen bacteria
目标菌
Target bacteria
产物大小 /bp
Size
引物
Primers (5→ 3)
退火温度 /℃
Temperature
Prevotella ruminicola 74
F:GAAAGTCGGATTAATGCTCTATGTTG
Ｒ:CATCCTATAGCGGTAAACCTTTGG
59
Fibrobacter succinogenes 445
F:GGTATGGGATGAGCTTGC
Ｒ:GCCTGCCCCTGAACTATC
62
Selenominas ruminantium 513
F:TGCTAATACCGAATGTTG
Ｒ:TCCTGCACTCAAGAAAGA
53
Megasphaera elsdenii 95
F:AGATGGGACAACAGCTGGA
Ｒ:CGAAAGCTCCGAAGAGCC
59
Succinivibrio dextrinosolvens 73
F:CGTCAGCTCGTGTCGTGAGA
Ｒ:CCCGCTGGCAACAAAGG
59
Domain bacteria 470
F:ACTCCTACGGGAGGCAG
Ｒ:GACTACCAGGGTATCTAATCC
48
测定 5 种菌的阳性克隆质粒 DNA 的浓度，将 5
种菌的质粒 DNA 作为标准品。然后对标准品进行
梯度稀释，绘制标准曲线。按照 Yu 等［15］的方法计
算 16S rＲNA基因拷贝数，详细计算方法见公式:
16S rＲNA(copy /mL)=
16S rＲNA concentration(g /mL)×6 ×1023(copy /mole)
16S rＲNA amplicon size(bp)×660(g 16S rＲNA/mole /bp)
目标菌的相对 16S rＲNA 基因拷贝数百分比是
按照 Weimer 等［16］的方法计算的，即由目标菌的
16S rＲNA基因拷贝数与瘤胃总的细菌(Domain bac-
teria)16S rＲNA基因拷贝数的比值求得。
以 Fibrobacter succinogenes 为例，标准曲线配制
为 2． 63 × 107 ～ 2． 63 × 100 拷贝的 10 倍序列稀释。
以质粒为模板，进行 PCＲ反应，共 8 个梯度，每梯度
3 个重复。同时设立空白对照，ＲT-PCＲ 反应条件:
95 ℃变性 10 min;95 ℃ 15 s，59 ℃ 1 min，72 ℃ 90
s，45 个循环;72 ℃延伸 10 min。反应体系:2 × Mas-
terMix 6． 25 μL，20 μmol /L F 引物 0． 31 μL，20
μmol /L Ｒ 引物 0． 31 μL，ddH2 O 4． 44 μL，模板
1 μL，2 μmol /L reference dye 0． 19 μL。Fibrobacter
succinogenes菌的标准曲线，标准曲线方程及标准曲
线 r2见图 1。
1． 3． 4 目标菌未知样品的检测 Ｒeal-time PCＲ 反
应体系为 12． 5 μL，6． 25 μL的 2 × MasterMix (包括
Ｒeaction Buffer、Surestart Taq 酶、SYBＲ Green Ⅰ染
料、MgCl2和 dNTPs)，正向、反向引物各 0． 31 μL，模
板为 1 μL。反应条件:Prevotella ruminicola、Succini-
vibrio dextrinosolvens 和 Megasphaera elsdenii:95 ℃变
性 10 min;95 ℃ 15 s，59 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，45个循
环;72 ℃延伸 10 min;Selenominas ruminantium:95 ℃
变性 10 min;95℃ 15 s，53 ℃ 30 s;72 ℃ 30 s，45个循
y=-3.194x+10.02；r2=0.99735
30
25
20
15
10 0 1 2 3 4 5 6 7 8
Fibrobacter succinogenes拷贝数对数值
lg copies
循
环
数
CT
图 1 Ｒeal-time PCＲ标准曲线定量
Fig． 1 Standard curve obtained by using Ｒeal-time PCＲ
环;72 ℃延伸 10 min;Fibrobacter succinogenes:95 ℃
变性10 min;95℃ 15 s，62℃ 30 s;72 ℃30 s，45 个循
环;72 ℃延伸 10 min。
1． 4 数据分析
采用 SAS 9． 2 软件的 MIXED procedure 程序按
照完全随机法对试验数据进行了统计分析，其中日
粮作为固定效应。
2 结果与分析
2． 1 宏基因组 DNA的提取
瘤胃微生物宏基因组 DNA 的琼脂糖凝胶电泳
结果显示，所提取的基因组 DNA 大小为 9 ～ 23 kb
(图 2)，OD260 /280值为 1． 8 ～ 2． 0，浓度在 100 ng /μL
以上，纯度达到了后续试验的要求。
2． 2 16S rＲNA目的片段扩增
参考文献报道引物进行常规 PCＲ检测，纯化后
的 5 种菌基因组 DNA 和待测样品中均能扩增出目
的片段，结果见图 3。
2 期 苏 蕊等: 日粮中添加小黑麦干酒糟对肉牛瘤胃 5 种代表性菌比例的影响 101
M 1 2 3 4 5 6 7 8
23 130 bp
9 416 bp
6 556 bp
4 361 bp
2 322 bp
2 027 bp
564 bp
M． DNA Marker，Lambda DNA /Hind Ⅲ;1 ～ 4．
对照组 (饲喂 CG) ;5 ～ 8．试验组(饲喂 30% TDDGS)。
M． DNA Marker，Lambda DNA /Hind Ⅲ;
1 － 4． Control group (CG);5 － 8． Case group(30% TDDGS)．
图 2 肉牛瘤胃微生物 DNA电泳条带
Fig． 2 Ｒesults of agarose gel electrophoresis of total DNA
extracted from rumen contents of beef cattle
M 1 2 3 4 5
500 bp
100 bp
50 bp
M． DNA Marker，50 bp Ladder;1 ～5．菌种 F． succinogenes (445 bp)、
S． ruminantium (513 bp)、S． dextrinosolvens (73 bp)、
M． elsdenii (95 bp)和 Prevotella ruminicola (74 bp)。
M． DNA Marker，50 bp Ladder;Lane 1 － 5．
F． succinogenes (445 bp)，S． ruminantium (513 bp) ，
S． dextrinosolvens (73 bp) ，M． elsdenii (95 bp)
and Prevotella ruminicola (74 bp)．
图 3 五种菌目标片段基因组 DNA扩增
Fig． 3 Amplification of five bacterial target fragments
with genomic DNA template
2． 3 待测样品定量结果
5 种菌的溶解曲线均未检测到其他杂峰，说明
无引物二聚体和非特异性条带。所检测样品的 CT
值介于 16 ～ 34，且均在标准曲线扩增范围之内。
从图 4 中可以看出，F． succinogenes 菌在 30%
TDDGS组(0． 03%)与对照组 (0． 007%)相比，拷贝
数占瘤胃总的细菌 16S rＲNA 基因拷贝数百分比显
著(P ﹤ 0． 05)升高，升高了 3 倍。类似于 F． succi-
nogenes，S． ruminantium在 30% TDDGS 组(0． 32%)
与对照组 (0． 03%)相比拷贝数百分比显著(P ﹤
0． 05)升高，升高 10 倍，并且 M． elsdenii 在 30% TD-
DGS组(0． 01%)与对照组 (0． 004%)相比拷贝数百
分比也显著(P﹤ 0． 05)升高，升高了 2 倍。相反，S．
dextrinosolvens在 30% TDDGS(0． 48%)组与对照组
(1． 14%)相比，拷贝数百分比降低且差异不显著。类
似于 S． dextrinosolvens，P． ruminicola 在 30% TDDGS
(0． 09%)组与对照组 (0． 14%)相比，拷贝数百分比
也降低了，并且差异也不显著。
0.04
0.03
0.02
0.01
0
16
S
rR
NA
基
因
拷
贝
数
百
分
比
/%
Th
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ge
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of
16
S
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1.2
0.8
0.4
0
0.012
0.008
0.004
0
a
b
b
0.04
0.03
0.02
0.01
0
a
b
0.16
0.12
0.08
0.4
0
a
a
A B C D E
对照组
30% TDDGS组
F.succinogenes S.dextrinosolves S.ruminantium M.elsdenii P.ruminicola
b
a
a
a
不同字母代表试验组(30% TDDGS)和对照组表达量差异性显著的情况(P﹤ 0． 05)。
Significant differences between diets (control and 30% TDDGS)(P﹤ 0． 05)are noted by different lower case letters within each organism．
图 4 两种日粮下 5 种菌 16S rＲNA基因拷贝数百分比变化
Fig． 4 Mean values of relative population sizes of (A)F． succinogenes，(B)S． dextrinosolvens，
(C)S． ruminantium，(D)M． elsdenii and (E)P． ruminicola from animals(n =4)fed control and 30% TDDGS
3 讨论
本研究利用 ＲT-PCＲ 法检测了以 TDDGS 替代
肉牛日粮中的所有粗料和部分精料对 5 种瘤胃代表
性菌(Fibrobacter succinogenes、Succinovibrio dextrino-
solvens、Selenomonas ruminantium、Megasphaera elsde-
nii和 Prevotella ruminicola)数量百分比的影响。从
试验设计的角度，本试验中观察到的 5 种菌数量百
102 华 北 农 学 报 29 卷
分比的变化趋势，需要从两方面来解释。30% TD-
DGS组与对照组相比，首先日粮中谷物含量下降了
20%(表 1);其次，日粮中全部大麦青贮都由 TD-
DGS替代，导致日粮精粗比从 90∶ 10(对照组)变为
100∶ 0(30% TDDGS 组)。本试验中，F．succinogenes
菌在 30% TDDGS 组拷贝数百分比显著高于对照
组，这与 F．succinogenes会随着瘤胃中可发酵纤维含
量升高，其在瘤胃发酵中的作用越来越重要的事实
相一致。此外，Stewart 等［17］和 Tajima 等［13］也都报
道了 F．succinogenes 对高纤维日粮的发酵具有重要
作用。
对于 S．dextrinosolvens和 S．ruminantium来说，这
2 种菌在 2 种日粮下的平均拷贝数百分比在 5 种菌
中占主导地位，这与前人的报道相一致。Tajima
等［13］发现当给奶牛饲喂高精料日粮时，S．dextrino-
solvens和 S．ruminantium 这 2 种菌在瘤胃中大量存
在，为瘤胃中的主导优势菌种。此外，本试验中 M．
elsdenii和 S．ruminantium菌在 30% TDDGS组拷贝数
百分比均显著高于对照组，而 S．dextrinosolvens 菌却
是 30% TDDGS 组低于对照组。瘤胃微生态环境
中，S． dextrinosolvens 菌被认为参与降解及利用淀
粉［18］，而 M．elsdenii 和 S．ruminantium 被认为是乳酸
利用菌［19］。根据表 1 中的日粮配比，S．dextrinosol-
vens菌拷贝数百分比由 51． 4%下降为 44． 0%，可能
是由于 20%的谷物被 TDDGS 替代使得日粮中淀粉
含量下降所导致。尽管 S．dextrinosolvens菌拷贝数百
分比有所下降，但差异不显著，这可能说明日粮中添
加 TDDGS(无论替代精料还是粗料)对瘤胃内 S．
dextrinosolvens 菌数量的影响很小。Mackie 等［20］报
道称日粮中淀粉发酵是产生乳酸的主要来源，同时
这也是乳酸利用菌的生长底物。与此相似，Krause
等［21］发现当动物饲喂高谷物含量日粮时，M．elsdenii
菌在瘤胃内的数量大大升高。另有研究报道，当饲
喂肉牛干草时检测不到 M．elsdenii菌，但当转而饲喂
肉牛谷物日粮 2 d后就检测到了 M．elsdenii 菌，且在
饲喂谷物日粮 12 d 后其数量达到最高峰［22］。但是
在本研究中 30% TDDGS组日粮相对于对照组其谷
物含量下降了 20%，而 2 种乳酸利用菌(M．elsdenii
和 S．ruminantium)在 30% TDDGS 组的拷贝数百分
比却比对照组显著升高，可能的解释是 TDDGS中的
可发酵纤维含量要远远高于大麦青贮，因此可发酵
产生大量乳酸，进而有利于 2 种乳酸利用菌的大量
增殖。
本研究中 P．ruminicola 菌在 30% TDDGS 组拷
贝数百分比低于对照组，这与前人的报道一致。
Tajima等［13］发现在日粮从高粗料变为高精料后，瘤
胃中 P．ruminicola菌的数量下降。本研究中同样由于
日粮中添加 TDDGS导致日粮精料比例增加，并发现
P．ruminicola 菌拷贝数百分比下降，这可能与 P．ru-
minicola菌有降解碳水化合物的能力有关，但具体
机制尚不明确，仍需更深入的研究。综上所述，本研
究表明，肉牛日粮中添加 TDDGS 替代所有粗料和部
分精料对 5种瘤胃代表性菌数量百分比均有所影响，
显著升高了 F．succinogenes、S．ruminantium 和 M．elsde-
nii，而降低了 S．dextrinosolvens 和 P．ruminicola 菌数量
百分比，但变化差异不明显。
致谢:感谢美国威斯康辛麦迪逊大学细菌学学院 Paul J
Weimer博士对 5 种瘤胃代表性菌及 Domain bacteria 标准菌
株基因组 DNA的提供。
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