全 文 ：第 30卷　第 4期
2009年 12月
内 蒙 古 农 业 大 学 学 报
JournalofInnerMongoliaAgriculturalUniversity
Vol.30　No.4
Dec.2009
螺旋藻硝酸还原酶 Km值的比较研究＊
乌兰巴特尔 , 　杨红梅 , 　乔　辰
(内蒙古农业大学农学院 ,呼和浩特　010019)
摘要:　采用离体法对鄂尔多斯高原碱湖的钝顶螺旋藻 S1 、引进的钝顶螺旋藻 S2和极大螺旋藻 S3硝酸还原酶(NR)
的活性进行测定 , 用 4种作图法研究该酶的 Km和 Vmax。结果表明:4种作图法得出的 Km和 Vmax值均在同一个数
量级 , 方差分析不同的作图法之间无显著差异 , 但 3个样品间差异显著 , S1的最高 , S3的次之 , S2的最低。在 30℃ ±
1℃、pH7.5下 ,以 KNO3 为底物 , Eadie-Hofstee作图法得出的 S1、S2 和 S3 NR的 Km值分别为 2.729 1μmol/L、
1.080 7μmol/L和 1.627 4μmol/L, Vmax分别为 0.017 2μmol/min、0.007 0μmol/min和 0.009 8μmol/min。与某些生
物比较 , 螺旋藻 NR的 Km值相对较低 ,对 NO-3 亲和力较高。
关键词:　螺旋藻(节旋藻);　硝酸还原酶;　离体法;　 Km
中图分类号:　Q949.22+1　　　文献标识码:　A　　　文章编号:1009-3575(2009)04-0056-05
ACOMPARATIVESTUDYONKmVALUEOFNITRATEREDUCTASEFROMSpirulina(Arthrospira)
Wulanbateer, 　YANGHong-mei, 　QIAOChen
(CollegeofAgronomy, InnerMongoliaAgriculturalUniversity, Huhhot010018, China)
Abstract:　ActivityofNitratereductase(NR)fromthedomesticSpirulina(Arthrospira)platensis(S1)fromOrdosPlateaualkalinelakesandtheimportedS.(A.)platensis(S2)andS.(A.)maxima(S3)wereinvestigatedbymeansofinvitromethod.TheMichae-lisconstant(Km)andVmvaluesofNRweremadeusingfourdiferentmappingmethods.TherewerenosignificantdiferencesinKm
andVmaxvaluesobtainedusingfourdiferentmappingmethods.ButthereweresignificantdifferencesinKmandVmaxvaluesamong
threesamples:largestforS1 , mediumforS3 andsmalestforS2.Undertheconditionsof30℃±1℃ andpH7.5, withKNO3 assub-strate, KmvaluesforS1 , S2 andS3 were2.7291μmol/L, 1.0807μmol/Land1.6274 μmol/LrespectivelyandVmaxvalueswere
0.0172 μmol/min, 0.0070 μmol/minand0.0098μmol/minrespectivelyviaEadie-Hofsteemappingmethod.Bycomparison, Km
valueofSpirulinaNRwasrelativelylowandtheaffinityforNO-
3
wasrelativelyhigh.
Keywords:　Spirulina(Arthrospira);　nitratereductase(NR);　 invitromethod;Km
　　硝酸还原酶(nitratereductase,缩写 NR, EC1.6.
6.1-3)广泛存在于高等植物 、细菌和浮游藻类等体
内的 1种诱导酶 。NR不仅是 NO-3 同化步骤中的第
1个酶 ,也是整个同化过程的限速酶 。其催化硝酸盐
还原成亚硝酸盐 ,在氮合成代谢中起重要反应 [ 1] ;其
的催化速率限制并调节硝酸盐的同化过程[ 2] ;钝顶
螺旋藻在适当条件下快速生长时 , NR活性水平与硝
酸盐的利用和蛋白质的合成存在正相关关系[ 3] 。看
出 , NR与植物对硝酸盐的吸收同化关系密切。
Km和 Vm值是酶的两个重要动力学研究指标 ,
也是酶学研究的基本内容之一。对 NR的 Km研究 ,
不仅可以了解植物对硝酸盐的吸收情况 ,还可以比
较不同样品间利用 NO-3 浓度的高低 。
1996年 ,在纬度较高的鄂尔多斯高原碱湖发现
耐低温的钝顶螺旋藻[ 4] ,关于其一些酶的研究已有
报道[ 5, 6] ,但对于 NR的 Km研究还未见报道。本文
以该藻及引进种为材料 ,对其 NR的 Km值进行比较
研究 ,目的是确定螺旋藻 NR的特征常数 ,并为其对
硝酸盐的同化研究奠定一定的理论基础。
＊ 收稿日期:　2009-09-09基金项目:　国家自然科学基金资助(30460104)作者简介:　乌兰巴特尔(1963-),男(蒙古族),副教授 ,主要从事植物生理生化研究.
表 1　实验材料一览表
Tab.1Materialsofexperiment
代号 物 种 原产地 来 源
S1 钝顶螺旋藻Spirulina(Arthrospira)platensis
鄂尔多斯高原
巴彦淖尔碱湖 内蒙古农业大学自采
S2 钝顶螺旋藻 S.(A.)platensis 非洲 Chad湖 南京大学生物科学与技术系曾昭琪教授惠赠
S3 极大螺旋藻 S.(A.)maxima 墨西哥 Texcoco湖 中国农业科学院陈婉华研究员惠赠
　　注:下文对应样品代号以此表为准。
1　材料与方法
1.1　材料
实验材料见表 1。
1.2　方法
1.2.1　藻的培养　采用 Zarrouk培养液[ 7]在室温
自然光照下通气培养 。
1.2.2　酶液的制备　准确称取处于对数生长期鲜
藻 0.5g,置于研钵中 ,加入少许 pH7.5磷酸缓冲液
(0.1mol/L),充分研磨 ,破碎细胞 ,定容后过滤 ,上清
液备用 。
1.2.3　 NR活性测定 　采用离体法 [ 8] ,略有改动。
以 KNO3 为底物 , 在 30℃ ±1℃、pH 7.5下保温
30min,于 520nm处测定吸光值。 NR活性用单位鲜
重组织在单位时间内产生的亚硝酸量表示 , 即 μg
NO-2 /gFW·h。
1.2.4　米氏常数(Km)和最大反应速度(Vmax)测
定:在 30℃ ±1℃、pH7.5下 ,对不同底物浓度下的
反应速度 v进行测定 ,每个处理重复 3次。后采用
Linewaver-Burk(L-B)作图法 、Hanes-Woolf(H
-W)作图法 、Eadie-Hofstee(E-H)作图法和 Eis-
enthal-Cornish-Bowden(E-C-B)作图法确定
NR的 Km和 Vm值[ 9, 10] 。
2　结果与分析
2.1　 [ S]对 v的影响
从图 1看出 , S2和 S3的 [ S] -v曲线呈典型矩
形双曲线 , S1的基本呈矩形双曲线 。 [ S] -v曲线可
以粗略的反映螺旋藻 NR的 Km和 Vmax值的大小 ,
这 2个值高低排列顺序均是 S1 >S3 >S2。
对于服从米氏方程的所有酶来讲 ,其曲线上某
两个特定点所对应的底物浓度比值是 1个常数。比
如曲线上相应于 70%Vmax和 10%Vmax两点所对应
的 [ S]之比总是 21[ 10] ,即 [ S] 0.7 /[ S] 0.1 =21。将后
面 E-H作图法得出 Vmax值与图 1结合起来进行
计算 , S1 、S2和 S3的 70%Vmax和 10%Vmax这两点
所对应的 [ S]之比分别约为 20.3、16.9和 16.4,该值
与常数值 21[ 10]接近或略低 。根据以上的分析 ,作者
认为螺旋藻 NR属于米氏酶。
图 1　螺旋藻 NR的 v-[ S]曲线
Fig.1 [ S] -vcurveofNRfromSpirulina
———S1　……S2　----S3
2.2　4种作图法确定 Km和 Vmax值
以 KNO3为底物时 ,螺旋藻 NR的 4种作图法见
图 2,根据各自的作图法求出相应的拟合方程 、R2及
Km、Vmax见表 2。
从图 2和表 2可以看出 , 4种作图法得出螺旋藻
NR的 Km和 Vmax值均是 S1的最大 、S3的次之 , S2
的最小 ,且每 1个样品经 4种作图法得出的 Km和
Vmax值比较接近;其中 , 3个样品的 Km值基本在同
1个数量级 。
以 KNO3为底物时 , 3个样品 NR的 E-C-B作
图法得出的 Km和 Vmax值基本比其它作图法要低;
E-H作图法和 L-B作图法得的 Km值比较接近 ,
且与 H-W作图法均存在一定的差距 。因 L-B作
图法易将误差放大 ,故作者采用 E-H作图法确定
Km和 Vmax值 ,即 S1 、S2和 S3的 NR的 Km值分别
为 2.7291μmol/L、1.0807μmol/L和 1.6274μmol/L;
57第 4期　　　　　　　　　　　　　乌兰巴特尔等:　螺旋藻硝酸还原酶 Km值的比较研究
Vmax分别为 0.0172μmol/min、0.0070μmol/min和 0.0098μmol/min。
表 2　3个螺旋藻样品 4种作图法 NR的拟合方程 、Km和 Vmax
Tab.2 NRoffourkindsofmappingthefitingequation, KmandVmaxSpirulina
样品 作图法 拟合方程 相关系数 R2 Km/(μmol/L) Vm/(μmol/min)
S1 L-B y=157.18x+59.36 0.989 6 2.639 0 0.016 8
H-W y=52.66x+181.74 0.973 2 3.451 1 0.019 0
E-H y=-2.73x+0.02 0.909 4 2.729 1 0.017 2
E-C-B 　　　　― ― 2.523 8 0.016 2
S2 L-B y=158.89x+141.97 0.993 8 1.119 2 0.007 0
H-W y=146.07x+145.32 0.999 1 0.994 9 0.006 8
E-H y=-1.08x+0.01 0.981 4 1.080 7 0.007 0
E-C-B 　　　　― ― 1.050 0 0.006 8
S3 L-B y=169.39x+101.44 0.994 7 1.669 9 0.009 9
H-W y=100.44x+174.08 0.998 5 1.733 2 0.010 0
E-H y=-1.63x+0.01 0.980 7 1.627 4 0.009 8
E-C-B 　　　　― ― 1.526 3 0.009 9
2.3　方差分析
经 st-st程序方差分析得出 ,每个样品 4种作图
法得出的 Km值差异不显著(p>0.05),但样品之间
存在差异 ,其中 S1与 S2、S3之间存在极显著差异(p
<0.01), S2和 S3之间存在显著差异(p<0.05)。每
个样品 4种作图法得出的 Vmax值无差异 (p>
0.05),但样品两两之间存在极显著差异(p<0.01)。
说明 ,不同螺旋藻样品间 NR的 Km和 Vmax值存在
明显差异 ,不同作图法之间无显著差异。 Km值近似
表示酶对底物亲和力的高低 , Km值小 ,酶对底物的
亲和力高;反之 ,亲和力低 。据此 ,推断 Chad湖的钝
顶螺旋藻 S2对 NO-3 亲和力最大 ,对环境中 NO-3 浓
度要求相对较低 , Texcoco湖的极大螺旋藻 S3的居
中 ,鄂尔多斯高原碱湖的钝顶螺旋藻 S1对 NO-3 亲和
力最小 ,对环境中 NO-3 浓度要求相对最高 。
表 3　以硝酸盐为底物时某些生物 NR的 Km值
Tab.3KmvaluesofcertainbiologicalNRfornitratesubstrate
类 型 物 种 Km值 来源
小麦 Triticumaestivum 0.13mmol/L～ 0.84mmol/L 李止正等 [ 11]
毛竹 Phyllostachyspubescens 0.25mmol/L～ 0.29mmol/L 张鼎华等 [ 12]
高等植物 大麦 Hordeumvulgare 0.250mmol/L(表观) Halina[ 13]
放线菌 地中海拟无枝菌酸菌Amycolatopsismediteranei 0.013 3mmol/L 李果龙等
[ 14]
真菌 青霉菌 Penicilliumchrysogenum 9.1×10-2mmol/L Renostoetal.[ 15]
尖刺拟菱形藻 Pseudo-nitzschiapungens 0.495 3mmol/L 唐洪杰等 [ 16]
锥状斯氏藻 Scrippsiellatrochordea 0.455 9mmol/L 唐洪杰等 [ 16]
东海原甲藻 Prorocentrumdonghaiense 0.149 7mmol/L 唐洪杰等 [ 16]
中肋骨条藻 Skeletonemacostatum 0.145 3mmol/L 唐洪杰等 [ 16]
旋链角毛藻 Chaetoceroscurvisetus 0.080 2mmol/L 唐洪杰等 [ 16]
藻类 小球藻 Chlorella 0.025 mmol/L或 0.110mmol/L Christopheretal.[ 17]
钝顶螺旋藻 S.(A.)platensis 1.098×10-4mmol/L 张慧苗等 [ 3]
钝顶螺旋藻 S.(A.)platensis(S1) 2.729 1×10-3mmol/L 作者 /本文
钝顶螺旋藻 S.(A.)platensis(S2) 1.080 7×10-3mmol/L 作者 /本文
极大螺旋藻 S.(A.)maxima(S3) 1.627 4×10-3mmol/L 作者 /本文
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图 2　3个螺旋藻样品 NRKm和 Vm的 4种作图法
Fig.2 ForeplotsofKmandVmaxfor
NRfromSpirulinav/(μmol/min);[ S] /(μmol/L)
3　讨论
以硝酸盐为底物 ,已报道的某些生物 NR的 Km
值见表 3。其中 ,小麦 、大麦和毛竹 NR的 Km值在
0.13 ～ 0.84mmol/L之间[ 11-13] ;地中海拟无枝菌酸
菌的 Km值为 0.0133mmol/L[ 14] ;青霉菌 Km值为 9.1
×10-2 mmol/L[ 15] ;5种海洋微藻的 Km值在 0.0802
mmol/L～ 0.4953mmol/L之间 [ 16] ;小球藻的 Km值为
0.025 mmol/L或 0.110mmol/L,前者的缓冲液离子
强度(ionicstrengthI)为 0.02 mol/L,后者 I=0.2
mol/L[ 17] ,这比作者对螺旋藻的测定结果高 1 ～ 2个
数量级。说明 , 螺旋藻 NR的 Km值相比最低 , 对
NO-3 的亲和力明显高于表 3所列的高等植物 、菌类
和微藻 ,且对环境中所需的 NO-3 浓度要低得多 。
关于螺旋藻(节旋藻)NR的 Km值 ,张慧苗和顾
天青对钝顶螺旋藻的测定结果为 1.098×10-7mol/
L[ 3] ,比作者的结果低 1个数量级。这可能与双方测
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定条件不同有关 ,一则是缓冲体系离子强度和 pH值
的差异 ,前者采用 0.02mol/L的 Hepers缓冲液(pH
8.0),而作者是 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.5);二
则是底物的不同 ,前者是对甲基紫精 ,而作者则是
KNO3。
在螺旋藻(节旋藻)属内 ,不同物种以及同一物
种不同品系 NR的 Km值虽数值不同 ,存在差异 ,但
这种差别远比与其它生物的要小得多 。
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