全 文 ：大青叶的毛细管电泳指纹图谱研究
孙国祥*　慕善学　侯志飞　刘晓玲　孙毓庆
(沈阳药科大学药学院 , 沈阳 110016)
摘　要　采用高效毛细管电泳法 , 紫外检测波长 228 nm, 电压 12. 5 kV, 以硼酸 (100 mmo l /L):硼砂
(50 mm o l /L)=11∶10(调 pH 11)为背景电解质进行指纹图谱研究。 建立了大青叶药材的电泳指纹图谱
(CEFP)。以胞苷峰为参照物峰 ,确定了 18个共有峰 , 测定了 10个产地大青叶的 CEFP与共有模式间具有良
好的相似性 , 用色谱指纹图谱指数对其进行评价。所建立的 CEFP具有较好的重现性 , 可用于大青叶药材的
质量控制。
关键词　毛细管电泳 , 指纹图谱 , 大青叶 ,色谱指纹图谱指数 , 色谱指纹图谱相对指数
　 2004-05-11收稿;2005-01-22接受
本文系国家药典委员会中药注射剂指纹图谱资助项目
1　引　　言
大青叶 (Folium isa tidis)为菘蓝 、马蓝和蓼科草本植物廖蓝 (Polygonum tinctorium A i.t )的干燥叶 ,具
有清热解毒 、凉血消斑等功效[ 1] 。大青叶的活性成分有靛蓝 、靛玉红 、腺苷和色胺酮等。测定大青叶中
靛蓝和靛玉红含量有 HPLC法和薄层扫描法 ,未见有毛细管电泳指纹图谱方面的研究。大青叶药材因
科属 、产地 、生长条件 、栽培方法 、采集时间 、贮存条件等不同 ,使大青叶尽管在化学成分基本相同 ,但在
含量和药理作用方面产生差异 [ 2] 。本实验用毛细管区带电泳法对大青叶水提取液进行了指纹图谱初
步研究 ,结果具有重现好和稳定的特点 ,对大青叶药材的质量控制提供了新的参考方法。
2　实验部分
2. 1　仪器与试剂
HPCE-10高效毛细管电泳仪和自制重力进样器(大连江申分离科学技术公司);数据由江申色谱工
作站记录。分析纯硼砂和硼酸 (沈阳化学试剂厂 );胞苷对照品 Cytidin(含量 >99%, F luka chem ie AG ,
packed in Sw itze rland)。
2. 2　样品溶液制备
2. 2. 1　对照品溶液制备　精密称取胞苷对照品 10. 0 mg,置于 50mL量瓶中 ,用水定容至刻度 ,摇匀即得。
2. 2. 2　样品供试液制备　精密称取于 60℃干燥 40 m in的大青叶药材 2. 50 g,加水 50 mL,回流提取
2 h,过滤 ,残渣加水 30mL继续回流 2 h,合并两次滤液 ,减压浓缩至 10 mL,以 80%(V /V)乙醇醇沉
24 h ,回收乙醇至无醇味 ,同法进行 2次醇沉 ,最后将样品液定容至 25mL,摇匀 ,作供试液。
2. 3　电泳条件
石英毛细管 65 cm ×75 μm .i d. ,有效长度 50 cm(河北永年光导纤维厂 );紫外检测波长 228 nm;灵
敏度 0. 002AUFS;运行电压 12. 5 kV;BGE为硼酸(100mmo l /L)∶硼砂 (50mmo l /L)=11∶10(调 pH 11);
重力进样 20 s(高度 8. 5 cm)。
3　结果与讨论
3. 1　电泳条件选择
分别以 50mmo l /L N aH 2PO4溶液 、50mmol /L N a2HPO 4和 50 mmo l /L硼砂及二者混合液作 BGE时
分析样品 ,结果以 50mmo l /L硼砂分离效果较好;若以 100mmol /L H 3BO3(KOH溶液调 pH 11)作 BGE
时分离明显改善 。经反复调整 ,当硼酸 (100mmol /L)∶硼砂 (50 mmo l /L)=11∶10为 BGE时 ,分离效果
第 33卷
2005年 6月　　　　　　　　　　　　
分析化学 (FENXI HUAXUE)　研究简报
Ch inese Journa l o f Ana ly tica l Chem istry
　　　　　　　　　　　　 第 6期
853 ～ 856
良好。考察上述 BGE为 pH 9. 0、9. 5、10. 0、11. 0和 11. 3时 , pH 11最理想;当电压为 8、10、12. 5, 14和
16 kV时 ,以 12. 5 kV分离效果最佳 。检测波长为 228、254和 280 nm时 ,以 228 nm测得各指纹峰信号
较强且大小均匀 。
3. 2　药材提取溶剂的选择
分别以 95%、70%、50%和 25%(V /V)乙醇和水及 BGE为溶剂按 “2. 2. 2”项制备大青叶供试液 ,进
样分析 ,发现测得的电泳图差异并不显著 ,前 4种溶剂提取时 ,常出现溶剂峰;水提取样品时测得电泳图
较理想 。因此 ,选水作提取溶剂 。
3. 3　大青叶毛细管电泳指纹图谱(CEFP)的建立
3. 3. 1　系统适用性实验和参照物峰的定性　将胞苷对照品溶液和大青叶供试液在毛细管电泳仪上重
图 1　胞苷(a)和大青叶样品(b)电泳图
F ig. 1　E lec trophe rogram of cy tidin (a) and folium isa tid is
samp le (b)
力进样 20 s,毛细管电泳图见图 1。对比迁移时
间可知 6号峰为胞苷 。在样品供试液中加入对照
品溶液 ,进样分析 ,电泳峰增益结果证明上述结论
正确。测得胞苷峰的理论塔板数为 48397,胞苷
峰与相邻峰分离良好 ,故选作参照物峰。
3. 3. 2　大青叶标准 CEFP测定　将 11个产地大
青叶供试液在毛细管电泳仪上进样分析 2次 ,记
录电泳图。以相对迁移时间和相对峰面积平均值
标定其指纹特征。通过对其 CEFP比较研究 ,按
各电泳峰的共有率 fi≥70%确定共有指纹峰为
18个 [ 3] (见图 1b), fi =m i
n
×100%, m i 为 i指纹
峰出现产地数 , n为总产地数 。陕西商洛大青叶 CEFP离群 ,舍弃 ,取余下 10个产地药材各 10 g,混匀 ,
精密称取 2. 50 g,制备供试液。将供试液进样分析 2次 ,记录电泳图 ,以迁移时间 、相对迁移时间 、峰面
积和相对峰面积 (R. A)标定大青叶 CEFP(见表 1),大青叶标准 CEFP见图 1b。
表 1　大青叶标准 CEFP数据
Table 1　The da ta o f finge rprin ts in the standa rd capr llary e lectrom phoresis fingerprin ts(CEFP) fo rFolium isatidis
峰序号
PeakN o.
迁移时间
M igration
tim e(m in)
峰面积
Peak area(μV /s)
相对迁移时间
Relative
m ig ration tim e
相对峰面积
Relative
peak area
峰序号
Peak No.
迁移时间
M igration
tim e(m in)
峰面积
Peak area(μV /s)
相对迁移时间
Relative
m igration tim e
相对峰面积
Re lative
peak area
1 10. 77 1. 09×105 0. 60 1. 54 10 21. 79 1. 84×105 1. 21 2. 59
2 12. 38 1. 79×105 0. 68 2. 53 11 22. 53 1. 14×105 1. 25 1. 61
3 15. 58 7. 20×104 0. 86 1. 01 12 26. 80 2. 47×105 1. 48 3. 48
4 16. 28 3. 15×104 0. 90 0. 44 13 28. 64 3. 74×105 1. 59 5. 28
5 16. 99 1. 08×105 0. 94 1. 52 14 29. 90 1. 15×105 1. 65 1. 62
6 18. 07 7. 09×104 1. 00 1. 00 15 33. 84 2. 02×105 1. 87 2. 84
7 19. 00 3. 72×104 1. 05 0. 52 16 35. 33 4. 11×105 1. 96 5. 80
8 19. 88 2. 67×104 1. 10 0. 38 17 38. 72 1. 65×105 2. 14 2. 33
9 20. 77 8. 42×104 1. 15 1. 19 18 40. 29 1. 47×105 2. 23 2. 07
　
3. 3. 3　精密度实验　将甘肃定西大青叶供试液连续进样 5次 ,记录电泳图 ,结果各指纹峰的相对迁移
时间的 RSD均小于 3. 5%。相对峰面积除 15号峰为 6. 2%, 13号峰为 6. 4%,其余不大于 5. 0%,证明
测量精密度满足要求 。
3. 3. 4　样品稳定性实验　取甘肃定西大青叶供试液 ,分别在制备样品后的 0、6、12、18、24及 36 h进样
测定 ,记录电泳图 。结果各峰相对迁移时间 RSD小于 4. 8%;相对峰面积 RSD在 3. 0% ～ 8. 1%之间 ,表
明样品在 36 h内稳定。
3. 3. 5　重现性实验　精密称取 10产地大青叶混合药材 2. 50 g,按 2. 2. 2法制备 5份供试液 ,分别进样
测定 ,记录电泳图 。以 6号峰为参照物峰 ,计算 18个共有峰相对峰面积 RSD值 ,除 15号峰 (8. 2%)、
16号峰(7. 6%)、13号峰 (7. 9%),其余不大于 5%,符合指纹图谱要求。
854　　 分 析 化 学 第 33卷
3. 3. 6　不同产地大青叶 CEFP与标准 CEFP相似性研究　将 3. 3. 2项下测得的各产地 CE图谱 ,以相
对峰面积为指标 ,获得各产地的特征指纹向量 P i =(y1 , y2 , …, y18),计算不同产地 CEFP与标准 CEFP
相似度 (S)见表 2。除了大青叶商洛Ⅰ的 S =0. 87外 ,其余均大于 0. 91,说明不同产地大青叶化学成分
是很相似的 ,宝鸡 Ⅱ、Ⅳ和商洛 Ⅱ与标准 CEFP最相似 ,而宝鸡 Ⅰ和铜川 Ⅱ与标准 CEFP相似度略小些 ,
商洛Ⅰ大青叶与标准 CEFP有显著差异。
3. 4　大青叶色谱指纹图谱指数 F和相对指数 F r[ 4]
孙国祥等[ 4]首次提出用色谱指纹图谱指数 F和相对指数 F r评价色谱指纹图谱 ,其包括 3个方面:
(1)有效分离率　β =m /(n - 1),其中 n为指纹峰数 ,m为基线分离(R≥1. 5)峰对数;(2)指纹信号响应强
度　(R =∏n
i=1Ai =An0(A0 =n ∏
n
i=1Ai ), A i为第 i个峰面积 , R越大越好;(3)指纹信号均化系数 γ　指纹向量
P =(A1 , A2 , A3 , …, An),根据指纹峰等信号强度分布最理想 ,用 P和 a =(1, 1, 1, …, 1)夹角余弦值即 P与
a相似度系数 γ表征指纹信号均化程度 , γ越接近 1,则信号平均化越好。综合 β, γ影响 ,则 R≈An βγ0 ,令
F =lgR =nβγlgA0 =βγ∑n
i=1 lgA i ,称 F为色谱指纹图谱指数。若理想 FP时间为 50m in,实际为 t, t越小表明时
间效率越高 ,同时考察 1mg药材(或制剂)提取物进样后的 F值 ,则得到色谱指纹图谱相对指数 F r:
Fr =50F
Qt
=50nβγlgA0
Q t
=
50βγ∑n
i=1
lgAi
Qt
Q是与一次进样量相当的原生药材 (或制剂)质量 (mg), t最后一个指纹峰出完峰时间 (m in)。测定大
青叶 F和 F r结果见表 2。根据实验结果 , γ应不低于 0. 81,大青叶 β值均为 1, F和 F r值应分别不低于
70和 5. 5×107 ,否则为不合格药材 。
3. 5　含量相似度 [ 5] 　
相似度概念只说明化学成分分布的相似性 ,不具有定量性质。在取样量 、提取方法和进样量固定前
提下 ,文献 [ 5]提出含量相似度(P)评价方法。不同产地大青叶 含量相似度 P结果见表 2,其中商洛 Ⅰ
含量相似度最低 ,而宝鸡Ⅳ、渭南Ⅱ和商洛 Ⅱ含量较高。
表 2　大青叶指纹图谱评价结果
Table 2　The evalua ting data o f the Folium isatidis′CEFP
药材产地 Resou rces S A0 P (%) γ t /m in Q /m g F F r
甘肃定西 G ansu Dingxi 0. 92 1. 1×105 109. 5 0. 87 55. 63 1. 3×10 - 6 78. 9 5. 5×107
陕西宝鸡Ⅰ Shaanxi B aojiⅠ 0. 91 9. 4×104 92. 0 0. 85 34. 55 1. 3×10 - 6 76. 1 8. 5×107
陕西宝鸡Ⅱ Shaanxi Bao jiⅡ 0. 98 1. 2×105 117. 8 0. 84 47. 06 1. 3×10 - 6 76. 8 6. 3×107
陕西宝鸡 Ⅲ Shaanx iB aoji Ⅲ 0. 92 7. 2×104 70. 9 0. 81 34. 21 1. 3×10 - 6 70. 8 8. 0×107
陕西宝鸡 Ⅳ Shaanx iB aojiⅣ 0. 98 1. 4×105 137. 8 0. 86 44. 26 1. 3×10 - 6 79. 7 6. 9×107
陕西商洛Ⅰ Shaanxi Shang luoⅠ 0. 87 6. 7×104 65. 5 0. 88 33. 92 1. 3×10 - 6 76. 4 8. 7×107
陕西商洛Ⅱ Shaanxi Shang luoⅡ 0. 98 1. 4×105 139. 6 0. 88 42. 99 1. 3×10 - 6 81. 5 7. 3×107
陕西铜川Ⅰ Shaanxi Tongchuan Ⅰ 0. 93 1. 0×105 121. 1 0. 89 33. 14 1. 3×10 - 6 80. 1 9. 3×107
陕西铜川Ⅱ Shaanxi Tongchuan Ⅱ 0. 91 9. 3×104 91. 5 0. 83 46. 66 1. 3×10 - 6 74. 2 6. 1×107
陕西渭南Ⅰ ShaanxiW einan Ⅰ 0. 93 7. 7×104 76. 1 0. 91 33. 53 1. 3×10 - 6 80. 0 9. 2×107
陕西渭南Ⅱ ShaanxiW einan Ⅱ 0. 94 1. 3×105 132. 6 0. 82 37. 26 1. 3×10 - 6 75. 5 7. 8×107
平均 Raverage 0. 93 1. 0×105 100. 0 0. 85 40. 29 1. 3×10 - 6 76. 5 7. 3×107
　S. 相似度(sim ilarity);A0. 几何平均峰面积(average peak area);P. 含量相似度(s im ilarity in conten t);γ. 均化系数(parallel coeffi-
cien t);t. 迁移时间(m igration t im e);Q. 进样量( in jectionm ass);F. 指纹图谱指数( index of FP);F r. 指纹图谱相对指数( relative index
of FP);FP. f ingerp rint
4　讨　　论
为获得良好的重现性 ,控制好实验时温度 、进样时间 ,经常更换电解质和清洗好毛细管柱至关重要。
由于所用硼砂和硼酸缓冲盐体系中的 B原子能够与中药中不同组分形成荷电性质差异较大络合物 ,因
此不同组分获得了良好分离。 BGE中使用了大比例的硼酸 ,目的在于提高硼酸盐的浓度 ,使分离效果
855第 6期 孙国祥等:大青叶的毛细管电泳指纹图谱研究 　　
更佳。样品经水煮后 ,醇沉可除去大量杂质如鞣酸类 ,使电泳图基线好。本实验用色指纹图谱指数 F
和 F r评价了大青叶 CEFP,进行了含量相似度方面的探讨 ,结果表明这些参数可在一定程度上评价指纹
图谱的特性 。合理选择 BGE构成 、采用灵敏度较高检测设备 ,可实现绝大多数中药成分基线分离。本
文方法可为大青叶质量控制研究提供参考 。
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Study on the Cap illary E lectrophoesis F ingerpr ints ofFo lium Isa tid is
Sun Guoxiang* ,M u Shanxue, H ou Zhife i, L iu X iao ling, Sun Yuqing
(College of Pharm acy, Shenyang Pharmaceu tical University, Shenyang 110016)
Abstract　The capillary electropho resis finge rprints(CEFP)o fFolium isatid is was estab lished to evalua te the
qua lity o fFolium isatid is by CE , w ith the detection w ave length o f 228 nm , applied vo ltage of 12. 5 kV. The
100mmo l /L boric acid solution and 50 mmol /L sodium borate solution in 11∶10 (adjusted to pH 11)were
used as background e lectro ly te. 18 co-po ssessing peaksw ere selected as the finge rprin ts ofFolium isa tidis and
cy tid in w as se lected as the reference peak. Therew e re good sim ilarities be tw een the standa rd CEFP and each
CEFP from the ten different places for the ir sim ilarity coe fficients no less than 0. 91. The fingerprints index
w as also used to eva luated the CEFP, good quanlitese fo rFolium isatid is′F and the re lative index (F r)
shou ld be no less than 62 and 5. 5 ×107 , respec tively. The CEFP has good precision, reproducibility and
stability, which can be used for the qua lity con trol ofFolium isatidis.
Keywords　 Capillary e lec trophoresis, fingerprints, Folium isatid is, ch roma tograph ic finge rprin t index,
chromatographic fingerprin t relative index
(Received 11M ay 2004;accep ted 22 January 2005)
856　　 分 析 化 学 第 33卷