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[收稿日期] 2008-03-25
[ 基金项目] 广西科学研究与技术开发计划项目(编号:桂科攻 0322024-5E)　2007年广西研究生科研创新项目(编号:2007105981007M03　
[ 作者简介] 刘曦 ,女 ,硕士研究生 ,电话:0771-5358014 , E-m ail:sis si-mail@163.com 　[ 通讯作者] 黄仁彬 ,教授 ,电话:0771-5358272　E-m ail:
huangrenbin518@163.com
六月青多糖体外抗氧化作用的研究
刘曦 ,黄仁彬 ,孙懿 ,谭宏棣 ,朱金芳　(广西医科大学药学院 , 广西 南宁 530021)
[ 摘要] 　目的:探讨六月青多糖(LYQP)体外清除自由基以及抗氧化的作用。方法:硫代巴比妥酸法测小鼠肝中丙二醛
(MDA)含量 ,分光光度法测小鼠红细胞溶血和肝线粒体肿胀度 , 邻苯三酚自氧化法和邻二氮菲-Fe2+/ H2 O2体系研究 LYQP
对自由基的作用。结果:LYQP 能有效抑制 MDA 的产生 ,减少小鼠红细胞溶血 , 减轻肝线粒体肿胀度 , 能抑制·OH 的生成 ,
但对 O2 -的生成起促进作用。结论:LYQP 有明显的体外抗氧化作用。
[ 关键词] 　六月青多糖;脂质过氧化;氧自由基;抗氧化
[中图分类号] R285　　[ 文献标识码] A　　[ 文章编号] 1001-5213(2008)23-1983-04
Study on in vitro anti-oxidative effect of Liuyueqing polysaccharide
LIU Xi , HUANG Ren-bin , SUN Yi , TANG Hong-di , ZHU Jin-fang(Depar tment of Pha rmacology , Guangxi
Medical Univer sity , Guangxi Nanning 530021 , China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To study the anti-oxidative effect of L iuyueqing poly saccha ride(LYQP)in v itro.METHODS　M DA
content in live r w as measured by thiobabituric acid assay , the hemoly sis o f RBC and the sw elling extent o f mitochondria was de-
tected by spectr opho tomet ry , and the effect of LYQP on supero xide anion(O2 -)was investig ated by the auto-oxidation of py-
rog allol and its effec t on hydro xy l free radical(·OH)w as mea sured by Fe2+-H2O2 sy stem.RESULTS　LYQP could inhibit the
generation of MDA , the hemolysis of RBC , the swelling of mitochondria , and the production of OH , while the polysacchar ide
could inc rease the gener ation of O 2 -.CONCLUSION　LYQP posse sses a good anti-oxida tive effect in vitro.
KEY WORDS:Liuyueqing po ly saccharide(LYQP);lipid pero xidation;oxygen free radical;anti-oxidation
　　六月青(LYQ)为广西特有的民间草药 ,系爵床
科(Acanthaceae)植物肖鸡笼(顶头马兰)Tara-
phochlamys a f f inis(Grif f)B remekhu S trobi lanthes
a f f inis grif f YC Tang)的干燥地上部分。主要用
于急慢性肝炎 ,黄疸等。LYQ 水提物对小鼠急性化
学性肝损伤均有明显的保护作用[ 1] 。本研究从六月
青中提取多糖(Liuyueqing po ly saccharide , LYQP)
并用分光光度法测定小鼠红细胞溶血和肝线粒体肿
胀程度 ,用硫代巴比妥酸法测小鼠肝脏中丙二醛的
含量 ,由邻苯三酚氧自由化产生的氧自由基(O 2 -)
和邻二氮菲-Fe2+/H2 O 2 体系产生的羟自由基
(·OH),研究 LYQP 的抗氧化作用 。
1　材料
FJ-200高速分散均质机(上海标本模型厂);
722s可见分光光度计 ,上海精密科学仪器有限公
司。 TU-1800SPC 紫外可见分光光度计 , 北京普
析通用仪器有限公司;LYQ 采于广西灵山县(经广
西中医药研究所鉴定);H 2O 2;邻苯三酚;邻二氮
菲;硫酸铁;硫代巴比妥酸(TBA),三氯醋酸(TCA)
均为国药集团化学试剂有限公司;抗坏血酸(成都市
·1983·中国医院药学杂志 2008年第 28卷第 23期 Chin H osp Pharm J , 2008 Dec , Vol 28 , No.23
科龙化工试剂厂 ,批号 2006111);昆明种小鼠[ ♂,
体质量(20±2)g ,广西医科大学实验动物中心 , 试
验动物生产许可证:SCXKG 桂 2003-0003 ,试验动
物使用许可证:SYKG 桂 2003 -0005] 。
2　方法
2.1　LYQP 的提取 　取 LYQ 粗粉 , 加入 8 倍量
60%乙醇加热回流 2次 ,趁热过滤 ,合并滤液 ,减压
浓缩滤液至无醇味 ,过滤除去水不溶性杂质 ,所得滤
液过 AB-8大孔树脂 ,收集水洗脱馏分 ,减压浓缩至
小体积 ,加入 6 ～ 8 倍量的无水乙醇 ,静置 24 h ,过
滤 ,取沉淀 ,沉淀用无水乙醇洗涤数次 ,即得 。六月
青多糖为淡黄色的粉末。多糖得率为0.83%。以葡
萄糖为标准品 ,用苯酚-浓硫酸法检测该多糖的纯度
为88.73%。
2.2　动物样品的制备
2.2.1　红细胞悬浮液的制备　小鼠拔眼球取血 ,加
入肝素制成抗凝血样品 ,于 4 ℃, 2 000 r·min-1离
心 10 min得红细胞 ,红细胞用预冷的生理盐水洗 3
次 ,用生理盐水稀释成0.5%的红细胞悬液。
2.2.2　肝匀浆的制备　小鼠处死后立即打开腹腔 ,
用预冷的生理盐水从门静脉冲洗肝脏 ,取出肝脏 ,用
4 ℃生理盐水洗净表面血污 ,称重 ,用预冷生理盐水
制成 10%的肝匀浆 ,3 000 r·min-1 ,离心 10 min ,取
上清液备用 ,卡马斯亮蓝试剂盒测蛋白 ,制成含蛋白
质0.005 g·mL-1的溶液。
2.2.3　肝线粒体的制备[ 2] 　将肝组织在冰浴中以
预冷的0.25mol·L-1的蔗糖溶液制成 10%的匀浆 。
3 000 r·min-1 , 4 ℃离心 20 min , 沉淀用预冷的
0.25 mo l·L-1 蔗糖溶液洗 2 次 , 合并上清液 ,
10 000 r·min-1 ,4 ℃离心 20 min ,所得沉淀用预冷
的0.25 mol·L-1蔗糖溶液洗 2次 ,用 10 mmol·L-1
T ris-HCl缓冲液配成含蛋白质0.5 g·L-1的线粒体
悬浮液。
2.3　LYQ P 对O 2 -的清除率的测定[ 3-4] 　采用改良
的邻苯三酚自氧化法 。加0.05 mo l·L-1 T ris- HCl
液(pH 8.2)2.25 mL于试管中 ,置 25 ℃水浴 20
min。加入阳性对照药抗坏血酸及不同浓度的
LYQP 溶液0.5 mL和 25 ℃保温过的邻苯三酚溶液
(10 mmol·L-1盐酸配制)0.15 mL ,受试药调零管
则加入 10 mmo l·L-1盐酸0.15 mL ,混匀 ,在 25 ℃
保温 4 min ,立即用 8 mol·L-1盐酸溶液 50 μL 终止
其反应 ,并在 322 nm 处测定吸光度 A 值 。对照管
和对照调零管则以注射用水代替受试药 。清除率按
下式计算:
清除率 =(ΔA对 -ΔA样)/ΔA对 ×100%,其中
■A对为邻苯三酚的自氧化速率;■A样为加入药物
溶液后邻苯三酚的自氧化速率。
2.4　LYQ P 对·OH 的清除率的测定[ 5-6] 　反应体
系中含邻二氮菲0.35 mmol·L -1 ,硫酸铁0.4 mmo l
·L-1 , pH 7.34的 PBS 150 mmol·L -1 , 加0.015%
H 2O 2(损)或不加 H 2O 2(未损),37 ℃保温 90 min ,
分别测 510 nm 时的 A 值 ,得 A损与 A未损 。样品管
中含邻二氮菲0.35 mmo l·L-1 ,硫酸铁 0.4 mmo l·
L
-1 , PBS (pH 7.34)150 mmol ·L-1 , 0.015%
H 2O 2 ,加入阳性对照药抗坏血酸及各浓度的
LYQP ,并且设置加药参比管作为调零管 ,保温 90
min ,测 A510 nm ,得 A样 。·OH 清除率按下式计算:
·OH清除率=(A样-A损)/ (A未损 -A损)×100%。
2.5　LYQP 对小鼠肝匀浆氧化的影响
2.5.1　LYQP 对小鼠肝匀浆自发性脂质过氧化的
影响[ 7] 　取 2.5%肝匀浆悬浮液 1 mL ,加入阳性对
照药抗坏血酸及不同浓度的 LYQP 溶液 0.2 mL ,
37 ℃水浴 60 min ,加入 15%TCA 1 mL 终止反应 ,
再加入0.67%TBA 1 mL ,于沸水浴中显色 15 min ,
冷却后离心 ,取上清液于 532 nm 处测定吸光度 A ,
以 A 值表示 MDA 的含量 , MDA 的清除率按下式
计算:清除率=(A对照-A样品)/ A对照×100%。
2.5.2　LYQP 对 Fe2+-H 2O 2诱导的小鼠肝匀浆脂
质过氧化的影响[ 8] 　取2.5%肝匀浆悬浮液 1 mL ,
加入阳性对照药抗坏血酸及不同浓度 LYQP 溶液
0.4 mL ,再加入 6 mmol·L-1硫酸铁 0.1 mL和 60
mmol·L-1 H 2O 2 40 μL , 37 ℃水浴 60 min ,加入
15% TCA 1 mL 终止反应 , 再加入 0.67% TBA
1mL ,于沸水浴中显色 15 min ,冷却后离心 ,取上清
液于 532 nm处测定吸光度 A ,设正常对照组(即不
添加样品和 Fe2+-H 2 O2), 清除率的计算方法同
“2.5.1” 。
2.6 　LYQP 对小鼠红细胞 H 2O 2 所致溶血的影
响[ 9] 　取 0.5%红细胞悬液0.5 mL ,加入阳性对照
药抗坏血酸及不同浓度的 LYQP 0.2 mL ,最后加
入 60 mmol·L-1H2O2 0.05 mL启动反应 ,37 ℃水浴
60 min ,加生理盐水稀释 3倍 , 2 500 r·min-1离心
10 min ,取上清液于 415 nm 处测吸光度 ,设正常红
细胞组(即不加入 H2O2 ,其他条件相同),以对照组
为 100%溶血 , 抑制率 =(A对照 -A样品)/(A对照 -
A空白)×100%。
2.7　LYQ P对维生素 C+Fe2+诱导的小鼠线粒体
肿胀度的影响[ 10] 　取新鲜制备的肝线粒体悬浮液
2.4 mL , 分别 加入 不同 浓度 LYQP 0.4 mL ,
0.05 mmo l·L-1硫酸铁0.4 mL和0.85 mmol·L -1维
·1984· 中国医院药学杂志 2008年第 28卷第 23期 C hin H osp Pharm J , 2008 Dec , Vol 28 , No.23
生素 C 0.2 mL ,对照组不加受试药 ,加入0.4 mL生
理盐水 ,正常组加入 1 mL 生理盐水 。与 520 nm 处
测吸光度 ,每隔 20 min测一次 ,观察 A值的变化情
况。
2.8　数据处理　所有数据均以 x ±s表示 ,组间比
较采用方差分析 ,用 SPSS 13.0进行统计处理 。
3　结果
3.1　LYQ P 对 O2 -的影响　邻苯三酚自氧化能产
生O 2 -和有色物质 ,该有色中间物在 322 nm 处有
吸收峰。如加入 O 2 -清除剂 ,就会抑制邻苯三酚自
氧化 ,同时也抑制有色物质的产生 ,从而使波长 322
nm 处的吸收峰受到抑制 。通过 A322值的变化可判
断 O2 -的清除能力。见表 1 。LYQP 各剂量组能促
进 O2 -的生成 ,且呈剂量依赖关系。
表 1　LYQP对 O 2 -的影响( x±s , n=5)
Tab 1　The effect of LYQP on O2 -( x±s , n=5)
组别 终质量浓度/ g·L-1 A532 抑制率/ %
对照组 0.336±0.006
阳性组 0.040 0.163±0.003 b 51.49
LYQP 0.085 0.423±0.012 b -25.87
0.169 0.436±0.016 b -29.59
0.339 0.465±0.012 b -38.21
注:与对照组比较 , bP<0.01
3.2　LYQ P 对·OH 的清除作用　H2O 2和 Fe2+产
生 ·OH ,邻二氮菲-Fe2+水溶液可以被氧化成邻二
氮菲-Fe3+ ,当体系中存在 ·OH 清除剂时 ,此氧化
过程受到抑制 , A510降低 ,可通过 A510来判断·OH 的
清除能力 。见表 2。LYQ P 各个浓度下均能显著抑
制 ·OH 的生成 ,且呈现良好的剂量依赖关系 。
表 2　LYQP对 ·OH 的清除作用( x±s , n=5)
Tab 2　The scavenging effect of LYQP on·OH( x±s , n=5)
组别 终质量浓度/ g·L-1 A510 清除率/ %
未损伤 0.962±0.04
损伤 0.56±0.04
阳性组 0.08 0.775±0.017 b 53.60
LYQP 0.5 0.614±0.010 a 13.76
1 0.65±0.04 b 22.16
2 0.787±0.029b 56.53
注:与损伤组比较 , a P<0.05 , bP<0.01
3.3　LYQ P 对肝匀浆脂质过氧化的影响　丙二醛
(MDA)是脂质过氧化的主要降解产物 ,其含量的多
少直接反应脂质过氧化的程度 ,也反应了细胞受自
由基攻击的程度 。见表 3。 LYQP 各剂量组均可抑
制肝匀浆自发的脂质过氧化反应 ,且随着药物剂量
的增加 ,MDA 的生成量减少 ,呈良好的量效关系 。
　　与自发性的脂质过氧化相比 ,用 Fe2+-H2O2诱导
小鼠肝匀浆脂质过氧化反应 , MDA 生成的量显著增
加 ,而LYQP 各剂量组能显著抑制这种脂质过氧化反
应 ,且随着浓度的增加抑制率也提高。见表 4。
表 3　LYQP 对小鼠肝匀浆自发性脂质过氧化的影响( x±s ,
n=5)
Tab 3　Effec t of LYQP on lipid pero xida tion in liver homog-
ena te by anti-oxida tion( x±s , n=5)
组别 终质量浓度/ g·L -1 A532 抑制率/ %
对照组 0.118±0.019
阳性组 0.080 0.058±0.004 b 50.85
LYQP 0.125 0.060±0.003 a 48.47
0.062 0.067±0.004a 43.22
0.031 0.071±0.005a 39.62
注:与对照组比较 , aP<0.05 , bP<0.01
表 4　LYQP 对 Fe2+-H2O 2诱导小鼠肝匀浆脂质过氧化的
影响( x±s , n=5)
Tab 4　Effec t of LYQP on lipid pero xida tion in liver homog-
ena te by Fe2+-H2O 2( x±s , n=5)
组别 终质量浓度/g·L-1 A 532 抑制率/ %
正常组 0.34±0.04
对照组 0.59±0.08
阳性组 0.150 0.334±0.020b 43.71
LYQP 0.056 0.54±0.04 9.63
0.113 0.469±0.028b 21.11
0.226 0.419±0.015b 29.53
注:与对照组比较 , b P<0.01
3.4　LYQP 对 H 2O2诱导小鼠红细胞溶血的抑制
作用　小鼠红细胞经 H 2O 2诱导后 A 值增加 ,溶血
度明显高于正常组 ,说明 H2O 2氧化红细胞膜 ,致胞
内物质外流。见表 5 。LYQP 各剂量组的溶血度均
低于对照组 ,表明 LYQP 可抑制红细胞的氧化损
伤 ,使红细胞膜稳定 ,且呈良好的量效关系 。
表 5　LYQP对 H2O 2诱导小鼠红细胞溶血的抑制作用( x±
s , n=5)
Tab 5　Effect of LYQP on RBC hemolysis induced by H2O 2
( x±s , n=5)
组别 终质量浓度/g·L-1 A 415 抑制率/ %
正常组 0.24±0.11 b
对照组 1.15±0.10
阳性组 0.040 0.728±0.031b 45.94
LYQP 0.044 0.969±0.017 19.48
0.089 0.732±0.033 b 45.54
0.178 0.617±0.014 b 58.08
注:与对照组比较 , b P<0.01
3.5　LYQP 对小鼠线粒体肿胀度的影响　脂质过
氧化使线粒体膜通透性增加 ,致使线粒体肿胀的发
生 ,线粒体越肿胀 , A520值的下降幅度越大 。见图 1。
模型组 A520值的下降幅度比正常组大 ,说明 VC +
Fe2+诱导产生·OH ,加速线粒体膜的氧化损伤 ,使
线粒体肿胀严重 ,而 LYQ P 各剂量组的 A520值下降
程度明显降低 ,浓度越大时 , A520值下降程度越低。
100 min内以初始 A520值为基数 ,模型组 A520值下降
率最大(41.9%),正常组下降率为17.4%,低 、中 、高
剂量组的下降率分别为37.3%,31.2%,22.6%。提
示 LYQP 能抑制线粒体膜的脂质过氧化 ,且这种作
·1985·中国医院药学杂志 2008年第 28卷第 23期 Chin H osp Pharm J , 2008 Dec , Vol 28 , No.23
用随着浓度的上升而提高 。
图 1　LYQP 对小鼠肝线粒体肿胀度的影响
— ◇—正常对照;— ■—Fe2+-维生素 C;— ——— —LYQP(0.059 g·
mL -1)+Fe2+-维生素 C;— × —LYQP(0.118 g·mL -1)+Fe2+-维生
素 C;— ★—LYQP(0.235 g·mL -1)+Fe2+-维生素 C
Fig 1　Ef fect of LYQP on sw el ling of mice liver mito chondria
— ◇—no in ducemen t;— ■—Fe2+-VitC;— ———— LYQP (0.059 g ·
mL -1)+Fe2+-VitC;— × — LYQP(0.118 g·mL -1)+Fe2+-VitC;—
★—LYQP(0.235 g·mL -1)+Fe2+-VitC
4　讨论
六月青(LYQ)是广西特有的民间草药。它与
白花蛇舌草 , 半枝莲等配伍组成的复方六月雪
(CLYX)对四氯化碳 (CCl4 )、对乙酰氨基酚
(AP)、D-半乳糖胺 (D-Gal)所致小鼠急性化学性
肝损伤有保护作用;还能抑制鸭乙型肝炎病毒 DNA
的复制[ 11] 。而六月青的提取物能提高环磷酰胺所
致免疫抑制小鼠的免疫功能[ 12] 。但是六月青的有
效成分尚未明确 ,因此本实验旨在对分离出的六月
青多糖进行初步的体外抗氧化活性的研究 ,为进一
步的实验研究打下基础。
本实验结果说明 , LYQP 在体外可以抑制红细
胞的氧化损伤 ,稳定红细胞膜;可显著降低肝匀浆的
自氧化与 Fe2+-H 2O 2诱导产生的 MDA;对于肝线
粒体经维生素 C-Fe2+诱导氧化肿胀有显著的抑制
作用;LYQP 体外可抑制 ·OH 的生成 ,但其对 O 2 -
的生成则起促进作用 。LYQP 在抗肝炎 、抗衰老等
方面的作用有待进一步研究 。
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[收稿日期] 2008-02-16
[ 基金项目] 湖北省教育厅自然科学研究基金青年项目(编号:Q200613003)　[ 作者简介] 郑卫红 ,女 ,副教授 , E-m ail:zw h20061010@163.com
阿司咪唑对大鼠离体心肌电生理特性的影响
郑卫红　(三峡大学医学院药理室 , 湖北 宜昌 443002)
[ 摘要] 　目的:通过观察阿司咪唑对大鼠离体心肌自律性 、兴奋性和有效不应期的作用 , 了解阿司咪唑对心肌电生理特性的
影响 ,以初步探索其心脏作用机制。方法:将心房肌和心室乳头肌标本置于盛有 Ty rode s 液的恒温器官浴槽中 , 向浴槽中累
积加入阿司咪唑。记录右心房-窦房结的自发频率 ,测定左心房与乳头肌收缩的阈刺激电压值和有效不应期。结果:阿司咪唑
能减慢窦房结自发频率 ,降低心肌自律性;能增加引起心房肌和心室乳头肌收缩的阈刺激电压值 , 降低心肌兴奋性;能使心房
肌和心室乳头肌的有效不应期明显延长。结论:阿司咪唑能干扰心肌正常电生理特性 ,对心肌电生理活动具有抑制作用。
[ 关键词] 　阿司咪唑;心肌;电生理特性
[中图分类号] R96　　[ 文献标识码] A　　[ 文章编号] 1001-5213(2008)23-1986-04
Effect of astemizole on electrophysiological characteristics of isolated cardiac muscle in rat
ZHENG Wei-hong (Depar tment of Pharmaco lo gy , Medical Co llege of China Three Go rges Unive rsity , H ubei Yichang
443002 , China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To explore the mechanism of ca rdiac action of astemizo le by observ ing the effect o f astemizole on the
·1986· 中国医院药学杂志 2008年第 28卷第 23期 C hin H osp Pharm J , 2008 Dec , Vol 28 , No.23