全 文 ：第 26卷　第 1期
2008年 3月 　　　　
广西师范大学学报:自然科学版
Journal o f Guangxi No rmal Univ ersity: Na tura l Science Edition
　　　　　 Vol. 26　 No. 1
Ma r. 2008
收稿日期: 2007-04-28
基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 20665002) ;教育部科学研究重点资助项目 ( 206113);广西师范大学科学研究
重点资助项目
通讯联系人: 赵书林 ( 1957— ) ,男 ,湖南慈利人 ,广西师范大学教授 ,博士。 E-mail: zhao shulin001@ 163. com
罗汉果的毛细管电泳指纹图谱研究
胡　坤 ,赵书林 ,李舒婷 ,董　兰
(广西师范大学 化学化工学院 ,广西 桂林 541004)
摘　要: 采用毛细管电泳法 ,紫外检测波长 203 nm,运行电压 20 kV ,温度 20℃ ,以 60 mmo l /L硼砂和 40
mmo l /L硼酸 ( pH10. 5)的含有 13 mmol /L十二烷基硫酸钠 ( SDS)和 15%乙腈溶液为背景电解质进行指纹图
谱研究 ,建立了罗汉果的毛细管电泳指纹图谱 ( CEFP)。以槲皮素为内标 ,确定共有峰为 26个 ,并对不同批次、
不同品种和不同储存时间罗汉果的 CEFP进行了比较。该方法具有操作简单 ,稳定性及重现性好 ,可用于罗汉
果药材的质量控制。
关键词: 毛细管电泳 ;指纹图谱 ;罗汉果
中图分类号: O658　　　文献标识码: A　　　文章编号: 1001-6600( 2008) 01-0084-04
罗汉果 ( Siraitia grosvenorii )是广西特有药材 ,具有清热润肺、润肠通便的功能 ,可用于治疗呼吸和消
化等方面的疾病 [1 ]。罗汉果甜苷能抑制低密度脂蛋白的氧化作用 ,并且对糖尿病有辅助疗效 [2 ]。多年来人
们不断对罗汉果进行研究 ,对其主要成分罗汉果甙、黄酮及糖类 [ 3]进行提取分离 ,采用薄层色谱和高效液
相色谱 ( HPLC)对其含量进行测定 [4 ] ,并以此作为评价罗汉果药材质量的方法。 现代药理研究表明 ,中药
治疗疾病是依靠其各组分之间的协同作用 ,因此传统的评价方法受到了挑战。指纹图谱技术能够很好地反
映中草药的天然活性成分 ,而且能够反映它们之间的比率 ,是中药材质量控制的重要方法。 毛细管电泳技
术因其高效、快速、样品处理简单及试剂和样品用量少等特点而被应用于中草药的指纹图谱研究中 [5～ 7 ]。
本实验采用毛细管胶束电动色谱法 ,对广西永福和临桂产青皮罗汉果的水提取物进行指纹图谱研究 ,并比
较了不同批次、不同储存时间和不同品种之间的差异。
1　实验部分
1. 1　仪器、试剂及材料
HP3D型高效毛细管电泳仪 ( Agilent公司 ) ; 未涂层石英毛细管 65 cm× 50μm i. d. (河北永年锐沣色谱
器件有限公司 ) ,有效长度 56. 5 cm; PHS-4A型 pH计 (上海雷磁仪器厂 ) ; TGL-16G-A高速冷冻离心机
( 16 000 r /min,上海安亭科学仪器厂 )。
槲皮素 (中国药品生物制品检定所 ) ;十二烷基硫酸钠 ( SDS,上海化学试剂采购供应站 ) ;乙腈 (色谱
纯 ,上海化学试剂公司 )。其余试剂均为分析纯 ,所用水为石英高纯亚沸蒸馏水。
试验用罗汉果于 2005年 10月采自广西临桂县和永福县。
1. 2　样品溶液制备
1. 2. 1　对照品溶液的制备
精确称取对照品槲皮素 1. 2 mg,置于 10 mL容量瓶中 ,用 50%甲醇溶解并定容至刻度 ,超声 5 min后
用 0. 45μm滤膜过滤 ,滤液在 4℃下保存备用。
1. 2. 2　样品供试液的制备
　　取 2. 5 g干燥粉粹的罗汉果粉末 ,加 10倍量水 ,回流提取 3次 ,每次 2. 5 h,合并提取液 ,旋转蒸发至
约 8 mL,转入 10 mL容量瓶中 ,以水定容并摇匀。分取 200μL于 1. 5 mL离心管中 ,再加两倍量乙腈 ,震
DOI : 10. 16088 /j . i ssn. 1001 -6600. 2008. 01. 026
荡 2 min, 12 000 r /min离心 20 min,取上层清液用氮气吹干 , 200μL背景电解质溶液溶解 , 4°C保存。
1. 3　电泳条件
新毛细管依次用 1. 0 mol /L HCl溶液洗 30 min,水洗 10 min, 1. 0 mol /L NaOH溶液洗 30 min,水洗
10 min。每天开机使用时用 0. 1mol /L NaOH溶液洗 10 min,水洗 5 min,背景电解质溶液 ( BGE)洗 5min。
两次进样之间用水和 BGE各洗 2 min。紫外检测波长 203 nm ,运行电压 20 kV,温度 20℃ ,压力正极进样
10 s( 5 k Pa)。BGE为含有 13 mmol /L SDS和 15%乙腈的 60 mmol /L硼砂和 40 mmol /L硼酸 ( pH10. 5)溶
液。其电泳图见图 1。
2　结果与讨论
2. 1　电泳条件的优化
图 1　对照品、青皮果和红毛果的电泳图
Fig. 1　 Electr opherog ram o f standa rd substance and
Siraitia grosrenorii
2. 1. 1　缓冲溶液及添加剂对分离的影响
考察了以磷酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐为电泳缓冲剂时对分离的影响 ,结果发现其分离效果不是很好。在
上述各缓冲溶液中分别加入甲醇、乙腈等有机溶剂或 SDS时 ,分离效果仍然不满意 ,许多峰重叠。 在缓冲
溶液中同时加入乙腈和 SDS后 ,分离效果得到明显改善 ,经反复实验 ,确定以含有 60 mmol /L硼砂和
40 mmol /L硼酸缓冲体系并添加 15%乙腈和 13 mmol /L SDS为 BGE溶液时 ,可得到满意的分离效果。实
验还考察了 BGE的 pH值对分离的影响 ,表明在 pH 10. 5时分离效果最好。故选择 pH10. 5为 BGE溶液酸
度。
2. 1. 2　电压和温度的选择
考察了电压为 10～ 28 kV、温度在 18～ 25℃时 ,对分离效率的影响。 以既要有较短的迁移时间 ,又要
获得较好的分离度为原则 ,比较所得图谱得知 ,分离电压 20 kV,温度 20℃时 ,分离效果最好。
2. 2　样品提取方法及提取溶剂的选择
考察了常用提取方法: 回流、超声和索氏萃取 ;常用提取溶剂:乙醇、甲醇和水。 通过对其提取液进样
CE分析 ,结果表明以水作为溶剂对罗汉果进行回流提取 3次 ,每次 2. 5 h时 ,所得到的谱图中 ,峰的个数
和峰强度明显多于和大于其他提取方法和溶剂。故本实验采用回流提取方法 ,选用水作为提取溶剂。
2. 3　方法学考察
为了考察分析方法的可靠性 ,以永福样品 1
(青皮果 )为例 ,对其仪器精密度、稳定性、罗汉果
提取方法重现性进行考察。
2. 3. 1　精密度试验
取 1号样品供试液连续进样 5次 ,记录电泳
图 ,结果各指纹峰相对迁移时间的相对标准偏差
( RSD)均小于 4. 3% ,相对峰面积的 RSD不大于
5% ,表明测定的精密度良好。
2. 3. 2　稳定性试验
取 1号样品供试液 ,分别在制备样品后 0、 2、
6、 10、 24 h进样分析 5次 ,指纹图谱中各电泳峰
相对迁移时间的 RSD不大于 4. 5% ,相对峰面积
的 RSD除 18号峰为 9% , 14号峰为 6. 9%外 ,其
余均小于 5. 0% 。表明供试样品在 24 h之内基本
稳定。
2. 3. 3　提取方法的重现性试验
按照“ 1. 2. 2”方法提取制备 5份罗汉果供试
液 ,分别进样测定 ,记录电泳图 ,结果表明各峰相
对迁移时间的 RSD除 12号峰为 5. 8%外 ,其余
85第 1期　　　　　　　　　　　　　胡　坤等:罗汉果的毛细管电泳指纹图谱研究
均小于 5. 0% ,相对峰面积的 RSD除 1号峰为 13% , 15号峰为 10. 2% , 16号峰为 6. 5%外 ,其余均小于
5% ,可以看出提取方法的重现性满足指纹图谱要求。
2. 4　系统适用性试验和参照物峰的定性
将槲皮素对照品溶液和罗汉果供试液分别在毛细管电泳仪上分离测定 ,得到毛细管电泳图见图 1,通
过比较迁移时间可知第 3号峰为槲皮素 ,计算得理论塔板数 n为 39 698,拖尾因子 T为 0. 96。在供试液中
加入对照品溶液后再进样分析 ,所得的电泳图中仅第 3号峰的峰高和面积增大 ,其他峰基本没有变化 ,表
明该峰确为槲皮素峰 ,并且其与相邻峰分离良好 ,分离度 R为 3. 13,故可以选作参照峰。
2. 5　罗汉果 (青皮果 )毛细管电泳指纹图谱 (CEFP)的建立及共有峰的确定
将 11批罗汉果药材在相同的条件下提取 ,在毛细管电泳仪上各进样分析 2次 ,记录电泳图 ,共考察了
65 min,发现在 55 min后没有色谱峰出现。通过对 11个批次的罗汉果 CEFP进行比较 ,以各峰的共有率 f i
≥ 70%作为选择 CE指纹峰的依据 ,确定罗汉果的共有峰为 26个 [6 ]。将 11批次的罗汉果分别取 10 g混合
均匀 ,然后按照“ 1. 2. 2”方法提取制备供试液 ,进样分析 ,所得的电泳图谱作为罗汉果 (青皮果 )毛细管电泳
对照指纹图谱 (见图 1b)。以迁移时间和相对迁移时间 (与对照峰比较 )、峰面积和相对峰面积 (与对照峰比
较 )标定罗汉果的 CEFP(见表 1)。
表 1　罗汉果的对照 CEFP指纹峰数据
Tab. 1　 Data of f ingerprints in standard CEFP of Sirait ia grosvenorii
峰编号 t /min A /( m AU· min) tR AR 峰编号 t /min A /( m AU· min) tR AR
1 11. 37 41. 9 0. 91 0. 16 14 27. 65 51. 1 2. 20 0. 58
2 11. 97 35. 1 0. 95 0. 13 15 29. 65 210. 1 2. 36 0. 81
3 12. 55 261. 0 1. 00 1. 00 16 31. 61 58. 8 2. 52 0. 23
4 18. 81 124. 1 1. 50 0. 48 17 32. 33 139. 5 2. 58 0. 53
5 20. 12 56. 5 1. 60 0. 22 18 33. 17 124. 1 2. 64 0. 48
6 21. 96 78. 4 1. 75 0. 30 19 33. 81 95. 2 2. 69 0. 37
7 22. 86 121. 5 1. 82 0. 47 20 36. 02 107. 1 2. 87 0. 41
8 23. 19 43. 6 1. 85 0. 17 21 38. 51 97. 9 3. 07 0. 38
9 23. 50 30. 7 1. 87 0. 12 22 42. 19 205. 3 3. 36 0. 79
10 24. 12 97. 8 1. 92 0. 38 23 43. 57 112. 9 3. 47 0. 43
11 25. 43 71. 1 2. 03 0. 27 24 45. 62 153. 2 3. 64 0. 59
12 26. 54 39. 3 2. 11 0. 15 25 47. 51 612. 4 3. 79 2. 35
13 27. 14 50. 1 2. 16 0. 19 26 52. 31 168. 8 4. 17 0. 65
2. 6　不同批次罗汉果 CEFP比较结果
表 2　 11批次罗汉果药材的相似度评价
Tab. 2　 Similarit ies between each set of CEFP of
eleven batch Sirait ia grosvenorii
批次 产地 相似度
1 广西永福 0. 915
2 广西永福 0. 924
3 广西永福 0. 953
4 广西临桂 0. 948
5 广西临桂 0. 982
6 广西永福 0. 987
7 广西永福 0. 907
8 广西永福 0. 954
9 广西临桂 0. 991
10 广西临桂 0. 956
11 广西桂林 0. 963
　　对 2005年 10月采集的 11个批次的罗汉果提取液
进行分析 ,记录电泳图。以相对峰面积为指标 ,获得各产
地罗汉果的特征指纹向量 Pi= ( y1 , y2 ,… , y14 ) ,按照式
( 1)计算不同批次罗汉果指纹图谱与对照指纹图谱的相
似度 ( S) ,结果见表 2,从表中结果可知其相似度均大于
0. 900,说明不同批次罗汉果在化学成分的分布上是十分
相似的。
S =
∑n
i= 1
xi yi
∑n
i= 1
(xi )
2 ∑n
i= 1
(yi )
2
( 1)
2. 7　储存时间的影响
本文考察了 5个批次罗汉果在干燥、通风条件下储存一年的稳定性变化情况。分别电泳分析后 ,按照
式 ( 1)计算其相似度 (见表 3) ,结果表明两者之间具有较好的相似度 ,说明罗汉果药材在上述条件下储存
一年是稳定的。
2. 8　罗汉果不同品种之间的比较
　　罗汉果的主要品种有青皮果和红毛果 ,本文在相同条件下对其提取并进样分析 ,通过对比两者指纹图
86 广西师范大学学报:自然科学版　　　　　　　　　　　　　　　　第 26卷
谱可以发现 ,两者在化学成分的分布上具有较好的相似性。
本文根据文献 [7]提出的方法 ,以青皮果指纹图谱为对照图
谱 ,计算了两者之间化学成分含量的相似度 (Q)及 CEFP
中各峰总积分面积的百分比 ( R ) ,结果表明红毛果的对应
峰和总峰面积均小于青皮果 , Q= 0. 708,R= 0. 655。
表 3　 5批次储存一年样品的相似度
Tab. 3　 Simil arities of 5 sampl es in 1-year store
储存时
间 /a
相似度
1 2 3 4 5
0 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000
1 0. 985 0. 992 0. 976 0. 966 1. 000
3　结论
本文选择硼酸盐体系作为电泳缓冲溶液 ,主要是由于罗汉果主成分是一些含羟基的甙类化合物 ,此类
化合物在碱性条件可以与硼酸根离子形成荷电性质差异较大的络合物 ,从而可以较好的分离 [9 ]。样品提取
液采用乙腈除去蛋白质和一些鞣酸类化合物 ,减少对毛细管壁的吸附 ,提高重现性。所得到的指纹图谱清
晰明了 ,方法的精密度、稳定性和重现性均符合指纹图谱要求 ,为罗汉果药材质量的科学评价及不同品种
的鉴别提供了可借鉴的依据。
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Fingerprint of Siraitia grosvenorii by Capillary Electrophoresis
HU Kun, ZHAO Shu-l in, LI Shu-ting, DONGLan
( Colleg e of Ch emistr y and Chemica l Eng ineering , Guangxi Normal Univ ersity , Guilin 541004, China )
Abstract: The capillary elect ropho resis fing erprint ( CEFP) of Siraitia grosvenorii was established to evaluate
Siraitia Grosvenorii quality , with the detection w aveleng th of 203 nm , applied voltage of 20 kV and detection
temperature of 20℃ . The 60 mmol /L sodium borate solution and 40 mmol /L boric acid solution ( adjusted to
pH 10. 5) containing 13 mmol /L sodium dodecy l sulpha te ( SDS) and 15% acetonit rile were used as
backg round electroly te ( BGE) . 26 co-possessing peaks were selected as the fing erprints of Siraitia grosvenorii ,
and the quercetin was selected as the reference peak. The method presented has good precision, repetition and
stabili ty , which can be used for the quali ty monito ring of Siraitia grosvenorii medicine.
Key words: capillary elect rophoresis; fingerprints; Sirait ia grosvenorii
(责任编辑　王龙杰 )
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